孔径均匀的离子交换树脂制备方法及在植物多糖脱色中的应用（可编辑）

孔径均匀的离子交换树脂制备方法及在植物多糖脱色中的应用（可编辑） 】‘ 学校代码: 中图分类号: : 密级: 公开 高媳夫港 博/硕士学位论文 孔径均匀的离子交换树脂制备方法及在植物多糖脱色中的应用 一? ‘,? ? 南开大学研究生院 二。一。年五月胛 舢 肌 肌 四 删 删? 舢 南开大学学位论文使用书 根据《南开大学关于研究生学位论文收藏和利用管理办法》,我 校的博士、硕士学位获 得者均须向南开大学提交本人的学位论文纸质本及相应电子版。 本人完全了解南开大学有关研究生学位论文收藏和利用的管理 规定。南开大学拥有在 《著作权法》规定范围内的学位论文使用权,即:学位获得者必须按规定提交学位论文包 括纸质印刷本及电子版,学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生学位论文, 并编入《南开大学博硕士学位论文全文数据库》:为教学和科研目的,学校可以将公开 的学位论文作为资料在图书馆等场所提供校内师生阅读,在校园网上提供论文目录检索、文 摘以及论文全文浏览、下载等免费信息服务:根据教育部有关规定,南开大学向教育部 指定单位提交公开的学位论文;学位论文作者授权学校向中国科技信息研究所和中国学 术期刊光盘电子出版社提交规定范围的学位论文及其电子版并收入相应学位论文数据库, 通过其相关网站对外进行信息服务。同时本人保留在其他媒体发表论文的权利。 非公开学位论文,保密期限内不向外提交和提供服务,解密后提交和服务同公开论文。 论文电子版提交至校图书馆网站:://...:/.。 本人承诺:本人的学位论文是在南开大学学习期间创作完成的作品,并己通过论文答辩; 提交的学位论文电子版与纸质本论文的内容一致,如因不同造成 不良后果由本人自负。 本人同意遵守上述规定。本授权书签署一式两份,由研究生院和图书馆留存。 作者暨授权人签字: 王注 年月日 南开大学研究生学位论文作者信息 论文题目 孔径均匀的离子交换树脂制备方法及在植物多糖脱色中的应用 姓名 王洋 学号 答辩日期 年月日 论文类别 博士口 学历硕士囹 硕士专业学位口 高校教师口 同等学力硕士口 专 业 院/系/所 化学学院 高分子化学与物理 . 通信地址邮编:南开大学蒙民伟楼 备注: 是否批准为非公开论文 注:本授权书适用我校授予的所有博士、硕士的学位论文。由作者填写一式两份签字后交校图书 馆,非公开学位论文须附《南开大学研究生申请非公开学位论文审批表》。南开大学学位论文使用授权书 根据《南开大学关于研究生学位论文收藏和利用管理办法》,我校的博士、硕士学位获 得者均须向南开大学提交本人的学位论文纸质本及相应电子版。 本人完全了解南开大学有关研究生学位论文收藏和利用的管理规定。南开大学拥有在 《著作权法》规定范围内的学位论文使用权,即:学位获得者必须按规定提交学位论文包 括纸质印刷本及电子版,学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生学位论文. 并编入《南开大学博硕士学位论文全文数据库》:为教学和科研目的.学校可以将公开 的学位论文作为资料在图书馆等场所提供校内师生阅读。在校园网上提供论文目录检索、文 摘以及论文全文浏览、下载等免费信息服务;根据教育部有关规定,南开大学向教育部 指定单位提交公开的学位论文;学位论文作者授权学校向中国科技信息研究所和中国学 术期刊光盘电子出版社提交规定范围的学位论文及其电子版并收入相应学位论文数据库. 通过其相关网站对外进行信息服务。同时本人保留在其他媒体发表论文的权利。 非公开学位论文,保密期限内不向外提交和提供服务,解密后提 交和服务同公开论文。 论文电子版提交至校图书馆网站:://...:/.。 本人承诺:本人的学位论文是在南开大学学习期间创作完成的作品,并已通过论文答辩; 提交的学位论文电子版与纸质本论文的内容~致,如因不同造成不良后果由本人自负。 本人同意遵守上述规定。本授权书签署一式两份,由研究生院和图书馆留存。 彳屯 作者暨授权人签字:圭兰 , ‘ 如年占月日 南开大学研究生学位论文作者信息 论文题目 黼细 蝴匀饰鸟潋嬲韬椭南孩碰旌物绷 姓名 学号 答辩日期 / 年专月衫日 卫汕啦 论文类别 博士口 学历硕士彳硕士专业学位口 高校教师口 同等学力硕士口 院/系/所 业 专 傅旁彩 粥槲与铂硬 . ?,? 砧口卯弦 呦阿棚《乙么石嘞础彻缸施.‖ 一 通信地址邮编:磁昂卫藿铭鸺 备注: 是否批准为非公开论文 冶 注:本授权书适用我校授予的所有博士、硕士的学位论文。由作者填写一式两份签字后交校图书 馆,非公开学位论文须附《南开大学研究生申请非公开学位论文审批表》。南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师指导下进行研究工作所取得 的研究成果。除文中已经注明引用的内容外,本学位论文的研究成果不包含任何他 人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所涉及的研究工 作做出贡献的其他个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声 明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名: 年 月 日 王注 非公开学位论文标注说明 根据南开大学有关规定,非公开学位论文须经指导教师同意、作 者本人申请和 相关部门批准方能标注。