[doc] 肝脏细胞条件培养基诱导大鼠骨髓间质细胞分化为肝细胞的作用

[doc]肝脏细胞条件培养基诱导大鼠骨髓间质细胞分化为肝细胞的作用肝脏细胞条件培养基诱导大鼠骨髓间质细胞分化为肝细胞的作用?28?中西医结合肝病壹QQ生箜!鲞!塑肝脏细胞条件培养基诱导大鼠骨髓问质细胞分化为肝细胞的作用李瀚昊晏雪生明安萍彭亚琴罗建君兰少波高翔湖北中医学院附属医院肝病研究所(湖北武汉,430061)?实验研究?摘要目的:探讨肝脏细胞条件培养基诱导大鼠骨髓间质细胞分化为肝细胞的作用.方法:从大鼠骨髓中分离纯化培养间质细胞,诱导前24小时加l~g/L碱性成纤维生长因子(bFGF)入培养液中以促进细胞分裂,再以肝脏细,留取细胞,胞条件培养基作诱导剂,分别在诱导培养0,7,14,21,28天时观察细胞形态的变化,并采用免疫细胞化学方法检测肝细胞功能标志物(AFP,白蛋白,CK18),用PAS法进行糖元染色试验,以验证诱导分化的结果.结果:诱导后3天间质细胞表现为肝细胞样,随着诱导时间的延长,肝细胞功能标志逐渐出现和成熟.AFP在7,14天时表达较高,21,28天时表达显着减少;白蛋白,CK18和糖元随着诱导时间的延长表达逐渐增多.结论:肝脏细胞条件培养基能诱导骨髓间质细胞分化为肝细胞.关键词骨髓间质细胞;肝细胞;条件培养基;诱导;大鼠TheDifferentiationofBoneMarrowStromalCellsintoHepatocytebyCondi-tionedMediumofLiverCellsinVitroL1Han—rain,YANXu—sheng,MINGAn—ping,ela1.HepatopathyInstitution,AdjunctiveHospital,Hubei(~llegeofTraditionalChineseMedicineCollege(H”Wuhan,430061)ChinaAbstractObjective:TostudywhetherthedifferentiationofboneiT~rrowstromalcells(BMSCs)intohepatocytebyconditionedmediun1oflivercellsinvitro.Methods:TheBMSCsfromratswereisolatedandculturedfor6passages.Thecellswerepretreatedfor24hinDMEMcontaining20%FBS(v/v)andlgg’L—bFGFThenthemediumWetsreplacedwiththeconditionculturemediumoflivercellsforinduction.Themorphologicalchangesofthecellswereobserved.Cellswerecollectedonday7山,14山,28山.CK18,AFPandalbuminweretestedbyimmunocytochemistry.Glycogenwastestedbyperiodicacid—schiff(PAS).Results:Morphologicalchangesofthestromallcellswerenoted3daysafterinduction.Hepaticphenotypeandfuctionwereappearingprogressivelywiththeculturedtimelonger.TheexpressionofAEPincreasedprogressi~,elyonday7.14m,thendecreasedonday21th,28血.Theexpressionsofalbumin,CK18andglycogenwerestrongerwiththeculturedtimelonger.Conclusion:TheresultsshowthatthebonemarrowstromalcellscanbeinducedtOdifferentiateintohepatocyte—likebyconditionedmediumoflivercellsin,ritro.KeyWordsBoneMalTowStromalCell;LiverCell;ConditionedCultureMedium;Induction;Rat鉴于有关人类胚胎干细胞的研究受到伦理道德和法律的限制,成体干细胞的研究越来越受到重视.最近的许多研究证明,骨髓中的干细胞在特定环境下可分化成为多种无关的组织细胞(视网膜,肺,骨骼肌,肝,肠,肾,脾,血液,皮肤等)…1.骨髓干细胞转化为肝细胞的研究结果为肝细胞或肝脏的移植带来新的希望.由于骨髓问质细胞取材容易,细胞增殖快,从患者本身取材,培养扩增,定向诱导分化成肝细胞,再植入患者体内,避免了异体的排斥反应和可能存在的交叉感染等风险,亦可成为生物人工肝的肝细胞来源,在临床应用上具有广阔的前景和深远的意义.