蜡质芽孢杆菌34_16菌株对苏云金芽孢杆菌增效作用机制初步探讨

蜡质芽孢杆菌 34216 菌株对苏云金芽孢杆菌 增效作用机制初步探讨 Ξ 阮丽芳 ,林开春 (华中农业大学植物保护系 ,湖北武汉 430070) 摘要 :34216 菌株是一株对 Bt 具有明显增效作用的蜡质芽孢杆菌。对 34216 菌株的营养体和芽孢 及其发酵上清液进行增效作用测定 ,结果明 34216 菌株的芽孢有明显增效活性。用紫外线处理 的 34216 菌株的死芽孢也具明显增效活性 ,推断此增效因子为细胞结构物质。将死芽孢用胃蛋白 酶、胰蛋白酶处理后 ,不具增效活性 ,进一步推断增效物质为蛋白类物质。作者将该蛋白质暂命名 为 Protein R。 关键词 :苏云金芽孢杆菌 ;增效 ;34216 菌株 ; Protein R ;蛋白酶 中图分类号 :Q939. 124 　　文献标识码 :A 　　文章编号 :100325125 (2000) SI20120206 Bt 杀虫剂是目前世界上应用最广的微生物杀虫剂 ,在农林、卫生及仓贮害虫的综合防治 中占有重要地位。由于常规 Bt 杀虫剂与化学杀虫剂相比尚存在许多弱点 ,例如 :苏云金杆菌 对鳞翅目夜蛾科害虫的毒力一般较低 ,而许多夜蛾科害虫又是农业生产上危害严重的害虫 ,如 棉铃虫 ( Heliothis armigera) 、甜菜夜蛾 ( L aphygm a exigua) 等。因此 ,如何提高苏云金杆菌对 夜蛾科害虫的毒力已日益引起人们的重视。通过生物增强因子提高 Bt 对夜蛾科害虫毒力是 一条很有效的方法。首先 ,增强因子研究的针对性强 ,目的明确 ,增效效果往往是显著的。其 次 ,苏云金杆菌增强因子不仅存在于苏云金杆菌菌株的代谢产物中 ,而且可在其它生物或它们 的代谢产物中寻找到。 美国康乃尔大学昆虫研究学者 Tanada 等发现一点粘虫 ( Pseudalitia uni puncta) 的颗粒体 病毒 ( GVS)对该虫的两种杆状病毒有增效作用。起增效作用的颗粒体病毒基因编码一类蛋白 质 ,该蛋白与其它已知的蛋白无同源性 , Tanada 于 1993 年将其命名为 enhancins ,并将其与 Bt 复配 ,增效效果令人满意[8 ] 。Eric. V. stabb 等研究发现 ,部分蜡状芽孢杆菌 ( B acill us cereus) 产生一种水溶性物质 ZwittermicinA ,该物质能增强蜡质芽孢杆菌抑制由 Phytophthora med2 icaginis 引起苜蓿猝倒病。进一步研究发现 ,苏云菌杆菌某些菌株也可产生该物质[6 ] 。 Manker 等发现 ,HD21 菌株能够产生一种很像 Zwittermicin A 的物质 ,该物质与 Bt 复配 ,能加 剧敏感昆虫中肠上皮细胞受体孔道的形成 ,增强伴孢晶体的作用效果[7 ] 。 本文主要报道 34216 菌株对 Bt 增效作用机制的初步探讨。 021 　　　 Ξ 收稿日期 :2000210212台湾联因股份有限公司资助课。 　作者简介 :阮丽芳 (1974 年 - ) ,女 ,现为武汉大学生命科学技术学院博士研究生 　　　　　杀虫微生物专刊 中 国 病 毒 学 Special Issue 　　　　　 2000 年 15 卷 V IROLO GICA 　SIN ICA Nov. 2000 1 　与方法 1. 1 　材料 34216 菌株 ,本实验室分离得到并保藏。棉铃虫由湖北省农业科学院 B T 中心提供 ,以初孵幼虫为供试昆 虫。胰蛋白酶酶活 :1 000 单位/ mg 美国斯格玛公司生产。胃蛋白酶比活 :1∶2 500 美国斯格玛公司生产。供 试苏云金杆菌品 :BtCS3ab291 效价 15 000 IU/ mg 生产菌株为 B . thti rinngiensls subsp . Kurstaki HD21 ,血 清型 H3a3b ,湖北农科院 Bt 中心提供。Bt8010 效价 6 618 IU/ mg 生产菌株为 B. thuringiensis subsp . Kurstaki LB22 菌株 ,血清型 H3a3b。河南省商丘地区生化厂生产。 1. 2 　方法 1. 2. 1 　生测方法 增效活性测定方法 :按混合饲料法感染各种试虫 ,染毒 72 小时检查结果。用最小二乘法分别计算各样品 的 LC50值。然后按 Sun2Jonhson 毒力指数法分别计算各种混剂的共毒系数 (Cotoxicity coeffient 简称 CTC) 。 当 CTC值 ≥120 时 ,表明增效活性明显 ;CTC ≤80 为拮抗作用 ;当 CTC值在 802120 为相加作用。 发酵上清液增效活性测定方法 :待测菌株培养方法同上。