未经批准的均为公开学位论文,公开学 位论文本说明为空 白。 孔径均匀的离子交换树脂制备方法及在植物多糖脱色中的 论文题目 应用 口秘密?年 口机密?年 口限制?年 申请密级 保密期限 年 月 日至 年 月 日 批准日期 年 月 日 审批表编号 限制?年最长年,可少于年 秘密?年最长年,可少于年 机密?年最长年,可少于年摘要 摘要 多糖是一类广泛存在于高等植物、真菌、藻类、细菌和动物细胞膜上的生 物大分子,是构成生命的四大基本物质之一。植物多糖在抗肿瘤、抗衰老、抗 病毒、抗炎及提高免疫功能等方面的药理作用被加以证实。色素的存在不仅影 响多糖色泽,同时影响多糖的纯度,从而影响其生物活性,也阻碍了对多糖的组 成及结构与其生物活性关系的理论研究。因此,多糖的脱色对于现代中药的标 准定量及研究该组分的药理药效,对于将多糖用于开展临床应用研究及下一步 其他组分的分离,具有重要的意义。 多糖是一种基本呈中性的弱极性高分子物质,而色素一般具有多酚的负离 子结构,因此带有阴离子交换基团的离子交换树脂可选择性的吸附色素分子, 但是传统的阴离子交换树脂在使用中存在着明显的缺陷,如对色素的吸附容量 较低,树脂孔径较大且不均匀,造成大分子的多糖可以进到树脂孔中难以洗脱, 脱色后多糖的收率较低,这就需要我们合成一类具有高的功 能基含量、高 度交联且孔径小而均匀的特殊孔结构的离子交换树脂,这些结构特点在传统的 合成过程中难以同时满足。为此,我们改变了以非良溶剂致孔合成大孔树脂的 传统致孔方法,创新性的利用低交联聚苯乙烯骨架的后交联反应,使得树脂的 交联反应和功能基化反应同时发生,避免了在高交联骨架上难以进行功能基化 反应的局限,同时,由于树脂的孔是由后交联试剂与聚苯乙烯链间形成的交联 网络结构的网孔,因此孔径相对均匀且平均孔径较小,此时大分子多糖难以扩 散进入树脂孔中,大大改善了树脂对多糖的保留情况。 实验结果表明,以初始交联度为%的氯甲基化聚苯乙烯为初始聚合物,以 三乙烯四胺为后交联功能试剂,合成了带有高含量碱性胺基的、孔径均匀的新 型离子交换树脂,将其用于香菇多糖中色素的去除。考察了树脂的初始交联度、 反离子类型、吸附溶液的值、吸附温度、吸附速率、交换柱的长径比等对树 脂脱色效果和多糖保留能力的影响,优化了脱色工艺的操作条件, 在最优化的 条件下,脱色率达到%以上,且多糖的收率高于%。 关键词。阴离子交换树脂香菇多糖脱色后交联. ,, . ,?,, . . , 血 ., .【..、析 , ., , . ., ., , , ,. . , . , 、析 ?????????????????????一。?????? ...??.?............??.....................?二兰兰 竖............................?..?......一. , , .,, %% ., ,, : 目录 目录 摘 兽..........?...........?.................................. ................................................??..?...... ?..?.?.?.?.?....?.?..?.?..?.. 目录?.. 第一章前言 .多糖的基本理化性质及生理活性?. ..多糖的生物活性 ..多糖的来源和分类?. ..多糖的结构与生物活性的关系 .多糖提取方法简介? ..多糖粗提方法简介..多糖的分离。 .多糖的纯化方法 ..活性炭法??. ..过氧化氢氧化法 ..树脂法??。 .课题的提出及实验设想..课题的提出? ..实验设想第二章孔径均匀、可控的离子交换树脂的制备? .树脂的合成及其表征 ..试验部分??. ..树脂的表征?.. ..树脂的预处理 ..脱色反应. ..主要仪器和试剂..树脂脱色方法的建立. 目录 ..提取效果的表征 第三章阴离子交换树脂的调控及对香菇多糖的脱色. .引言? .实验和设备 .实验方法 ..树脂的预处理. ..上柱液的制备 .树脂的种类及其筛选. .反离子的性质对多糖产率以及脱色效果的影响? .离子交换树脂功能基对多糖产率以及脱色效果的影响? .离子交换树脂交联度的差异对多糖产率以及脱色效果的影响? .离子交换树脂致孔剂含量的差异对多糖产率以及脱色效果的影 响.兼具高交联度和高功能基含量的离子交换树脂剂的合成及脱色性 能研究?:;; ..树脂合成方法 ..树脂初始交联度对其脱色性能的影响??.. . 本章小结??. 第四章操作条件对香菇多糖脱色效果的影响.引言? .实验材料和设备??。 .上柱液值对香菇多糖脱色效果及其产率的影响.温度对香菇多糖脱色效果及其产率的影响 .上柱液的流速对香菇多糖脱色效果及其产率的影响.离子交换柱的柱径比对香菇多糖脱色效果及其产率的影响.本章小结 第五章全文结论. 参考文献?.. 目录 ???????????????????????????????????????????????????一 致谢?第一章前言 第一章 前言 .多糖的基本理化性质及生理活性 多糖是一类广泛存在于高等植物、真菌、藻类、细菌和动物细胞膜上的生 物大分子,是构成生命的四大基本物质之一。