肝脏细胞体外培养可合成,分泌多种诱导肝细胞*基金项目:国家自然基金No.30271562;国家科技部重大基础研究资助项目No.2002CCC00300;湖北省fi然科学基金No.2001ABB1717西医结合肝病杂志2005年第15眷筮塑再生的营养因子和细胞因子.本研究从大鼠骨髓中分离培养间质细胞,采用肝脏细胞条件培养基作诱导剂,观察到骨髓间质细胞体外能分化为肝细胞的实验结果,为进一步将骨髓间质细胞移植应用于肝衰竭患者的治疗和作为生物人工肝的肝细胞来源,奠定了实验基础.1材料与方法1.1骨髓间质细胞的分离及培养Wistar大鼠(雌雄不限,120克左右)经戊巴比妥钠麻醉后剪取股骨,除去骨周围的肌肉组织,剪开骨两端,用注射器吸取1.5mla—MEM(Gibco)培养基(含20%FBS),2mmol/L谷氨酸胺(Sigma),从骨的一端缓慢地冲洗骨髓腔,所得的细胞悬液按1×10./ml的密度进行培养,两日后换液,换液前用0.01mol/L的PBS轻轻冲洗培养细胞的表面,以除去未贴壁的细胞,继续用以上培养基进行培养(37?,5%co2),以后每隔两天换液.当细胞铺满培养瓶底后,用1.25g/L胰蛋白酶(Sigma)消化,将1瓶传至3瓶,传至第6代后,培养基改用DMEM(Gibco)培养基(含20%FBS),2mmol/L谷氨酸胺.反复传代后即获得高纯度的骨髓间质细胞.1.2肝脏细胞的分离培养及培养上清液的收集Wistar大鼠(雌雄不限,乳鼠,2天龄),消毒后剖开腹部,充分暴露肝脏,剪下/lJ:~f,除去肝筋膜及包膜,用Dhanks液清洗3遍,以眼科手术剪反复剪碎,加入培养基2ml,反复吹打后自然沉降,弃去上清液.用吸管吸取肝组织块种植与培养瓶壁上,贴壁60分钟后,加入DMEM培养基培养.每日洗去悬浮细胞,更换培养液,待贴壁的细胞长满瓶底70%时开始收集条件培养基,每周收集3次.将收集的条件培养基经0.22/,m孑L径的滤器过滤,以除去杂质和细胞碎片,然后将此诱导液4?保存备用.1.3用肝脏细胞培养上清液诱导大鼠骨髓间质细胞大鼠骨髓间质细胞培养至第6代,加入1g/LbFGF以促进细胞分裂.诱导培养液为DMEM+体积分数20%胎牛血清+2mmol/L谷氨酸胺+50%肝细胞条件培养基,诱导时间持续28天,每隔2天换1次新鲜诱导液和培养液.对照组的细胞则一直采用DMEM+体积分数20%胎牛血清+2mmol/L谷氨酸胺进行培养,每隔2天换液1次.每组10个复孑L(孑L内均放置无菌处理的小玻片做细胞爬片用),分别于培养的第0,7,14,21,28天取出细胞爬片.用PBS冲洗两遍后,用冷丙酮固定10分钟,空气干燥?29?后密封置于一80?冰箱保存,以备统一检测.1.4检测肝系细胞特征标志1.4.1用免疫细胞化学法检测CK18,AFP,白蛋白留取的细胞爬片从冰箱取出放置至室温后用PBS冲洗干净,再加过氧化物酶阻断剂37?孵育10分钟,PBS冲洗3遍,每次3分钟,再滴加非免疫血清,37?孵育10分钟,直接甩于多余血清,分别滴加一抗CK18,AFP,白蛋白工作液(其中AFP用无菌PBS1:200稀释,白蛋白用无菌PBS1:300稀释),每片滴加501,l,37?孵育2小时,PBS冲洗3遍,每次3分钟;再滴加生物素标记的二抗,37?孵育10分钟;PBS冲洗后,滴加过氧化物酶标记的卵白素,37?孵育10分钟,PBS冲洗;DAB镜下显色,冲洗使显色终止,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,镜下观察,选数个高倍视野进行细胞计数,并计算阳性细胞数.1.4.2以PAS染色检测糖元将0天,7天,14天,21天,28天留取的细胞爬片,用95%酒精固定10分钟,冲洗干净,1%过碘酸水溶液反应10分钟,冲洗,晾干,加Schiff试剂30分钟,亚硫酸水洗3遍,自来水冲洗,脱水,透明,中性树胶封片,镜下计数阳性细胞率.1.5统计学方法阳性率比较用卡方检验,P?0.05为差异有显着性意义.2结果2.1骨髓间质细胞的生长情况在原代培养过程中,种植后约24小时间质细胞开始贴壁生长,呈梭形.血细胞和造血于细胞呈圆形,漂浮在培养液中.用0.01mol/L的PBS轻轻冲洗培养细胞的表面,去除非贴壁细胞.间质细胞在培养的第3天开始数量急剧增多,呈集落性生长,然后增殖趋于平缓,10天左右细胞铺满瓶底.当细胞传代后,细胞形态仍保持梭形,细胞增殖旺盛(图1,见插页).每隔3天传代1次,反复传代后可获得高纯度的骨髓间质细胞.2.2肝脏细胞条件培养基对大鼠骨髓间质细胞的诱导诱导前培养基中加入lug/LbFGF,促进间质细胞增殖.24小时后,改用诱导液培养,诱导后约3天左右即有少量细胞形态开始变化,表现为肝细胞样细胞形态;7,8天呈多边形,胞浆丰富,核大;10天左右与肝细胞体外贴壁形态几乎一样(图2,见插页).随着诱导时间的延长,肝细胞样的细胞数量也渐增多.