第十四章 基因工程制药工艺nullnull第一节 基因工程制药微生物表达系统
第二节 基因工程大肠杆菌的构建技术
第三节 基因工程菌的发酵培养与控制 第十四章 基因工程制药
工艺nullnull第一节 基因工程制药微生物表达系统基因工程制药微生物表达系统null基因工程制药微生物表达系统 基因工程菌:
以微生物为操作对象,通过基因工程技术获得的表达外源基因,过量或抑制表达自身基因的工程生物体。
种类:
大肠杆菌和酵母是重要的表达重组药物的制药生物。 主要是生产重组蛋白质类药物null 细胞:G-,单细胞,杆状。鞭...
nullnull第一节 基因工程制药微生物
达系统
第二节 基因工程大肠杆菌的构建技术
第三节 基因工程菌的发酵培养与控制 第十四章 基因工程制药
工艺nullnull第一节 基因工程制药微生物表达系统基因工程制药微生物表达系统null基因工程制药微生物表达系统 基因工程菌:
以微生物为操作对象,通过基因工程技术获得的表达外源基因,过量或抑制表达自身基因的工程生物体。
种类:
大肠杆菌和酵母是重要的表达重组药物的制药生物。 主要是生产重组蛋白质类药物null 细胞:G-,单细胞,杆状。鞭毛、无芽孢、一般无荚膜。裂殖。
菌落:白色至黄白色,光滑,直径2-3mm。 1、大肠杆菌形态特征 基因工程制药微生物表达系统null 能在仅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的无机盐的极限培养基上生长,发酵糖,产气产酸。
基因工程中使用菌株:K-12株的衍生菌株。
基因组:4.6 Mb,3000多种蛋白质。
染色体DNA为环状双链,核外遗传物质为质粒。 2、生化与遗传特性 基因工程制药微生物表达系统null 3、质粒载体 复制子
选择标记
多克隆位点基因工程制药微生物表达系统首字母: 大写:细菌属名
2-3字母: 小写:细菌种名 如 EcoR 1
4 : 大写: 菌株
1,2…: 分离到酶的次序null 质粒载体的基本特征 自主复制性:
复制子:复制起始点及控制复制频率的调控元件。质粒不依赖于
染色体DNA而自主复制
选择性标记:质粒编码的选择标记,产生一种新的表型,用
于转化体的筛选。抗生素抗性基因,氨苄、四环素、卡那霉素等
多克隆位点:是外源基因插入载体的位置,有多种常见的限
制性内切酶位点序列构成
不相容性:具有相同或相似复制子结构及特征的两种不同质粒
不能稳定地存在于同一宿主细胞内
转移性:从一个宿主细胞转移到另一个宿主细胞/菌。基因工程制药微生物表达系统null 质粒类型 严紧型质粒:在每个宿主细胞只能复制少数几个拷贝的质粒,pSC101
松弛型质粒:在每个细胞中能复制几十至几百个拷贝数的质粒,pMB1和colE1。
克隆质粒:用于克隆和扩增外源基因。
测序质粒:用于基因测序。
整合质粒:用于外源基因与宿主染色体整合。
穿梭质粒:能在两种宿主细胞存在。
表达质粒:能表达基因产物基因工程制药微生物表达系统null4、产物表达形式 不溶性蛋白质:细胞质内形成包涵体
可溶性蛋白质:存在于细胞质
周质表达: 外源蛋白被运输分泌到周质,可溶性。有利于分离和减少蛋白酶降解,避免N端附加蛋氨酸。
胞外分泌表达:胞内可溶性蛋白质分泌到胞外的培养液中。基因工程制药微生物表达系统一种蛋白质不溶性聚集体,包括目标蛋白、菌体蛋白等。目标蛋白一级结构是正确的,但立体结构是错误的,所以没有生物活性。
大肠杆菌中目标产物的表达水平过高,超过正常代谢水平,过多表达产物聚集在细胞内,形成不溶性的包涵体。①蛋白过量积聚,超过溶解度,导致沉淀;
②蛋白生成太快,分子间疏水基团相互作用而聚集沉淀;
③蛋白生成太快,分子内部二硫键的错误连接导致沉淀;
④表达蛋白过多,与其结合/诱导组分不足,不能形成溶解状态