发酵液离心收集上清液 ,将上清用细菌过滤器 过滤 (孔径 :0. 22μm 规格 :<25 mm) 。定量取滤液测定其增效活性。按上述方法 ,求出 LC50及 CTC值。 1. 2. 2 　芽孢致死方法 紫外线照射处理 :用无菌水将培养好的芽孢稀释成 109/ mL 的悬浮液 ,置于大培养皿中 ,液层深度小于 2 mm。用 30 瓦紫外灯处理数小时 (距离紫外灯 28 cm) ,照射过程中不断搅拌。稀释平板计数法计算死亡率。 将致死芽孢离心洗涤三次 ,收集菌体 ,冻干成粉。 蛋白酶处理死芽孢 :0. 1 g 芽孢 (干重)用 100 mL 磷酸缓冲液 (p H = 8. 1) 制成菌悬液 ,加入事先已溶于 20 mL 双蒸水中的 0. 2 g 胰蛋白酶 ,放入 37 ℃水浴锅中处理 5 h ,水浴过程中定时搅动 ,以使反应完全。处理完毕 后离心洗涤三次制成干粉。 胃蛋白酶处理方法 :0. 1 g 芽孢 (干重)用 100 mL 醋酸缓冲液 (p H = 2. 0) 制成菌悬液 ,加入事先已溶于 20 mL 双蒸水中的 0. 2 g 胃蛋白酶 ,放入 37 ℃水浴锅中处理 2 h ,水浴过程中不断搅拌。处理完后离心洗涤三次 , 冻干。 胃蛋白酶和胰蛋白酶共同处理 :先用胃蛋白酶处理 ,离心洗涤三次后再用胰蛋白酶过程 ,方法同上。经过 2 种蛋白酶水解过的芽孢用冻干机冻干。 2 　结果与分析 2 . 1 　34216 菌株营养体与芽孢增效活性比较 34216 菌株为蜡质芽孢杆菌 ,整个菌株的生长发育分为两个阶段 :即营养体阶段和芽孢阶 段。通过控制 34216 菌株摇瓶培养时间分别收集营养体及芽孢 ,进行增效活性的生物测定。 具体结果见表 1。 由表 1 可知 ,34216 菌株营养体及芽孢对棉铃虫均无毒性。营养体与 Bt 的 3 种混剂均表 现为相加作用。而 34216 菌株芽孢对 Bt 复配的 3 种混剂的 CTC 值均大于 120 ,且最大值为 170 , 34216 芽孢对 Bt 有增效活性。 2 . 2 　34216 营养体和芽孢生长期的发酵上清液增效活性测定结果 将 34216 菌株营养体和芽孢生长期的发酵上清液进行增效活性测定 ,结果表明无论是 342 16 菌株的营养体阶段还是芽孢形成阶段发酵上清液均不具备增效活性。 121杀虫微生物专刊 　　阮丽芳等 :蜡质芽孢杆菌 34216 菌株对苏云金芽孢杆菌增效作用机制初步探讨 表 1 　34216 菌株营养体及芽孢与 CS3ab291 不同配比的混剂对棉铃虫共毒系数比较 处理 复配比例(CS3ab291 :待测菌) LC50 (μg/ mL) CTC 值 营 养 体 CS3ab291 单剂 109. 53 34216 单剂 无毒 混剂 1 1∶1 133. 91 81. 87 混剂 2 20∶1 129. 65 88. 65 混剂 3 50∶1 100. 26 108. 75 芽 孢 34216 单剂 无毒 混剂 1 1∶1 88. 16 130. 79 混剂 2 20∶1 71. 16 155. 38 混剂 3 50∶1 64. 46 170. 12 2. 3 　UV处理剂量与 34216 死芽孢增效活性的关系 紫外线处理芽孢的死亡率与处理时间长短成正相关 ,结果见表 2。 表 2 　紫外线照射剂量与芽孢死亡率关系 处理 菌悬液深度(mm) 含菌量 (菌数/ ml) 照射时间 (h) 含菌量 (菌数/ mL) 死亡率 ( %) a 1. 5 109 1 0. 9 ×108 91. 00 b 1. 5 109 2 1. 2 ×107 98. 80 c 1. 5 109 3 1. 10 ×106 99. 89 d 1. 5 109 4 3. 60 ×105 99. 96 e 1. 5 109 5 1. 07 ×105 99. 99 表 3 　不同处理后的死芽孢及活芽孢分别与 B. t. CS3ab291 不同配比的混剂对棉铃虫共毒系数比较 处　　理 复配比例 LC50 (μg/ mL) CTC 值 CS3ab291 单剂 96. 69 处理 b 混剂 1 1∶1 70. 31 137. 52 混剂 2 50∶1 66. 53 145. 33 处理 c 混剂 1 1∶1 76. 73 126. 01 混剂 2 50∶1 80. 34 120. 35 处理 d 混剂 1 1∶1 81. 91 117. 96 混剂 2 50∶1 84. 22 114. 81 处理 e 混剂 1 1∶1 103. 65 93. 29 混剂 2 50∶1 158. 98 60. 82 活芽孢 混剂 1 1∶1 50. 51 193. 34 混剂 2 50∶1 35. 