随着传统中药的多糖成分被分离 和纯化,广大专家和学者们对它们的化学结构、理化性质、药理功能以及作用 机制进行了深入并且广泛的研究。 近年来,随着国内外的专家对植物多糖的研究越来越深入,逐渐发现多糖 不仅具有许多方面的生物活性,而且低毒甚至无毒,一系列从植物中提取出的 多糖成为了化学界和医学界的热门研究对象。多糖因其具有多种药理作用而越 来越引起人们的关注。植物多糖在抗肿瘤、抗衰老、抗病毒、抗炎及提高免疫 功能等方面的药理作用被加以证实。长期以来,多糖在研究中常被当作杂质而 除去,将多糖作为药物始于年【。植物源的多糖类化合物由于它们的独特 功能和很低的毒性,在临床应用中显示出越来越广阔的前景,主要体现在以下 几方面。 ..多糖的生物活性 .免疫调节的作用 植物多糖最重要的药理作用为免疫促进作用。从防风水提液中得到两种酸 性杂糖。能显著提高小鼠脾脏淋巴细胞的增殖,因而有显著增强机体免疫功能 的作用。黄芪多糖可显著提高小鼠抗体形成细胞的数量,牛膝多糖具有明显的 增强机体免疫功能作用【】。 .抗病毒作用 研究发现红藻中红藻多糖具有开发药物的前景。杜仲碱被认为含有多 糖类,具有抗破坏人体免疫系统病毒的功能,有可能用于治疗和预防艾滋病。 现已证实香菇中含有一种干扰素诱导剂,能干扰病毒蛋白质的合成,提高抗病 毒免疫力【。胞分化与凋亡,影响肿瘤细胞超微结构而发挥直接的抗肿瘤作用”。 .抗氧化作用 目前已发现多种植物和真菌多糖具有体内外的抗氧化作用。木耳多糖、天 门冬多糖等具有体外直接清除活性氧的作用】。螺旋藻多糖、黄精多糖可提高 。 生物体内超氧化物歧化酶的活力,对活性氧产生的伤害有明显的改善作用【 多糖除了上述作用外,还有许多其它的生物活性,如降血糖作用,王雪松 等概括了具有降血糖作用的植物多糖【】,涉及到几十种多糖。降血脂活性:海带 多糖、褐藻多糖、甘蔗多糖等均有降血脂活性。有些多糖还具有抗菌活性,如 黄茂多糖能显著抑制结核分枝杆菌,中华弥猴桃多糖对大肠埃希菌有抑制作用。 此外,多糖还有抗凝血、抗氧化、消炎、抗辐射和抗呕吐等生物活性。 多糖如此有用的生理活性使其成为近年来研究的热点。到目前为止,从天 然植物中提取分离多糖仍然是临床使用制剂中多糖的主要来源,多糖制备过程 中的两个主要工序一提取、脱色直接影响提取产品的质量和色泽。因此,寻找 合适的提取、脱色工艺条件是提高多糖质量的关键。 ..多糖的来源和分类 .多糖的来源 多糖在自然界中既蕴藏丰富,又种类繁多。多糖作为一类当前热门的研究 开发方向,除了普遍具有抗肿瘤【、抗氧化【?】、降血脂【、抗凝血【、降血 糖等多种生物活性之外,不同种类的多糖又具有着各自不同并且 不可替代的药 用价值。目前,人们己从天然产物中成功分离出余种多糖类化合物【。按来 源不同,多糖可分为真菌多糖、高等植物多糖、藻类地衣多糖、动物多糖和细 第一章前言 菌类多糖五大类”】。其中,植物多糖的研究最为广泛。我国近十年来对多种 多糖进行了研究,其中种是高等植物多糖,占%,其中,绝大部分是中草药。 其优势就在于在各自具有各方面较强药用效果的前提之下对人的身体无毒无 害,并且环境友好,这已经使植物多糖成为当今新药的发展方向之一。 .多糖的分类 植物中的复合多糖有多种分类方法,?依传统习惯可以分为:细胞内贮存 多糖、果胶类物质、半纤维素、树胶和粘胶【】。?按其在生物体内的功能可分 为两类:一类是非水溶性的多糖,如植物中的纤维素;另一类是可溶于热水或 胶性溶液的多糖,经酶或酸催化水解可生成寡糖或单糖以供应能 量【】。?根据 在植物体中存在部位的不同,多糖还可分为:细胞内多糖、细胞壁多糖和细胞 外多糖博。 ..多糖的结构与生物活性的关系 多糖与蛋白质和核酸相比,结构复杂得多,糖复杂的结构使其携带了大量 的信息,多糖广泛存在于生命体中,参与了生命的几乎全部过程,因而了解多 糖结构与功能关系是多糖研究的核心问题,也是揭开多糖神秘面纱的关键步骤。 近几十年来,大量研究表明,多糖具有多种生物活性:抗肿瘤,抗病毒,免疫 调节功能,抗凝血,抗氧化,降血糖血脂,抗衰老,消炎、抗辐射和抗呕吐等 功能。多糖之所以具有这些功能,这与它们具有独特的结构是密不可分的。如 能从多糖的结构出发,解释结构与生物活性之间的必然联系,对增进对多糖的 认识、开发出具有高效的多糖药物具有深远的意义。然而,到目前为止,尽管 科学工作者们对多糖进行了大量卓有成效的研究,但对于多糖的 构效关系还不 是非常明朗,很多结论都是根据和猜测,并且对多糖的构效关系的解释出 现了许多不同的论述,没有形成一个有规律和总结性的科学结论。概括来说, 多糖的生物活性主要与多糖的分子量,单糖组成,糖甙键的构型,取代基和高 级结构有关。 ...多糖的一级结构与生物活性的关系 .多糖单糖组成、糖甙键的类型与生物活性的关系 多糖的种类是由主链糖单元的组成决定的,多糖的种类与其生物活性息息 相关。根据主链糖单元的组成,多糖可分为同多糖和杂多糖。抗肿瘤多糖结构 皇第一章前言 研究表明,从菌体中提取的活性多糖一般由葡萄糖组成,而且葡萄糖的链上的 .?糖苷键和支链上的.?糖苷键是抗肿瘤所必需的。如从香菇中提取 到的抗肿瘤多糖,也由.?结合的直链葡聚糖构成,每个分子上有个分子 的比率,在位有结合的侧链,葡萄糖分子在单糖的连接位置方面, 具有一 连接方式的多糖大多具有生物活性,部分?连接方式的多糖也具有生物活 性,而?连接、?等方式连接的多糖很少具有活性。从猪苓菌种的 菌体中分离得到多种多糖级分,其抗肿瘤活性部分是带?支链的? .葡聚糖。