⑤ 蛋白质自身不稳定。null5、优 缺 点 发展最早、应用最广泛的经典的表达系统。
具有遗传背景清楚、目标基因表达水平高(高达70%),培养周期短,抗污染能力强。
不能用于加工修饰化(糖基化、酰胺化)蛋白表达。
细胞死亡后,细胞壁脂多糖游离出来,形成内毒素,具
有抗原性,产生热源。
N端增加的蛋氨酸也容易引起免疫反应。基因工程制药微生物表达系统null6、应 用 大量外源基因能超量的表达,18种药物上市。
多肽类2种(甲状旁腺激素、利尿钠肽)
激素:胰岛素及2种突变体、8种生长素(1种PEG化)
细胞因子类:5种干扰素α、干扰素β和γ,2种G-CSF,白介素-2、白介素-11、白介素-1拮抗剂
溶栓酶类:r-PA
白喉毒素-IL2融合蛋白、OspA脂蛋白(疫苗)等。基因工程制药微生物表达系统null1、形态特征 细胞:单细胞真核生物,球形、椭圆形、卵形。
繁殖:芽殖、裂殖。在特定条件下才产生子囊孢子。
菌落:乳白色,有光泽,边沿整齐。基因工程制药微生物表达系统null2、生长与遗传特征 孢子萌发产生单倍体细胞,两个性别不同的单倍体细
胞结合形成二倍体接合子或营养细胞,进行芽殖。
能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖等。生长繁殖
迅速,倍增期约2小时。
酿酒酵母有17条染色体1996年完成其全基因组测序,
遗传背景已相当清楚。
基因组:120.68Mb,5887个ORF,编码约6000个基因基因工程制药微生物表达系统null3、表达载体 含有复制起始序列或整合序列、选择标记以及由启动、
终止子和信号肽序列构成的表达盒序列。
四种类型:
YIp酵母整合载体
YCp酵母着丝粒载体
YRp酵母复制载体
YEp酵母附加载体 基因工程制药微生物表达系统null4、优缺点 优点:
五种类型的载体,——安全、无毒。
营养缺陷选择外来质粒。
培养条件简单、大规模培养技术成熟。
亚细胞器分化,进行蛋白质的翻译后正确修饰和加工,并具有良好的蛋白质分泌能力。
缺点:
酿酒酵母发酵产生乙醇,制约了高密度发酵。
修饰的蛋白质糖基化侧链过长,会引起副作用。基因工程制药微生物表达系统null5、应用 1981年Hitzman等:酵母表达人干扰素
激素类:6种人胰岛素及1种突变体,尿酸水解酶和水蛭素
细胞因子:GM-CSF和血小板衍生生长因子
多肽类:高血糖素
2种乙肝疫苗等。
8种产品基因工程制药微生物表达系统null第一节 基因工程制药微生物表达系统
第二节 基因工程大肠杆菌的构建技术
第三节 基因工程菌的发酵培养与控制 第十四章 基因工程制药
工艺null基因工程制药基因工程技术-基因重组示意图 DNA片段酶切、
连接,形成重组
DNA分子导入宿主细胞系
统中扩增目标基因表达,
生成新产物,出
现新性状。大肠杆菌的构建技术null第二节 基因工程大肠杆菌的构建技术 基因工程制药大肠杆菌的构建技术null目标基因克隆研究内容研究方法基因工程制药大肠杆菌的构建技术null目标基因:是编码目标蛋白质或多肽的DNA序列。
正确克隆的重要性:只要有一个碱基发生突变,就导致
编码氨基酸的变化,影响产物蛋白质的功能和生物学的
活性。基因工程制药大肠杆菌的构建技术nullRT-PCR克隆目标基因流程 反转录:起始原料RNA
PCR:起始原料DNA基因工程制药大肠杆菌的构建技术null反转录反应的操作 样品变性:75℃水浴5min,冰冷,引物与mRNA配对
反转录:反转录酶42 ℃或37 ℃ ,cDNA第一链,1h
终止反应:使反转录酶失活,95 ℃加热5min反转录酶:RNA依赖的DNA聚合酶,以RNA为
,
dNTP为底物,以DNA为引物,合成与RNA互补的
DNA基因工程制药大肠杆菌的构建技术null引 物 引物最好在模板cDNA的保守区内
引物长度一般在15~30碱基之间
