【doc】脐带间充质干细胞移植治疗肌萎缩侧索硬化症的疗效分析

【doc】脐带间充质干细胞移植治疗肌萎缩侧索硬化症的疗效分析 脐带间充质干细胞移植治疗肌萎缩侧索硬 化症的疗效分析 ? 临床研究?2012年4月第9卷第12期 脐带问充质干细胞移植治疗肌萎缩侧索硬化症的 疗效分析 李敏滑蓉蓉于爱学张芳芳代广辉王晓东程洪斌安沂华 武装警察部队总医院神经干细胞移植科.北京100039 【摘要】目的通过对临床住院接受干细胞治疗的99例肌萎缩侧索硬化症患者分析,了解干细胞治疗肌萎缩侧索硬 化(ALS)的效果,同时对接受治疗的患者进行跟踪随访,从而进一步判断干细胞治疗ALS的长期疗效.方法采集 脐带间充质干细胞并进行培养,流式鉴定,无菌鉴定;临床收集ALS病例,所有的ALs诊断均符合E1Escorial诊断 ;确诊的ALS患者均给予4次腰椎穿刺脐带间充质干细胞移植.移植术前及术后由同一康复师使用ALSFRS评 分,Plaitaks评分以及本课改良的Plaitaks评分进行评价,最后对所得数据进行统计分析.结果三种评分方法都 证明干细胞移植可以改善ALs患者的运动功能(P<0.001),但是疗效维持时间较短,出院半年后只有25%的患者 症状较治疗前改善.结论干细胞治疗ALS是有效的,安全的. [关键词】脐带间充质干细胞;肌萎缩侧索硬化症 【中图分类号】R746.4【文献标识码】A【文章编号】1673—7210(2012)04(c)一0052—03 Analysisofcurativeeffectsofumbilicalcordmesenchymalstemcelltrans— plantationintreatmentofamyotrophiclateralsclerosis LIMinHUARongrongYUAixueZHANGFangfangDAIGuanghuiWANGXiaodongCHE NGHongbin ANYihua DepartmentofNeuralStemCellTransplantation,ChinesePeopleSArmedPoliceGeneralHospital,Beijing100039,China 【Abstract]ObjectiveTounderstandthecurativeeffectsofstemcellsinthetreatmentofmuscleatrophylateralsclerosis (ALS)throughtheanalysisof99patientswithamyotrophiclateralsclerosisreceivingstemcelltreatment,anddeterminethe longtermcurativeeffectsofstemcellsinthetreatmentofALsthroughfollowinguptreatedpatientsmeanwhile.Methods Thecollectedumbilicalcordmesenchymalstemcellswerecultured,identifiedwithflowcytometryandidentifiedsterilely. PatientswithALSwerecollectedandallALSdiagnosismettheELEscorialdiagnosticcriteria.AlldiagnosedALSpatients received4timesoflumbarpunctureumbilicalcordmesenchymalstemcelltransplantation.Beforeandafterthetransplan- tation,theALSFRSscore,PlaitaksscoreandPlaitaksscoreimprovedbythisprojectwereusedtoevaluatethepatientsby thesamerehabilitationtrainer,andthenthedatawereanalyzedstatistically.ResultsAllthethreescoringmethodsproved