单糖的组成对多糖活性的影响远远小于糖苷键型和单糖连接方式。 通常,具有不同化学结构的单糖组成的多糖可具有免疫调节活性,这表明免疫 应答对单糖的化学结构是非特异性的,它主要由分子大小决定而不是单糖的化 学结构。 .侧链基团与生物活性的关系 多糖的生物活性与其含有哪些化学基团有着重要的联系,我们知道,通过 人为的修饰可以在分子上添加或者消除很多功能基团,这就大大的方便了我们 对于多糖的研究与应用,多糖的结构修饰已经成为提高多糖的活性和研究多糖 构效关系的有力手段。比如,将多糖进行衍生化,如降解、硫酸化、磺酰化、 乙酰化、烷基化等,有可能大大提高多糖的生物活性,经分离后十 分有利于我 们对含有化学基团的多糖进行分类研究,对我们探讨侧链基团与生物活性的关 系有很大的帮助。其他修饰方法,如磷酸脂化、硬脂酰化、棕榈酰化、二乙基 氨基乙基化、碘化、氨化等在多糖分子修饰中也有着越来越多的运用。 .分支度与生物活性的关系 与侧链基团与生物活性之间的关系类似,支链对多糖活性的影响也是非常 之大,主要与分支度和支链结构有关,多糖分支度与其生物活性之间的关系并 无可以表达,从经验来看,分支度适中的多糖往往具有较高的活性,而分 支度过高或过低的多糖其活性都有限。活性很强的裂褶菌多糖和香菇多糖仅在 上有分支,分支度为.。来自担子菌类的隐孔菌多糖,分支度为.,对肉 瘤的抑制率是裂褶菌多糖的%。对几十种葡聚糖的分支度与其抗肿 瘤活性进行了比较,认为分支度在...的.?多聚糖,具有更高的 生物活性。有时引入支链也可改变多糖生物活性。据此推断,分 支度大小与多 糖生物活性之间有着重要的联系。 ??????????????????????????????????????????????????????? ????????????????一 第一章前言 ...高级结构与生物活性的关系 对多糖生物活性与其化学结构之间关系的研究发现,除了多糖的生物活性 除了与其,分支度,所含官能团,以及单糖的组成类型有关之外,还与多糖分 子的空间构象有着千丝万缕的联系。虽然多糖的空间构象与其生物活性的关系 至今还不能够十分清楚明白的表达出来,但二级或三级结构比一级结构在活性 方面起更大的决定作用的观点则已经被众多学者所认可。射线衍射分析表明, 大部分具有抗肿瘤活性的较大分子量的多糖具有三股螺旋型立体构型。比如 在本来具有抗肿瘤活性的香菇多糖中加入尿素或二甲亚砜,使分子的立体构型 发生改变,其活性就会丧失。又如茯苓多糖链与香菇多糖极其相似,但也许是 由于高级结构的原因,并无抗肿瘤活性,若通过高碘酸氧化,然后降解后 去除其侧链,就会得到具有抗肿瘤活性的多糖,射线衍射分析发现此时多糖的 高级结构已经发生变化,生成了具有三股螺旋型立体构型的多糖。张丽萍等 人研究发现金顶侧耳多糖在水中为无规线团构象,经硫酸酯化后,无规线团呈 伸展状态,局部可能形成螺旋,因而使硫酸酯化金顶侧耳多糖抗病毒活性提 高。但是,上述说法对于较小分子量的多糖似乎难以成立,有一些多糖具有较 小的分子量,不能形成螺旋结构却也具有较好的活性,如从辣椒疫霉菌分离得 到的葡聚糖,平均分子量小于,在溶液中为无序结构,但却表现出很强的 抗肿瘤活性。 ...理化性质与生物活性的关系 .水溶性与生物活性的关系 前面已经说过,多糖的侧链基团与其生物活性密切相关,对于具有螺旋结 构的多糖来说,一方面侧链可以使螺旋结构更加稳定,另一方面 分布于螺旋结 构周围的亲水基对于维持多糖的生物活性是极其重要的。水溶性.葡聚糖有抗 肿瘤活性,无过长支链,不易被人体内.葡聚糖酶很快水解,而水不溶性多糖 大多无活性,可能与它们有过长的支链,易被酶解有很大关系。将.?葡聚 糖侧链上的葡萄糖基转化成,.脱轻羟基衍生物,则其抑制肿瘤活性消失,而 将.?葡聚糖支链糖基转化成多元醇,可提高其活力,这个实验说明提高水 溶性就会增强多糖的生物活性。通过硫酸化、磺酰化、磷酸化或羧甲基化等化 学修饰方法同样可以提高多糖的水溶性。如.?..葡聚糖不溶于水,如果 将它部分羧甲基化,使其水溶性提高,则它的抗肿瘤活性也明显提高。此外, 第一章前言 采用酸碱水解、酶解及超声降解等方法降低多糖分子质量,也可以提高其分子 水溶性,同时,也提高了分子的生物活性。 .分子质量与生物活性的关系 多糖的生物活性很大程度上取决于其分子量或者大小。等研究发 现,具有合适的相对分子质量是多糖具有生物活性的必要条件,这可能同多糖 分子形成的高级构型有关。其中相对分子质量在.之间的多糖活性最 强,同时研究中发现,来源与上述多糖相同并且结构具有类似性的相对分子质 量范围为.的多糖都不具备生物活性,由此推断相对分子质量的大小对于 其生物活性有着非常重要的影响。 .多糖提取方法简介 ..多糖粗提方法简介 多糖的提取通常要根据多糖的存在形式及提取部位不同,决定在提取之前 是否作预处理,对于含脂高的原料,一般先采用丙酮、乙醚、乙醇等进行脱脂 预处理。 多糖的溶解性能是多糖提取的重要依据之一。一般来讲多糖都是水溶性较 好。最常用也最简单的多糖提取方法是热水浸提法,但为了提高多糖的提取产 率,研究中不断出现了一些新的提取方法,例如酸浸提法、碱浸提 法、超声波 提取,微波提取,超临界萃取法以及酶提取法等【,前三种为化学方法,超 声波提取,微波提取以及超临界萃取法为物理方法结合生物方法,酶提取法 为生物方法。 ...热水浸提法 热水浸提法是多糖提取的传统方法,用水作为溶剂浸提多糖,温度一般控 制在?