引物GC含量在40%~60%之间,Tm值最好接近72℃
引物3′端要避开密码子的第3位
引物自身及引物之间不应存在互补序列 引物,是一小段单链DNA或RNA,作为DNA复制的起始点,在核酸合成反应时,作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链,在引物的3′-OH上,核苷酸以二酯链形式进行合成,因此引物的3′-OH,必须是游离的。 基因工程制药大肠杆菌的构建技术null1、PCR扩增 (1)PCR技术 PCR (Polymerase chain reaction)
聚合酶链式反应:在DNA聚合酶催化下,对特定的DNA序
列进行的复制反应
本质:生物体DNA复制原理在体外合成DNA
发明者:Mullis,生物技术革命的象征,1993年获得诺贝尔奖基因工程制药大肠杆菌的构建技术null在引物的指导下,以DNA为模板,由DNA聚合酶催化的
扩增特定DNA序列的聚合延伸形成互补序列的反应5′—3′聚合反应PCR基因工程制药大肠杆菌的构建技术null基因工程制药大肠杆菌的构建技术变性
95˚C延伸
72˚C退火
Tm-5˚C(2)PCR单反应原理与过程 打开双链,形成单链引物与模板结合形成新的双链null(2)PCR单反应原理与过程 (1)变性(94℃)(2)退火(55℃)(4)完成一个循环(3)延伸(72℃)基因工程制药大肠杆菌的构建技术null(3)PCR循环 基因工程制药大肠杆菌的构建技术null(4)PCR扩增反应体系组成基因工程制药大肠杆菌的构建技术null(5)PCR扩增产物 基因工程制药大肠杆菌的构建技术null 概念:在特异位点上催化dsDNA分子的断裂,产生相应的限制性片段。
酶切体系组成:目标和质粒DNA,缓冲液,限制性内切酶。
反应条件:适宜温度(37℃),1小时以上。
终止反应:加热;加入EDTA,螯合镁离子。
电泳检查:酶切完全性。2、酶切反应 基因工程制药大肠杆菌的构建技术null粘性末端平头末端基因工程制药大肠杆菌的构建技术null3、连接反应 概念:
DNA 双链上相邻的3′-羟基和5′-磷酸基因共价结合形成3′-5′-磷酸二酯键,使原来断开的DNA缺口重新连接起来。
连接体系:载体片段与基因片段,缓冲液,连接酶。
连接反应:16℃-26℃,数小时,或过夜。
终止反应:在70℃加热10分钟。基因工程制药大肠杆菌的构建技术null基因工程制药大肠杆菌的构建技术null4、转化 转化:把外源基因导入宿主细胞的过程;
某一基因型细胞从周围介质中吸收另一基因型细胞的DNA,使其基因型和表型发生相应变化的现象基因工程制药大肠杆菌的构建技术null大肠杆菌转化——CaCl2法 感受态细胞制备:
将培养液转入离心管中,冰上放置10 分钟,然后于4℃下离心10 分钟。
弃去上清,用预冷的0.05mol/L 的CaCl2 溶液10ml 轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30 分钟后,4℃下,离心10 分钟。
加入连接反应产物:混匀,置冰上30分钟。
热击:42℃,90s; 置冰上,1-2分钟。
扩增培养:加入LB培养基,37℃,45分钟。
涂平板:含有抗生素的LB固体培养基上。
筛选培养:37℃,出现菌落。基因工程制药大肠杆菌的构建技术 感受态细胞制备:E.coli经Cacl2处理(0~5℃),使细胞膜通透性增加,从而具有摄取外源DNA的能力。null5、筛选与鉴定 非转化子:没有导入外源DNA的非转化宿主细胞
转化子:导入外源DNA的转化细胞
非重组子:仅含有空载体分子的转化子
重组子:含有重组DNA分子的转化子
目标重组子:含有连接正确的重组分子(目的)
非目标重组子:不含目的基因重组子转化后的细胞类型基因工程制药大肠杆菌的构建技术null(1)筛选方法 抗生素筛选法:
抗生素的抗性基因,氨苄青霉素。基因工程制药大肠杆菌的构建技术null(1)筛选方法 基因工程制药大肠杆菌的构建技术培养基中含X-gal
X-gal: 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷
β -半乳糖苷酶可以把培养基中无色的X-gal分解成半乳糖和呈蓝色的5-溴-4-氯-靛蓝,使菌落成蓝色 抗生素筛选法:
篮白斑筛选法: lacZ基因,重组子白色,非重组子蓝色。null(1)筛选方法 基因工程制药大肠杆菌的构建技术若LacZ基因被外源DNA插入而破坏,则不能制造半乳糖苷酶,菌落为无色(白色)。null(2)鉴定方法 菌落PCR:含有目标基因
载体大小:电泳检测
酶切鉴定:目标基因插入及插入方向
测序确证:目标基因的序列准确无误基因工程制药大肠杆菌的构建技术null 表达载体概念:
在质粒载体的基础上,在多克隆位点处插入外源基因表达盒所构成。
外源基因表达盒(操纵子模型):基因工程制药大肠杆菌的构建技术null 过程:
适宜宿主菌的转化
筛选鉴定,遗传稳定性等
目标:
获得质粒能稳定遗传、基因能高效和定向表达的载
体,确保药物的生物活性。基因工程制药大肠杆菌的构建技术null不同菌株表达能力不同 同一菌种的不同转化细胞之间存在表达差异
对宿主菌必须进行筛选
目的:获得表达量最大的菌种基因工程制药大肠杆菌的构建技术工程菌表达筛选与产物鉴定 null不同诱导时间下的表达大肠杆菌JM109 在不同诱导时间,取样,
电泳随着诱导时间的延长,
表达量增加。基因工程制药大肠杆菌的构建技术null工程菌的遗传稳定性筛选 原理:以菌种的选择性是否存在,来判断质粒的丢失情况
平板稀释计数
把基因工程菌在有选择剂的培养液中生长到对数期
然后在非选择性培养液中连续培养,在不同时间取菌液稀释后,涂布在固体选择性和非选择性培养基上,倒置培养,菌落计数,计算质粒的丢失率。
平板点种法
菌液涂布在非选择性培养基上,长出菌落后,再接种到选择性培养基上,验证质粒的丢失。基因工程制药大肠杆菌的构建技术null蛋白质存在形式
确定重组蛋白在细胞中的表达部位和存在形式
超声破碎菌体,避免发热
离心,10000rpm,4℃,20min
收集上清液,可能含有可溶性蛋白
将沉淀部分用超声裂解液重悬(含有包含体)
SDS-PAGE鉴定
重组蛋白在上清液中,为可溶性蛋白
重组蛋白在沉淀中,为包含体蛋白
基因工程制药大肠杆菌的构建技术null蛋白质存在形式分析(大肠杆菌DH5α) 结果:蛋白质存在于沉淀中,以包含体的形式表达上清 沉淀 诱导0h 1h 2h 3h 4h 基因工程制药大肠杆菌的构建技术null蛋白质存在形式分析(大肠杆菌JM109)结果:在上清中,可
溶性蛋白质表达诱导前 诱导后 沉淀 上清 基因工程制药大肠杆菌的构建技术null工程菌构件的质量控制 为了确保工程菌构建的有效性,必须遵循GMP及其有关生物制品研究技术指导原则,做好菌种的纪录和管理。基因工程制药大肠杆菌的构建技术null基因工程制药1、表达载体 详细
表达载体,包括基因的来源、克隆和鉴定,表达
载体的构建、结构和遗传性。
载体个部分的来源和功能,如复制子、启动子和终止子的
来源以及抗生素的抗性标记等, 酶切位点及图谱。
必要时,对DNA载体的安全性进行研究,尤其对病毒性启
动子、哺乳动物细胞或病毒终止子的安全性。null基因工程制药2、宿主细胞 详细记录宿主细胞的历史资料,包括细胞株系名称、
来源、传代历史、鉴定结果及基本生物学特性等。
载体转化方法及载体在宿主细胞内的状态及其拷贝
数,工程菌的遗传稳定性及目标基因的表达方法和
表达水平。
宿主细胞株由国家检定机构认可,并建立原始细胞库。null3、目标基因序列 目标基因的序列包括插入基因和表达载体两端控制区的