thatstemcelltransplantationcouldimprovethemotorfunctionofALSpatients(P<o.oo1),butthemaintenanceduration ofcurativeeffectswasshort,and6monthsafterdischargefromhospital,symptomsofonly25%ofthepatientsimproved comparedwithbeforethetreatment.ConclusionThestemcelliseffectiveandsafeinthetreatmentofALs. 【Keywords】Umbilicalcordmesenchymalstemcells;Amyotrophic1ateralsclerosis 肌萎缩侧索硬化(ALS)是一种病因未明,选择性侵犯脊 髓,脑干及皮层运动神经元的进行性变性疾病.患者从最初 发现症状开始,平均仅能存活3,5年.发病以中老年人为主, 青少年少见,平均发病年龄约59岁,发病率在1/10万,3/10 万,有家族性倾向【l1.因为该病的病因是多因素的,至今不是 很清楚.因此当前无实质性减缓疾病进展的治疗手段.由美 国FDA获准在临床应用的利鲁唑(Riluzole),是一种兴奋性 氨基酸受体阻滞剂,对延长患者存活期有一定作用[21.但是并 没有逆转患者病情的作用. 干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞,目前研 ,骨髓间 究较多的干细胞种类包括胚胎干细胞,神经干细胞 充质干细胞,脐带间充质干细胞和诱导产生的多能性干细胞 【基金项目】苗圃基金(项目编号:wz2009005). 【通讯作者】安沂华,中共党员,神经外科学博士,博士后,主任医师,研究 员,博士研究生导师,现任武警总医院神经千细胞移植科主任,北京天坛 医院北京市神经外科研究所神经干细胞室主任. 52中国医药导报CHINAMEDICALHERALD 等.由于脐带间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs) 具有多向分化潜能,且具有获取简便,无伦理学争议,增殖力 强,来源广泛,不导致免疫排斥等优点翻,成为现在研究的热点. 1与方法 1.1一般资料 对2005年1月2008年l2月于我科就诊接受干细胞 治疗的99例MND患者进行分析.其中男64例(64.6%),女 35例(35.4%).年龄32-73岁,平均(52.9~9.3)岁.病程4-120+ 月.平均病程(26.0~19.5)个月依据1994年世界神经病学联 盟在西班牙EIEscorial会议上制定的肌萎缩侧索硬化(ALS) 诊断标准[41,本组均为确诊ALs. 1.2评分 1.2.1AL5FRS(h)评分ALSFRS评分包括语言,唾液分泌, 吞咽,写,切断食物和使用餐具,穿衣和卫生保健,在床上 翻身和整理衣物,行走,攀登楼梯以及呼吸共十个项目,总分 0.40分.分值越低,神经功能损害越严重.但是此项评分方 2012年4月第9卷第12期 法的缺点是对于延髓功能的评测指标太少,只有一项指标. 1.2.2P]ojtaks(P)评分以及改良P]fl1taks评分由于 ALSFRS评分方法存在不足,因此本项课题同时又使用另一 种临床评价方法——P】aitaks,评分,此项评分在详细地评价 四肢肌力的同时.还对延髓功能做了专门的评价.该项评分 方法的满分为165分,分值越高神经功能损伤越轻,但是通 过临床验证,我们发现此方法还存在着不足——缺少对躯干 活动以及呼吸功能的评分,因此本课题在此基础上稍加改 良.以便达到更好地对ALS运动功能进行评价的目的.改良 的P1aitaks(满分204分)评分在原有评分基础上,增加了两 个方面的评价:?在脊髓功能项中增加了对双侧的颈部屈 曲,颈部伸展和耸肩的运动功能评价,每项评定采用6级分 法;?延髓功能中增加了咀嚼运动.除了脊髓功能和延髓功 能两项外.还增加了一大项——呼吸肌力量.包括吸气运动 和呼气运动(正常3分,轻度损伤2分,中度损伤1分,严重 损伤0分). 