~?,恒温提取~小时,浓缩滤液,然后加入相当于浓缩液? 倍体积的乙醇,使多糖呈絮状析出,滤出沉淀用丙酮或乙醚洗涤脱水,最后进 行真空干燥或直接冷冻干燥得到粗多糖。 第一章前言 ...使用不同溶剂进行提取 受传统的热水浸提法启发,为了提高多糖提取的效率极其选择性,出现了 采用各种酸、碱、盐溶液提取多糖的研究的例子。张俐娜【等利用.%水 溶液,%乙醇,热水,%草酸铵,%/.%和%/%尿素 分别提取出四种杂多糖和两种葡聚糖。薛巧如【】等采的溶液提取 得到了杜氏藻多糖,但由于酸浸提法和碱浸提法很容易引起糖降解及糖苷键的 断裂,进而破坏多糖的活性结构,使其在应用上受到了一定的限制。 ...超声波提取以及微波提取 微波提取技术是利用微波辐射使药材细胞组织吸收微波能,温度迅速上升, 细胞膨胀破裂,有利于提取药材的有效成分【纠。由于微波的作用,药材中有效 成分浸出扩散加快,提高了效率。微波提取技术具有选择性高,对有效成分破 坏小,提取效率高,溶剂少,能耗低,无污染,兼有杀菌作用,设备廉价等优 点。陈晓青等利用微波辅助提取多糖【,同传统方法相比,大大缩短了提取时 间。 超声波在媒质中传播可使媒质质点在其传播空间内进入振动状态强化溶质 扩散、传质,其能量不断被媒质质点吸收变成热能,导致媒质质点温度升高, 同时当大能量的超声波作用于提取介质,在振动处于稀疏状态时,介质被撕裂 成许多小空穴,这些小空穴瞬时即闭合,闭合时产生高达几千大气压的瞬时压 力,空化中产生的极大压力造成被破碎物细胞壁及整个生物体破裂,而且整个 破裂过程在瞬间完成,同时超声波产生的振动作用加强了胞内物质的释放、扩 散及溶解。提高了破碎速度,缩短了破碎时间,可极大地提高提取效率。王亚 飞【、念保义【】等采用超声技术辅助提取香菇多糖。考察了提取时间、温度、 提取次数、料液比等因素对提取率的影响,结果表明,超声提取能提高多糖的 得率和缩短提取时间。张梅等【?】采用超声技术辅助提取菌核侧耳菌多糖,所 得到的多糖分子量大于采用水提多糖分子量,而水提多糖却比超声提取多糖更 好的抗肿瘤活性。 ...超临界萃取 王大为等利用超临界萃取对蒙古口蘑多糖进行脱色,并且对实验条件进 行优化,最后萃取率为.%。较单纯的溶剂提取有了较大的提高。 第一章前言 超临界流体萃取是利用超临界流体作为萃取剂从混合物中提取某种 组分的分离提取技术,操作方便,安全性高,选择性好,脂类物质溶出率高, 并兼有脱色脱异杂味作用,且萃取剂无毒无残留,萃取物纯度高,被萃取物再 利 用性强,并且还可以可提高多糖的提取率。 ...酶水解法 由于其独特的优势,酶水解法最近已经引起了中药现代化研究者的广泛关 注,与单纯热水浸提法相比,酶法辅助提取多糖会大大提高提取的效率。张欣【】 等采用复合酶从香菇柄中提取香菇多糖,提取得率是热水浸提法的倍多。酶法 辅助提取虽然效率高,分离效果好,但操作比较复杂,提取设备要求较高,工 艺不易掌握并且提取成本高。至少在当前的阶段,难以于大规模工业化生产中 实现普遍应用。 而热水浸提法虽然提取时间长效率低,但其提取成本低,适用于游离态植 物多糖的提取,且干扰物质少或易除去,因而水浸提法提取植物多糖还是众多 研究者常采用的方法之一。 ..多糖的分离 多糖经溶剂浸提后,将溶液直接进行浓缩干燥,很难得到干燥的多糖固体, 得到的是粘稠浸膏状的产品。由于植物中杂质太多,其性质比较复杂,很难用 一种方法将杂质全部除去,因此,根据多糖能溶解于水而不溶于醇的性质一般 在粗提时常采用水提醇沉的方法。由于多糖类化合物难溶于有机溶剂,采用水 提醇沉的方法在将多糖从水溶液中分离出来的同时,可以将一些小分子物质予 以分离。采用醇沉分离多糖的方法虽然简单,但消耗乙醇的量比较大,造成多 糖的生产成本高。有专利报道采用聚乙二醇代替乙醇进行多糖的分离【,能显 著降低多糖的生产成本。 ? 一般来讲水提醇沉操作步骤如下,先将植物粉碎过筛,用工业酒精在 回流.次,每次 ,离心去除上清液,沉淀在 ?真空干燥,得到了去除掉 部分单糖、低聚糖和酚类化合物的植物粉末,加水于适当温度提取,过滤,残 渣再提一次, 合并滤液, 减压浓缩, 将浓缩液醇沉,过夜,离心后沉淀依次 用无水乙醇及丙酮洗涤,即得粗多糖。 第一章前言 .多糖的纯化方法 经粗提后得到的粗品多糖提取物,其组成为多糖、单糖及小分子寡聚糖、 色素、鞣性杂质等。需要进一步纯化处理。色素的存在不仅影响多糖色泽,同 时影响多糖的纯度,从而影响其生物活性,也阻碍了对多糖的组成及结构与其 生物活性关系的理论研究。粗多糖的进一步纯化常用活性炭吸附法、过氧化氢 氧化法、以及树脂法。 ..活性炭法 活性炭为黑色细微粉末,无臭、无味,具有无毒和脱色、脱臭效果良好的 特点,可以反复使用,成本低,适合工业化生产的需要。粉末活性 炭具有惊人 的比表面积~/,当被脱除的有色物质的分子直径小于或等于活性 炭孔的入口直径时,可被活性炭吸附而起到脱色的效果。活性炭吸附脱色是 多糖脱色的经典技术,应用广泛,操作简单,有些已成功用于工业化生产。并 且实验和生产中通过改变活性炭的用量,吸附时间,脱色时的值以及脱色温 度等条件来优化活性炭的脱色工艺合成一类高比表面积、高功能基含量的、孔 径均匀可控的丙烯酸系吸附树脂.从而使活性炭的脱色效率提高、速度变快、成 本降低,也可降低吸附过程中多糖的损失。但目前为止,活性炭脱色工艺仍然 存在一些问题, 如植物来源的多糖,可能含有酚型化合物而颜色较深,这类色 素大多呈负性离子,不能用活性炭吸附剂脱色。