诱导后28天,肝细胞样的细胞仍存活.对照组的细胞仍然呈梭形,传代至15代时,细胞开始?30?变得宽大,扁平,逐渐脱壁死亡.2.3免疫细胞化学检测结果0天时,AFP,白蛋白仅有极少数细胞表达,CK18未见表达.7,14,21,28天依次增强(与0天相比,P<0.05,见插页图3,图4).7天时,AFP表达明显升高(与0天相比,P<0.05),14,21,28天依次减弱(与7天相比,P<0.o5).对照组始终未出现AFP,CK18和白蛋白阳性.见表1.表1不同时间CK18,Alb和AFP的阳性率(%)2.4PAS糖元染色结果未诱导的骨髓间质细胞未发现糖元染色阳性细胞,诱导7,14天时有少数肝细胞样细胞表达糖元,21,28天逐渐升高(图5,见插页),其阳性率见表2.表2不同时间糖元染色的阳性率(%)糖元0天7天14天21天28天01.68.961.287.33讨论骨髓间质细胞来源于中胚层发育的早期间充质干细胞,通过与造血细胞密切接触,分泌细胞外间质和多种细胞因子调节造血功能,是造血诱导微环境的重要组成部分.近10年来的研究证明,骨髓间质细胞本身具有增殖和多向分化潜能,在体外能被诱导分化成骨细胞,软骨细胞,肌肉细胞及脂肪细胞[2,.骨髓内含有多种细胞类型,具体是哪种细胞群体能分化为肝细胞,各家报道尚不一致.本实验根据造血干细胞呈悬浮生长,间质细胞呈贴壁生长的特点,经多次换液及传代培养,剔除悬浮的血细胞和造血干细胞,以获得高纯度的骨髓间质细胞.骨髓间质细胞多向分化潜能在特定的微环境下呈定向分化,故用肝脏中西医结合肝病杂志20o5F第】鲞筮!塑细胞培养基上清液进行诱导分化,让促使肝脏细胞合成,分泌的多种营养因子和细胞因子起关键作用.本实验所检测的肝系细胞表型和肝细胞功能两个方面的多个指标,随着诱导时间的延长,标志逐渐出现和趋向成熟,表明骨髓间质细胞能被肝脏细胞培养基上清液诱导分化成肝细胞.AFP,白蛋白,CK18,糖元等观察指标均为肝系细胞特异性标志.AFP是一种胞浆蛋白,由肝前体细胞分泌.随着细胞逐渐成熟而消失,成熟肝细胞不表达AFP.白蛋白是最常用和可靠的一个肝细胞功能的检测标志,因为白蛋白主要由肝细胞合成分泌,其他组织细胞分泌极少,用免疫细胞化学方法很难检测到.CK18是肝细胞相对特异性的标志,这种角蛋白在幼稚的肝前体细胞不表达.在体内,肝脏是糖元合成和储存的唯一部位,肝细胞的特征性功能是合成和储存糖元.我们的实验结果表明,未经诱导的骨髓间质细胞基本不表达AFP,经肝脏细胞培养基上清液诱导7天时表达较高,而诱导14,21,28天时表达依次减少.诱导7,14天时少量表达CK18和糖元,至21,28天时表达显着增多.多个指标的检测结果,支持骨髓间质细胞向成熟肝细胞的方向分化,且随诱导培养时间的延长,具有肝细胞分泌白蛋白功能的细胞逐渐增多,诱导培养7,14天时,有少数细胞表达,21,28天时细胞表达的白蛋白显着增多,提示此类细胞具有成熟肝细胞的功能.本实验初步证明了肝脏细胞条件培养基对大鼠骨髓间质细胞转化肝细胞的诱导作用,为进一步研究奠定了实验基础.其诱导分化的机制和临床运用的方法,途径以及可靠性和安全性尚需进一步研究.参考文献1赵春华,廖联明.对成体干细胞可塑性的新认识及其在再生医学中的意义.中华血液学杂志,2003,24(2):57--582ProckoopDJMarrowstrornalcellsasstemcellsfornonhematopoietictissues.Science,1997,276:713CaplanAL.ThemesengenicproceasClinPlasticSurg,1994,21:4294PittengerMF.MultilineagepotentialofadulthumanmesenchymalstemcellsScience,1999,284:1435HanadaK,DennisJEStimulatoryeffectsofbasicfibroblastgrowthfactorandbonemorphogeneticprotein2onosteogenicdifferentiationofratbonemarrowderivedmesenchynmlstemcells.LBoneMinerRes.1997,12:16066VandenBosCHumanmesenchvmalstemcellsrespondtofibroblastgrowthfactors.HumCe1l,1997.10:45(收稿日期:2004一l1一l9编辑:韦怡)HBVx基因转染对HepG2肝癌细胞凋亡的影响及其机制(正文见.页,十_l?q14JfIri’lft…一fr’g.l1?c}I-三翁暑,卜IcI1LI’)N%IIB,cell~l41m)-描亡朐的胎梭为监黑色r_.-|.?_.-???.,,t.|1-亲_1O0x_胰腺弹力蛋白酶在大鼠肝纤维化组织中的表达(正文见.页)