1.3干细胞治疗 1.3.1干细胞来源采白健康的正常孕周的剖腹产产妇的脐 带,孕妇术前各项检查包括:血常规,尿常规,凝血功能,肝功 能,肾功能,血糖,血脂检查结果都正常;梅毒和艾滋病抗体 阴性:无甲,乙,丙型肝炎;无家族性,遗传性疾病病史. 1I3.2脐带间充质干细胞的培养过程具体方法:经孕妇签署 书面同意书后,于剖腹产手术中取脐带约10cm,无菌条件 下分离,培养,传代.收集第4,6代的细胞,利用倒置相差显 微镜和流式细胞仪进行鉴定,然后用于移植 1.3.3间充质干细胞应用到临床的标准应用到临床之前,首 先对干细胞进行各种检测,包括:?细胞形态学检测;?细胞 面标记检测;?无菌检测;?支原体检测;?内毒素检测: 鲎试剂检查法结果阴性(根据2000年版细菌内毒素检查法). 1-3_4临床治疗过程术前收集干细胞并用生理盐水将其制 备成2mL细胞悬液,细胞浓度为0.5xl07/mL.将其吸人1mL 注射器.常规进行腰椎穿刺,进入蛛网膜下腔后.缓慢采集2mL 脑脊液,然后将2mL细胞悬液缓慢注入.患者去枕平卧6h. 监测患者血压,心率,血氧,呼吸24h.1周以后重复1次,总 共进行4次. 1.4统计学方法 应用软件SPSS11.5进行统计分析,经正态性检验,治疗 前后ALSFRS评分,原始Plaitaks评分以及调整Plaitaks评分 数据符合正态分布,治疗前后评分比较采用配对t检验.以 P<0.05为差异有统计学意义. 2结果 2.1一般病例资料结果 在99例确诊ALS患者中年龄最小的32岁,最大的73岁. 平均(52.9~9I3)岁,且住院时的病程为4,120个月,平均病程 (26.0?19.5)个月.这比国际上公布的平均发病年龄(55岁) 要早.另外性别比例男64例(64.6%),女35例(35.4%),男性 的发病率明显高于女性. 2.2流式细胞学检测干细胞表面标记物 CD90~100%,CD44~99.82%,CD73100%,CD10599.95%. CD45,CD34,CD19,CD1lb表达率小于2%.' 2.3干细胞治疗结果 99例患者在移植前以及移植后分别进行A评分P评分 ? 临床研究? 以及改良的P评分.三种评分结果在应用统计分析后结果JP 值均<0.001(表1),说明干细胞治疗ALS是有效的,并且统 计学上有显着意义.: 表1,千细胞治疗AL$前后评分统计结果 2.4随访结果 99例ALS移植治疗后随访半年,失访19例(19.2%),死 亡10例(10.1%),症状改善25例(25_3%),病情进展45例 (45.5%).在有效随访的人群中改善率为25/80(3I.3%).随访 半年1年,患者死亡25例(25.3%),症状改善4例(4.0%), 病情进展41例(41.4%).随访12年,患者死亡28例 (28.3%),症状改善1例(1.0%),病情进展16例(16.2%). 3讨论 MSC用于临床应用研究的种类主要是骨髓间充质干细 胞和脐带间充质干细胞.这两类细胞都具有MSC共同的特 点即低免疫源性.与成体阶段与多种细胞共同生存的骨髓间 充质干细胞相比,脐带问充质干细胞发育阶段更早,其所生 长的组织环境更为单纯,因此便具有更强的增殖能力与分化 能力,更低的免疫源性,更加强大的分泌因子能力,加之大量 的细胞来源,方便的提取提纯以及易于体外培养等特性.是 选择其为细胞来源的主要原因. Mazzini等阁应用骨髓来源的间充质干细胞移植治疗ALS. 将培养好的干细胞悬浮于自体脑脊液中,外科暴露胸段脊 髓,在平T7—9水平脊髓局部移植.分别在移植后3-6个月行 MRI检查,没有发现脊髓结构改变和异常细胞增殖,且一半 的患者的下肢肌力减弱的趋势渐趋缓和.而且长期观察已经 证实BMSC的培养扩增和移植人人脊髓是安全的.在ALS患 者可以耐受嘲.Karussis和他的同事在经过大量的临床前研究 后,利用静脉或者鞘内注射MSCs治疗ALS或者多发性硬化. 证实了两种方法治疗神经系统变性病是安全有效地.因此本 课题从安全角度考虑下选择了使用腰椎穿刺蛛网膜下腔注 射的方式移植干细胞,操作简单,安全,创伤小. 本课题的研究结果发现,患者接受干细胞治疗后症状明 显改善,且移植前后的评分统计学上有着差异.