加上活性炭再生困难、多糖的 损失率很高,以及从液体中脱除活性炭粉末比较困难等弊端??。 ..过氧化氢氧化法 对于植物来源的多糖,常含有酚类、羟基蒽醌衍生物等,这类色素 大多呈 负性离子,用活性炭脱色的效果不好;还有一些与糖结合的色素,这些色素都 】。过氧化氢在水溶液中可电离出过氧氢根离子攻击色素 可以用氧化脱色 因此对于负性离子有很好的脱色 在碱性介质中电离度增大, 脱色作用增强, 作用【。影响双氧水脱色效果的因素主要有:双氧水用量、温度、时间和值 等。与活性炭一样,通过对过氧化氢用量,反应温度,反应值等脱色工艺的 优化,可以提高反应中多糖的产率和脱色率。但是总体来说采用过氧化氢对多 第一章前言 糖进行氧化脱色,效果不太理想,与活性炭不同,由于过氧化氢脱色实际上只 是将色素氧化,并没有将色素从多糖中脱去,没有达到多糖纯化除杂的目的。 并且过氧化氢具有氧化性,有可能破坏多糖的生物活性。 ..树脂法 近年来,树脂法在天然植物有效成分分离纯化中得到了广泛的应用。杨云? 等分别使用活性炭、双氧水和.型弱极性吸附树脂对大枣多糖进行脱色,结 果显示,从脱色率和多糖保存率考虑, 树脂的脱色效果要明显优于活性炭和双 氧水。由于树脂是化学合成的高分子分离材料,因此其结构千变万化,我们可 以通过调整聚合单体、致孔剂、交联剂、引入特异性基团、改变聚合条件等方 法合成多种结构的吸附树脂,根据不同的分离纯化要求,从中筛选出最适宜的 高选择性、高吸附容量的树脂。树脂法在多糖的纯化研究中得到了广泛的应用, 很多结构新颖的树脂随之产生。到目前为止,已成功用于工业化生产的树脂仍 以大孔型吸附树脂、凝胶型离子交换树脂、大孔型离子交换树脂为主,也有筛 分等多种功能的新型吸附树脂用于多糖的提取研究中,取得了令人满意的结果。 可以想象树脂法既可以利用树脂从多糖中吸附色素,也可以由色素中提纯多糖。 刘燕琼【】等人利用型强酸性离子交换树脂在大蒜多糖的纯化过程中从色素 中提纯多糖,与传统方法相比,有一定的优势,较适宜于大蒜多糖的工业化生 产。仰榴青】等人探讨了大孔吸附树脂.对银杏外种皮多糖的吸附性能,结 果发现.树脂的吸附性能较好,多糖洗脱容易,纯化后多糖含量可达%以 上。 但是据大多数文献报导多糖与色素的分离是以树脂对色素进行吸附。我们 也主要是在这个方面对色素与多糖的分离进行了研究与探讨。不同结构的树脂 在多糖的纯化中有各自的优缺点,下面分别综述了这些不同结构的树脂在多糖 纯化中的应用,并对其特点进行了分析。 ...大孔型吸附树脂 大孔吸附树脂是一类不含交换基团且多孔性的球形高分子吸附剂,具有巨 大的比表面积,能够依靠与吸附质分子之间的范德华力或氢键进行物理吸附。 大孔吸附树脂可以分为非极性、中极性和极性三类。大孔吸附树脂的极性、孔 径、比表面积都将影响到多糖在树脂上的吸附,进而影响到多糖 的纯化,因此, 第一章前言 应根据多糖的性质来选择不同类型的树脂。夏玮,吕庆【 等人考察了种不同 型号大孔吸附树脂对桑叶粗多糖溶液的脱色作用, 实验条件下,大孔吸附树脂 都有一定的脱色效果,其中又以弱极性树脂脱色效果最好,非极性大孔树 脂和极性树脂.脱色性能依次递减,而非极性树脂脱色效果和 较差。表明桑叶粗多糖中的色素可能以弱极性色素为主。孙明礼等人 考察了活性炭、中性氧化铝、大孔吸附树脂.、.和.这种脱 色剂对半枝莲多糖脱色的研究,结果发现活性炭脱色效果最好,但由于其解吸 率低,使多糖保留率过低,只有.%;氧化铝吸附多糖后无解吸性能;. 树脂对半枝莲多糖的脱色效果不好;.和.两种树脂的粒径范围基本 相同,但是.树脂的各项结果都优于.树脂,因此,选择弱极性的. 树脂为最佳脱色剂,同时可以判断,半枝莲粗多糖中的色素可能仍然以弱极性 色素为主。刘海霞【等人在使用.以及.等种不同大孔吸附树脂在 对大枣多糖提取液进行脱色时发现:可能由于极性以及比表面积差异的原因 .树脂的脱色效果最好。 结果表明,树脂的极性对于多糖脱色的效果有明显的影响。与常规的多糖 脱色方法相比,大孔树脂吸附法操作简单,处理量大且生产周期短。不需加任 何有毒的有机溶剂,脱色效果也很明显;而且与活性炭脱色,过氧化氢氧化等 常规方法相比。多糖损失相对较小,提高了多糖的产率,树脂可以再生,也减 少了原材料的成本和对环境的污染。大孔吸附树脂的吸附原理与活性炭相似, 高分子与被吸附的分子之间依靠范德华力或氢键等比较弱的力,通过它很大的 比表面积来进行物理吸附。因为大孔吸附树脂的吸附原理与活性炭相似,也致 使大孔吸附树脂在脱色过程中有了一些活性炭脱色的缺点。比如说由于大孔树 脂依靠极性吸附分离多糖和色素的脱色机理过于简单,对于极性相似的多糖和 色素的分离效果很难达到理想的结果。 ...凝胶型离子交换树脂 离子交换树脂与大孔吸附树脂有什么不同在于前者的作用是化学反应, 后 者的作用是物理吸附, 作用机理是完全不同的, 因此使用方法也完全不同。 根据反离子所带电荷的不同,可分为阳离子和阴离子型交换树脂。 离子交换反应的进行,主要发生于树脂体内,因此,离子交换反应前,溶 液里的反应物必须能扩散进树脂的内部。下面两个因素能影响反应物对树脂体 第一章前言 内的扩散。 .树耵径大小的影响: 树脂体内存在许多毛细孔。孔的大小与交联剂用量普通型及致孔剂性质和 用量有很密切的关系。我们往往利用交联度以及致孔剂不同的树脂来将分子量 不同的化合物分开。 .