38 273. 29 将表 2 中的处理 b c d e 分别离心洗 涤 ,收集菌体 ,然后分别进行增效活性的生 物测定 ,所有的处理均采用 1∶1 和 1∶50 两 种比例 ,结果见表 3。 从表 3 数据可看出 ,处理 b、处理 C 与 BtCS3ab291 混配两个混剂的 CTC 值均大 于 120 ,对 B. t . CS3ab 具明显增效作用。 处理 d 处 BtCS3ab291 混配的两个混剂的 CTC 值分别为 117. 96 和 114. 81 , 对 CS3ab291 增效作用不够明显。处理 e 与 B. t . CS3ab291 混配的两个混剂的 CTC 值 分别为 93 29 和 60. 82 ,对 Bt 已无增效活 性。 2. 4 　UV致死的 34216 芽孢对 B. t. CS3ab2 91 和 B. t. 8010 的增效试验结果比较 将用 UV 照射 3 小时致死的死芽孢分 别与 BtCS3ab291 与 Bt8010 进行混配 ,测 定其对 BtCS3ab291 及 Bt8010 的增效活性 ,详见表 4 和表 5。 221 中 　国 　病 　毒 　学 　　　　　　　　　　　　　2000 年第 15 卷 表 4 　死芽孢及活芽孢与 CS3ab291 不同配比的混剂对棉铃虫共毒系数比较 处　理 复配比例(CS3ab291 :待测菌) LC50 (μg/ mL) CTC 值 死 芽 孢 CS3ab291 单剂 108. 00 混剂 1 1∶1 88. 81 121. 61 混剂 2 10∶1 83. 97 128. 62 混剂 3 20∶1 81. 80 132. 03 混剂 4 50∶1 91. 65 117. 84 活 芽 孢 混剂 1 1∶1 84. 24 128. 00 混剂 2 10∶1 76. 66 140. 88 混剂 3 20∶1 68. 36 157. 99 混剂 4 50∶1 40. 98 263. 50 表 5 　死芽孢及活芽孢与 8010 不同配比之混剂对棉铃虫共毒系数比较 处　理 复配比例 LC50 (μg/ mL) CTC 值 死 芽 孢 Bt8010 单剂 201. 28 混剂 1 1∶1 160. 08 127. 42 混剂 2 10∶1 132. 14 153. 32 混剂 3 20∶1 127. 18 157. 02 混剂 4 50∶1 144. 25 141. 48 活 芽 孢 混剂 1 1∶1 126. 26 159. 26 混剂 2 10∶1 109. 86 183. 51 混剂 3 20∶1 86. 66 235. 96 混剂 4 50∶1 55. 58 368. 06 综合表 5 及表 6 结果可知 ,死芽孢与 8010 复配的混剂的 CTC 值均大于其与 CS3ab291 复 配的相对应混剂的 CTC 值 ,证明紫外线致死芽孢对 8010 的增效活性优于对 CS3ab291 的增效 活性。 2. 5 　经蛋白酶处理后的 34216 芽孢对 Bt 增效试验结果 为确定 34216 芽孢的具增效活性物质的是不是一种蛋白质 ,我们将紫外线处理致死但仍 具明显增效活性的芽孢用不同蛋白酶处理 ,测定酶解后的死芽孢的增效活性。采用了胃蛋白 酶及胰蛋白酶共同处理和胃蛋白酶、胰蛋白酶分别单独处理 3 种处理方法 ,结果见表 6。 不同蛋白酶处理过的死芽孢与 Bt 混配的所有混剂的 CTC 值均小于 120 ,表明对 Bt8010 均无增效活性 ,而未经蛋白酶处理的死芽孢与 Bt 混配的混剂的 CTC 值均大于 120 ,对 Bt8010 有增效活性。 3 　讨论 初步证明 34216 菌株的增效活性物质为芽孢表面的蛋白类物质。我们将这种物质暂时命 名为 protein R。通过比较不同蛋白酶处理后的死芽孢的 CTC 值表明 ,此蛋白类物质对酸性蛋 白酶较对碱性蛋白酶敏感。 分析表 3、表 4 和表 5 的数据可以看出 ,UV 不仅可以杀死 34216 的芽孢 ,而且也可以使增 效物质失去增效活性。死芽孢的增效活性与紫外线处理时间呈负相关。在本试验条件下紫外 线照射时间在 3 h 以内主要是致死芽孢 ,增效物质失活不严重 ,照射 4 h 以上 ,增效活性的物质 321杀虫微生物专刊 　　阮丽芳等 :蜡质芽孢杆菌 34216 菌株对苏云金芽孢杆菌增效作用机制初步探讨 基本上失去活性 ,此种情况下的死芽孢对 Bt 不增效。 表 6 　不同蛋白酶处理的死芽孢与未处理的死芽孢 与 8010 不同配比的混剂对棉铃虫共毒系数比较 处　理 复配比例 LC50 (μg/ mL) CTC 值 Bt8010 单剂 290. 47 样品 A 混剂 1 20∶1 341. 