说明干细 胞治疗ALS是有效的,通过临床观察,治疗后患者的改善主 要是?肌肉力量的增加;?四肢肌张力下降;?肌束震颤次 数明显减少;?言语及吞咽功能明显好转.考虑到MSCs发 挥作用的机制主要是?神经替代作用;?神经营养作用;? 激活自身干细胞.人们利用添加某种递质(如神经营养因子) 或者与人类神经元共培养的方法诱导神经样细胞,并且证 明诱导的神经样细胞存在某些神经功能嘞.GDNF具有与运 动神经元高亲和性的特性,能够预防神经元的死亡.Suzuki 等证明在大鼠身上证实了移植入肌肉的hMSCs能够在肌 肉中存活,并且可以不断分泌GDNF,给予肌肉,神经肌肉接 头持续的神经营养支持,从而减少ALS大鼠脊髓运动神经 CHINAMEDICALHERALD中国医药导报53 ? 临床研究? 元的丢失,改善生存以及神经功能.接受干细胞移植的部分 ALS患者最短在移植后4h即有明显的神经功能恢复.有研 究证实ALS患者在运动神经元以及神经胶质细胞受损之 前,伴随神经肌肉接头受损同时,有60%前根受损口ol.因此考 虑干细胞如此早的发挥神经修复作用可能与干细胞分泌神 经营养物质有关. 在治疗结束后的半年随访结果:失访19.2%.死亡 10.1%,症状改善25.3%,病情进展45.5%,在有效随访的人群 中改善率为25/80(31.25%).可以看出大部分患者症状出现 反复,病情复又进展.这说明干细胞治疗ALS在短期内确实 有效,但是长期疗效还有待进一步探讨,从随访情况来看有 效期维持在3,6个月,大部分患者在干细胞治疗半年后又开 始出现恶化趋势.这是否从临床方面说明了干细胞发挥作用 的机制是神经营养或者免疫调节呢,亦或是干细胞在体内的 生存期大概在半年左右呢,还需要进一步的实验证实. 从安全角度来看,所有的患者住院20余天期间没有发 现任何不适症状.随访中发现大部分的死亡患者死因为呼吸 衰竭,其次为饮食导致的窒息.没有发现任何因为免疫排斥 或者肿瘤导致的死亡.说明了干细胞移植治疗ALS是安全的. 【参考文献】 [1】RowlandLP,ShneiderNA.Amyotrophiclateralsclerosis叨.NEnglJMed, 2001,344(22):1688—1700. 【2]MillerRG,MitchellJD,LyonM,eta1.Riluzoleforamyotrophielateral sclerosis(ALS)/motorneurondisease(MND)[J1.CochraneDataba$eSyst 2012年4月第9卷第l2期 Rev,2007,(1):CD001447. [3】LeBK,PittengerM.Mesenchymalstemcells:progresstowardpromise [J1_Cytotherapy,2005,7(1):36-45. I4]BrooksBR.EIEscorialworldfederationofneurologycriteriaforthedi. agnosisofamyotrophiclateralsclerosis阴.JNeurolSci,1994,124(Supp1): $96. [5]5MazziniL,FayoliF,BoccalettiR,eta1.Stemcelltherapyinamyo-troph— iclateralsclerosis:Amethodologicalapproachinhumans[J】_Amyotroph LateralSclerOtherMotorNeuronDisord,20o3,4(3):158—161. 【6】MazziniL,MareschiK,FerreroI,eta1.Autologousmesenchymalstem cells:clinicalapplicationsinamyotrophiclateralsclerosis叨.NeurolRes, 2oo6,28(5):523—526. [7】KarussisD,KassisI,KurkalliBG,eta1.Immunomodulationandneu? roprotectionwithmesenchymalbonemalTowstemcells(MSCs):apro— posedtreatmentformultiplesclerosisandotherneuroimmunological, neurodegenerativediseases【J].JNeurolSci,2008,265:131—135. 