溶液的浓度与树脂的交换量 当溶液里的电解质浓度较低, 而树脂的交换量较大时,溶液内离子不易进 入树脂内部, 交换反应较困难。另一方面, 当溶液的电解质浓度较高,而树 脂的交换量较小, 则溶液内离子仍然能自由的进入树脂内部, 但当溶液里电 使树脂体内孔度变小, 影响交换反 解质浓度较大时, 树脂往往有收缩现象, 应的进行。离子交换反应是很复杂的,因具体条件不同,就要作不同的考虑。 凝胶型离子交换树脂因其表面功能基的存在,增强了其对色素的吸附选择 性。谢红旗,周春山【】采用了六种大孔树脂和两种离子交换树脂对香菇多糖的 脱色工艺进行了研究,结果发现树旨 以及非极性大孔树脂.的脱色 效果和多糖收率都比较好,得出了香菇阴离子交换香菇多糖提取液中的色素可 能属于阴离子型也可能为非极性或弱极性分子的结论。 离子交换过程要求互相交换的两种离子都能在树脂颗粒内部自由迁移扩散 进出。树脂颗粒内部孔道的大小决定了离子交换树脂的交换速度,由于天然植 物中的色素和多糖的分子尺寸都远大于普通的无机离子,所以在 进行交换反应 时,树脂的孔径相比于常规的无机离子交换过程来说,起到了更为重要的作用, 而凝胶型离子交换树脂的孔道是由于低交联的树脂骨架溶胀时形成的网孔结 构,孔径尺寸较小,这对于色素等天然大分子在其中的扩散作用有很强的阻碍, 常造成交换速度慢,甚至难以洗脱。更为重要的是,对于凝胶型离子交换树脂, 单纯利用功能基团的化学反应与色素产生相互作用,其吸附容量较传统大孔吸 附树脂有显著下降。另外,在上柱吸附和洗脱过程中,常使用不同值、不同 离子强度的溶剂,树脂在不同溶剂中会产生很大的体积变化,造成操作难以控 制,树脂破损严重【。 ...大孔型离子交换树脂 由于上述两种树脂各有缺陷,大孔离子交换树脂应运而生。大孔离子交换 树脂综合了大孔吸附树脂和凝胶型离子交换树脂的结构特点,合成了一类新型第一章前言 的吸附树脂,它一方面保持了传统大孔吸附树脂的刚性骨架、巨 大的比表面积 和大孔的存在,另一方面,在树脂骨架上引入了离子性基团,因而具有凝胶型 离子交换树脂高的吸附选择性,这类树脂被称为大孔离子交换树脂。大孔离子 交换树脂在溶胀状态下既有高分子链间的空隙,也有合成时由致孔剂所产生的 大孔几个到上百个纳米;在失水后尽管链间的空隙消失,但大孔仍然可以保 留,此部分孔后来被称为物理孔,此种树脂被称为大孔树脂。研究表明,大孔 结构的存在使离子交换树脂的用途从凝胶型树脂对无机离子的交换,扩展到交 换或吸附有机物,从水溶液扩展到了非水体系?。王松柏,秦雪梅【等有选择 性的选择了种不同极性,酸碱性的树脂对防风粗多糖进行了脱色实验,结果表 明:大孔阴离子交换树脂对多糖的脱色效果最好。王元凤?】等对使用 大孔 弱碱丙烯酸系阴离子交换树脂分理纯化茶多糖的工艺进行了研究,结果表明, 脱色效果较佳。并且树脂的可再生性良好。黄申【】等通过对种 大孔树脂的实验, 最后确定西安蓝晓科技有限公司的.型大孔吸附树脂的效果较好,可以作 为分离甘草多糖的材料。 大孔型离子交换树脂虽然保持了凝胶型离子交换树脂和大孔吸附树脂的优 点,但是在使用中也表现出了一定的局限性,比如树脂的交换容量低于凝胶型 离子交换树脂,因而树脂的处理量较低。这主要是由于大孔离子交换树脂的骨 架是高交联的聚苯乙烯,这是维持树脂孔道和树脂机械强度的基本条件,但同 时带来了功能基化反应困难,反应时空间位阻较大,功能基的引入量常低于凝 胶型树脂。 .课题的提出及实验设想 ..课题的提出 由于香菇多糖是药理药效研究得较透彻的一种多糖,具有非常明显的药效 和较明确的药理,其化学结构模型如图.所示:第一章前言 掌 事 一尚, 一驴盎 .品。。刁印 ??一 . 一.. 图.香菇多糖的化学结构模型 国内外大量研究资料表明,香菇多糖除了具有抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、 消炎等大多数多糖所具有的普遍生理活性,还可以用来辅助治疗乙肝和艾滋病。 同时还是一种非特异性免疫调节剂增强剂,它能激活免疫细胞,提高机体的免 疫功能,而对正常细胞没有毒副作用,并且其硫酸酯化的多糖还具有抗病毒 作用,除此以外,香菇多糖尚有许多应用价值正在开发当中,这就决定了香菇 多糖的开发远景是非常广阔的。同时,香菇作为一种产量较大的,易得的植物, 在市场上有充足的供给。所以,在本论文中我们选择香菇多糖作为研究的体系。 现在,香菇多糖己有产品上市,一类是在医药领域,利用香菇多糖 的抗病毒、 抗肿瘤等生物功能或活性制备药物,香菇多糖被制成注射液,用来作为治疗乙 型肝炎和癌症的辅助药物,香菇多糖硫酸酯化产品用来制备治疗艾滋病的辅助 药物。另一类是在保健食品领域,活性多糖作为功能性因子调节或增强人体免 疫功能,或起到抗肿瘤、抗突变、抗病毒、抗凝血、抗溃疡、抗氧化、降血糖、 降血脂等保健作用。 香菇多糖虽然具有明确的药理药效,但要应用于临床,特别是作为注射用 药物,必须具有足够的纯度,香菇多糖的提取纯化技术美国、日本处于领先地 位,技术受到专利保护。国内要制备高纯香菇多糖,成本非常高,如治疗肿瘤 用的多糖注射液价格昂贵,一般病人无法承担其治疗费用。而国内大多香菇多 糖生产厂家生产的多糖都是纯度较低的产品,一般也只能应用于功能性保健食 品领域。因此对香菇多糖提取纯化技术进行研究,开发出一条经济、流程短、第一章前言 简单制备高纯香菇多糖的新工艺,是很有应用价值的一个研究课题。 ..