20 85. 30 混剂 2 50∶1 368. 21 76. 33 样品 B 混剂 1 20∶1 319. 92 93. 50 混剂 2 50∶1 384. 90 76. 93 样品 C 混剂 1 20∶1 277. 68 104. 05 混剂 2 50∶1 255. 95 110. 16 样品 D 混剂 1 20∶1 160. 00 166. 35 混剂 2 50∶1 182. 07 147. 96 　　注 :样品 A :胃蛋白酶处理　样品 B :胃蛋白酶与胰蛋白酶共同处理 样品 C :胰蛋白酶处理　样品 D :未经蛋白酶处理的紫外线致死芽孢 (死亡率为 99. 89 %) 采用紫外线处理 34216 菌株致死后的芽孢对BtCS3ab291 及Bt8010 均有增效活性 ,其中对 Bt8010 的增效活性较显著 ,最大 CTC 值为 157. 02。表明 34216 菌株的增效活性物质对较低 毒力的 Bt 菌株具有较高的增效活性。 与 Tanada 等的研究结果比较 ,增效因子 protein R 及 enhancins 均是蛋白类物质 ,但是来 源不同 ;与 Eric. V. stabb 等研究发现的一种水溶性物2ZwittermicinA 增效因子比较 ,protein R 及 ZwittermicinA 均来源于蜡质芽孢杆菌 ( B acill us cereus) ,但前者为细胞结构物质 ,后者为细 胞代谢产物。 进一步深入研究 34216 菌株的增效因子 ,可将此蛋白提纯并进而验证上述推测。我们也 可将此实验深入到分子水平 ,将表达增效活性的蛋白类物质的目的基因找到并进行克隆 ,再转 入到高毒力的 Bt 菌株中 ,从而提高 Bt 产品对夜蛾科害虫的杀虫效力。或者将目的基因转入 宿主细胞 ,通过在目的基因前插入强启动子 ,大量产生 Protein R。 参 考 文 献 [ 1 ] 　林开春、游红. 武汉市效环境微生物中 Bt 增效细菌调查和筛选[J ] . 武汉大学学报 (自然科学版)杀虫微生物专刊 ,1998 [ 2 ] 　申继忠、钱传范. 苏云金杆菌杀虫剂增效途径研究进展[J ] . 生物防治通报 ,1994 ,10 (3) :135 - 140 [ 3 ] 　Corsaro B G , et al . Baculovirus enhancing Proteins as determinants of viral pathogenesis[ M ] . Parasites and Pathogens of In2 sects ,1993 ,2 ,Pathogens [4 ] 　Eric V stabb , et al . Zwittermicin A2Producing strains of Bacill us cereus from diverse soils[J ] . Applied and Environmental Microbiology , 1994 ,60 (12) :4404 - 4412 [ 5 ] 　Haiyin , Laura A , Silo2Suh , et al . Zwittermicin A , an antifungal and plant protection agent from Bacill us cereus[J ] . 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The lethal spore treated by UV radiation have remarkable synergism. It is infered that the enhansis is a kind of st ructure material of cell. The lethal spore that have synergism enzymolysised independently by pepsin or t rypsin have not synergism. The result indicates that the synergistic substance is a kind of protein. this kind of protein The writer named this protein Protein R. Key word : B acill us thuringiensis ; Synergism ; 34216 strain ; Protein R ; Protease 521杀虫微生物专刊 　　阮丽芳等 :蜡质芽孢杆菌 34216 菌株对苏云金芽孢杆菌增效作用机制初步探讨