核苷酸序列,以及所有与表达有关的序列,做到序列
清楚。
基因序列与蛋白质的氨基酸序列一一对应,没有任何差
错。
详细记录目标基因的来源及其克隆过程,图谱和DNA序
列分析确认基因结构正确。
PCR技术:记录扩增模板、引物、酶及反应条件等。
基因改造:记录密码子、被切肽段及拼接方式。
基因工程制药大肠杆菌的构建技术null第一节 基因工程制药微生物表达系统
第二节 基因工程大肠杆菌的构建技术
第三节 基因工程菌的发酵培养与控制 第十四章 基因工程制药
工艺null基因工程制药第三节 基因工程菌的发酵培养与控制 培养与控制null1、碳 源 大肠杆菌:蛋白胨等蛋白质的降解产物作为碳源
酵母:利用葡萄糖、半乳糖等单糖类物质
添加低浓度的单糖和双糖及其其它有机物,如甘油等
对菌体生长具有一定促进作用。
浓度稍高后就表现出底物抑制作用
葡萄糖优先利用会造成培养基的酸化基因工程制药培养与控制null2、氮 源 直接很好地吸收利用铵盐等,一般不能利用硝态氮。几乎
都能利用有机氮源
不同工程菌对氮源利用能力差异很大,具有很高的选择性。
大肠杆菌:利用大分子有机氮源,酵母粉等
酵母:利用氨基酸为氮源基因工程制药培养与控制null3、无机盐 磷、硫、钾、钙、镁、钠等大量元素和铁、铜、锌、
锰、钼等微量元素的盐离子形态
基因工程菌生长提供必须的矿物质基因工程制药培养与控制null4、选择剂 维持工程菌的纯正性和质粒的稳定性的化合物。发酵培
养过程中质粒易丢失,使之成为宿主菌;为了保证质粒
的稳定性,不丢失,根据质粒的标记基因,添加或缺陷
选择剂。选择剂的种类:
工程大肠杆菌:具有抗生素抗性;抗生素作为选择
剂;卡那霉素、氨苄青霉素等
工程酵母菌:是氨基酸营养缺陷型,营养缺陷互补
筛选;缺陷亮氨酸、组氨酸、赖氨酸、色氨酸等。基因工程制药培养与控制null5、诱导物 诱导表达型工程菌:在细胞生长到一定阶段,必须添加
诱导物,以解除目标基因的抑制状态,活化基因,进行
转录和翻译,生成产物。
诱导物成为产物表达必不可少的物质
Lau启动子表达系统:IPTG诱导
甲基营养性酵母:假如甲醇进行诱导。基因工程制药培养与控制null 温度
DO
pH基因工程制药培养与控制null1、温 度 大肠杆菌和酵母生长最低温度为10℃
大肠杆菌生长最适温度为37℃,最高温度为45℃
酿酒酵母:生长最适温度为30℃,最高温度为40℃基因工程制药培养与控制符合三基点原则:最低、最适、最高null温度对工程菌产物合成的影响 生长与生产温度不一致
较高温度表达量达,易形成包涵体
策略:较低温度下有利于表达可溶性蛋白质
对于热敏感的蛋白质,高温会降解破坏
策略:生产期可采用先高温,后低温,变温
表达,避免蛋白质降解基因工程制药培养与控制null温度控制 两端变温发酵培养:
前期; 较高温度发酵,获得足够高的菌体密度
后期:较低温度发酵,对菌体合成目标产物抑制不明显,
但可有效抑制目标产物的降解和包涵体形成,总体提高
工程菌的生产能力。
温度诱导型大肠杆菌表达系统:生长维持37℃,生产期
提高温度为42℃基因工程制药培养与控制null2、pH值对发酵的影响 细菌喜欢偏碱性,真菌偏酸性
影响产物稳定性,最适生长和生产批pH不同
干扰素是在酸性条件下稳定,而在碱性条件下容易被
降解。基因工程制药培养与控制null 一般情况下,目标产物对宿主菌是不利的
通用策略:诱导表达
根据启动子类型和目标产物表达调控模式而定
当产最大时,结束发酵基因工程制药培养与控制null思考题:
1、表达质粒载体的基本特征
2、酵母含有那四类表达载体
3、基因工程大肠杆菌构建的基本过程
4、工程菌的筛选鉴定
5、工程菌的质量控制
6、基因工程菌发酵培养基的组成
基因工程制药培养与控制
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