实验设想 根据香菇多糖理化性质和我们已经掌握的树脂的知识,想要使用树脂对香 菇多糖进行有效提纯并且能够应用在大规模工业生产中,我们所需要的树脂必 须做好以下几点: .为了使多糖中的色素被有效吸附,必须对树脂选择的大方向有一个较好 的把握。例如:植物多糖在经过粗提除去水溶性色素之后,剩余色素一般为多 酚类负离子。并且在众多有机大分子中,绝大多数都应该是负离子,据此我们 可以推测对一般有机色素脱色应首先尝试使用阴离子交换树脂。 .适宜而均匀的孔径非常重要。树脂的孔径对树脂的性质有着决定性的影 响。可以利用树脂的孔径对色素和多糖的类似于筛分的作用来使两种物质分离。 从现有的树脂类型考虑,凝胶型树脂在于态时无孔。在被适宜的溶剂溶胀后通 过收缩的碳骨架伸展而产生小孔。孔径较小,可能不利于色素和 多糖等大分子 向树脂内部进行扩散。难以以筛分机理对多糖和色素进行分离。而大孔树脂由 于孔径过大并且不均匀,多糖和色素均可以在树脂内部自由扩散,也没能达到 通过孔径来有效控制分离多糖和色素的目的。据此,我们需要运用对树脂的性 质的认识,通过对反应条件,投料以及投料比等因素进行合理调整。从而合成 一系列传统树脂合成方法无法达到的孔径大小合理并且分布均匀的树脂。使色 素分子可以在树脂内部有效扩散,而多糖分子由于分子尺寸较大,不能扩散至 树脂内部,从而达到通过调整树脂结构,使多糖和色素有效并且高效分离的目 的。 .合适的骨架结构。传统的苯乙烯系的聚合单体和交联剂可能天然在骨架 上就存在着一些缺陷,由于骨架是弱极性的,可能对多糖存在着不可避免的吸 附。适当改变树脂骨架的极性可能会产生意想不到的、我们改变其他因素所不 能达到的新效果。 .树脂上要有合适的反离子。色素一般为有机物大分子盐类,可发生弱的 电离作用,易与离子交换树脂发生反应,从而被固定在大分子树脂上。而多糖 大分子一般含有大量的羟基,在酸性以及中性条件下难于电离,在碱性条件下第一章前言 可能发生较弱电离,所以,在强碱条件下离子交换树脂可能会对多糖产生吸附。 设想可以根据多糖和色素这方面的差异,使用离子交换树脂,达到脱色分离的 目的。在多糖脱色的过程中,多糖分子的种类是已知的,但色素却种类繁多, 千变万化。但可以想象,有机大分子中阳离子的可能较小,阴离子的可能性较 大【“。故设想对于大多数多糖的脱色均可先选用氯,溴,碘等极弱碱做阴离 子的阴离子交换树脂。 .在找到适合用于多糖脱色树脂的基础上,优化反应条件,通过改变反应 发生时的外在条件,进一步改善色素的脱色率和多糖产率,是我们研究的最终 目的。第二章孔径均匀、可控的离子交换树脂的制备 第二章孔径均匀、可控的离子交换树脂的制备 离子交换树脂是一类以静电作用力做为吸附力的树脂,依照其合成的过程 中是否使用致孔剂,可以分为凝胶型离子交换树脂和大孔型离子交换树脂,由 其所带的离子属性不同,可以分为阴离子交换树脂和阳离子交换树脂。我们常 用的大孔吸附树脂,其合成过程中是以非良溶剂作致孔剂,聚合时发生相分离 产生孔。一般来说,大孔型离子交换树脂孔径较大并且尺寸并不均匀,致使不 同尺寸的分子均有可能进入孔道而在树脂骨架的疏水性作用力下发生吸附,另 外,对于大分子多糖类化合物,虽然它们是亲水性的,与树脂的疏水作用力相 对较弱,但是,由于它们较长的分子链结构,会造成在树脂孔道中的物理缠结, 一旦进入树脂孔道,就难以快速流出。为此,本章改变传统的非良溶剂致孔合 成大孔吸附树脂的方法,利用良溶剂作为致孔剂,通过改变树脂的起始交联度, 合成了一系列孑径较小且均匀的离子交换树脂,考察了树脂的吸 附分离性能。 .树脂的合成及其表征 ..试验部分 ...主要仪器和试剂 蒸馏水 南开大学化工厂 无水乙醇 分析纯 天津市化学试剂六厂 工业品 南开大学化工厂 苯乙烯 二乙烯苯 工业品 南开大学化工厂 甲苯 分析纯 天津市化学试剂六厂 工业品 氯甲醚 南开大学化工厂 ,一二甲基甲酰胺 分析纯 南开大学化工厂 过氧化二苯甲酰 分析纯 南开大学化工厂 二氯乙烷 分析纯 天津市化学试剂六厂 甲基吡啶 分析纯 天津市化学试剂六厂 第二章孔径均匀、可控的离子交换树脂的制备 三乙胺 分析纯 天津市化学试剂六厂 二乙烯三胺 分析纯 天津市化学试剂六厂 分析纯 三乙烯四胺 天津市化学试剂六厂 工业品 聚乙烯醇 南开大学化工厂 无水氯化锌 工业品 南开大学化工厂 氢氧化钠 分析纯 天津市化学试剂六厂 . 真空干燥箱 天津市天宇仪器 电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司 ...前期处理 常温下将聚乙烯醇或明胶溶于水中,配成质量浓度为..%的 水相。苯乙烯及二乙烯苯需要进行脱阻,即以氢氧化钠溶液洗至混合相无红色, 再以%的氯化钠溶液洗涤至流出液为中性。也需要进行重结晶,一般以氯 仿为溶剂,甲醇作沉淀剂,进行精制。 ...一良溶剂致孔的离子交换树脂的制备 .聚苯乙烯的制备 以苯乙烯为单体,二乙烯苯为交联剂,上述聚乙烯醇溶液为分散剂,为良 溶剂甲苯为致孔剂,经过重结晶的过氧化二苯甲酰为引发剂。通过悬浮 聚合反应,合成苯乙烯一二乙烯苯骨架的均孔离子交换树脂,通过改变交联剂 的用量,可以合成不同初始聚合度的聚苯乙烯共聚物白球。通过改变致孔 剂甲苯的用量,也可得到孔径不尽相同的一系列白球,白球结构如下图.所示: 图. 树脂结构 第二章孔径均匀、可控的离子交换树脂的制备 .聚苯乙烯的氯甲基化反应 以上述白球为反应母球以过量的二氯乙烷充分溶胀,氯