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(收稿日期:2012—02—08本文编辑:郝明明) (上接第51页) 表1矫治前后各项参考指标具体数值(虹) 用功能矫治器在替牙期,恒牙早期对其进行早期矫治被认为 是治疗?类错合的有效手段.目前临床上较为常用的有 Twin—block矫治器,Headgear-Activator矫治器等.Twin—block 矫治器是一种咬合垫.通过上下合垫接触面间的导斜面来转 移咬合力,诱导下颌功能性前移,改善上下颌骨矢状向的不 调.改变自然牙列中承受合力的合斜面的方向,产生有利于 正常颌面生长的矫形力,主要用于AngleII类1分类和An一 e?类?分类正处于生长发育期高峰的患者,临床矫正效 果理想,可以免除患者拔牙的痛苦『l-2]. 当然.Twin—block矫治器亦有一定得适应范围,并不是 昕有的错颌畸形都适用,对于成年患者效果一般.很多学者 研究认为选择在青春发育高峰期到来之前的患者可以取得 满意疗效13],本研究所纳入病例均选择在替牙期或恒牙初期, 基本上都在患者的生长发育高峰期之前或者与其一致的时 段,临床效果证明是可行的.改组患者戴用矫正器后最快3个 月外观即可有明显改善,治疗完成后.38例患者上切牙平均 后移2.8mm,前牙覆盖平均减少4.9mm.下切牙平均前移 2.6mm,磨牙关系在矢状位变化2.3mm.患者侧貌协调,前 牙覆合覆盖正常,咬合关系稳定,患者外形改善理想,满意率 54中国医药导报CHINAMEDlCALHERALD 达到10o%.另据报道Twin—block矫治器不仅对于?类错合 畸形,下颌后缩畸形,伴有或者不伴有上颌前突,牙列不存在 严重拥挤等情形具有良好的作用,而且可以利用反式Twin— block矫治器对?类错合畸形实施治疗.研究中还发现牵引3个 月即可改善?类关系,但此类患者复发机率较大.即使咬合 关系正常后,仍需加夜间牵引3个月,后期随访有3例患者 有轻度复发.下颌较治疗结束时相比又有一定程度的后 缩,因而后期需要更换保持器仍建议加辅助装置以防止复发141. 总的来说,Twin—block矫治器矫治安氏?类错合畸形效 果确切.与牙龈组织相容性良好.不但可以有效地利用下颌 骨向前生长的潜力,而且可以使下颌前移,以致下颌磨牙前 移,改善?类磨牙关系,同时可以使唇向上切牙舌向移动,进 一 步改善深覆盖状况,是一种安全有效的方法[51.患者可以戴 着矫治器进食.戴用比较舒适,对于El腔功能影响较小.只要 病例选择恰当.就能达到恢复正常咬合功能及面貌美的满意 效果,值得临床大力推广. 【参考文献】 [1】ClarkWJ.TheTwinblocktechnique:afunctionalorthopedicapplian clessystem【J].AmOnhodDentotacialOnhop,1988,93(1):1. [2]李怀希,王大为.Twinblock矫治器矫治替牙期?类的研究【J].河北医 学,2008,14(1):37-40. [3】MoseleyHC,Ho~ocksEN,WelfareRR.Useofmodifiedtwinblockapp liancefollowingpartialmaxillectomy:casereport【J】.BrOthod,1996,23 (2):103. 【4】王悦,李锦标,李洪发,等.Twinblock矫治器早期治疗安氏?类1分类 的软硬组织变化[J].口腔正畸学,2006,(3):133—136. [5]武丽坤.?类牵引在安氏?类1分类错颌畸形治疗中的临床运用观 察[J】.当代医学,2011,2(17):44—45. (收稿日期:2011一l2一O8本文编辑:张瑜杰)