苏云金芽孢杆菌几丁质酶的研究进展

© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 年 微 生 物 学 通 报 苏云金芽抱杆菌几丁质酶的研究进展 ‘ 卢 伟 蔡 峻 陈月华“ 南开大学生命科学学院微生物学系天津市微生物功能基因组学重点实验室 天津 以洲 摘要 苏云金芽抱杆菌制剂作为无公害农药已经得到社会的认可 , 如果再开发其几丁质酶抑制真菌和杀虫增效 功能 , 不仅可充分利用这一农业微生物菌种资源 , 也将给予传统生物农药以新的生命力 。 综述 了苏云金芽饱丰 菌几丁质酶方面研究的国内外最新进展 。 关键词 苏云金芽饱杆菌 , 几丁质酶 中图分类号 文献标识码 文章编号 一 《 刁 一 ’ 一 ‘ 口印 月 , 明 , 己 必 二 , ‘ , 。 了 , 人尸、 玩 脚比八劝讯 侧。朋 叹 次 , 确示 以月 , 目 , ,“ 八叮 “ , 叩 一。 · , 。。 一 ￡ 泌 咭比 臼 卜 一 一 〔 脚 肆 ‘ ￡咭 心 一 召。‘沼公 认 月君王‘邢钻 , 几丁质酶在生物防治方面有两大用途 其一 可以防治真菌病害 。 因为除卵菌外所有真菌的细 胞壁都含有几 丁质 , 通过水解细胞壁的几丁质可 有效的抑制真菌的生长川 。 其二 , 对杀虫剂有增 效作用 。 几丁质是昆虫中肠 围食膜的主要结构成 分 。 围食膜是昆虫抵御细菌和病毒的屏障 , 被几 丁质酶破坏后 , 可 加 速 害虫 的催病进 程 。 因此 , 与生物农药一起施用 , 显著提高防治植物病虫害 的效果 ’ 。 苏云 金 芽抱 杆 菌 简称 商品制剂 , 作为最重要 的生物杀虫剂 , 已 成 功用于多种农 、 林 、 果蔬 和卫生 害虫 的防治 , 且 在减少化学杀虫剂的污染和植物保护中起到 了重 要作用 。 许多学者致力 于 几丁质酶的研究 , 其 目的是为了扩大 制剂的作用范围 , 进一步提高 杀虫活性 。 近几年来 , 关于几丁质酶在苏云金芽 ‘ 国家自然科学基金资助项 目 天津市 自然科学基金资助项 目 ’ 通讯作者 一 , 一 收稿 日期 《 汤刁 一 , 修回 日期 〔沁 刃 抱杆菌的分布 、 酶的产生 条件 、 酶的性 质 与结构 、 几丁质酶基 因的克隆 、 几丁质酶在生物防治中 的作用等方面的研究逐渐增加 。 本文就上述 作简单综述 , 以期为苏云金芽抱杆菌几丁质酶方 面更加广泛和深入的研究提供参考 。 几丁质酶及其基因的分布 筛选产几丁质酶菌株最常用 的方法是制备 以 胶体几丁质为唯一碳源的琼脂平板 , 通过 观察水 解圈的有无及大小 , 初步确定 菌株分解几 丁质的 能力 。 近年来 , 有几个实验室 利用这 一方法检测 了几丁质酶在苏云金芽抱杆菌中的分布 。 由于所 用培养基不 完全一致 , 检测 的菌株有 多有 少 , 因 此检出阳性率也有一定的差别 。 见 。 由表 可见 , 筛选 到产几丁质酶的 菌株的 阳性率在 一 之间 , 差别比较大 。 笔者 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 微 生 物 学 通 报 年 认为主要原因是培养基中除几丁质外的其他成分 。 诱导 。 而 ’〕等人利用营养肉汤加胶体几丁质 多数实验室 利用无机盐加胶体几丁质平板筛选 , 筛选的阳性率仅 。 营养肉汤含有细菌生长所 阳性率都超过 。 本室也是利用这种培养基 , 需的碳源 。 按照细胞代谢调节的规律 , 对于非组 筛选 了 菌株 余株 , 阳性率为 另文报 成型表达几丁质酶的菌株而言 , 就不会再去合成 道 。 因为在这种培养基上 , 除几丁质外无任何碳 该酶 , 导致检出率低 。 源可以利用 , 菌体产几丁质酶的能力得到了充分 表 几丁质酶的分布检测 平板培养基组成 — 检测的 菌株总数 阳性率 作 者 胶体几丁质 其他成分 营养肉汤 , ‘ ’囚, 无机盐 无机盐 无机盐 以 巴丈 一 等〔’〕检测 了 个不 同血清型的 菌株 , 几乎包含 了 所有 的血清型 。 但是属 于 血清 、 、 和 的菌株均为几丁质酶阴性 , 而这 个 血清型的多株菌 的几丁质酶基 因序列 已被测定 。 本室检测也发现 , 属 同一血清型的不 同菌株 , 几 丁质酶检测结果完全相反 , 未发现有任何规 律 。 由此可见 , 菌株的血清型与几丁质酶的产生没 有必然联系 。 林 毅等 ’〕利用的一对几 丁质酶基 因引 物 , 以 巧 株不同血清型的苏云金芽抱杆菌 为 模板 , 扩增几 丁质酶全长基因 , 发现有 个菌株 存在该基因 , 阳性率达 。 这与多数学者对 几 丁质酶的检测结果基本一致 。 由此证明超过 的 菌株能产生几丁质酶 。 但是 , 有些学者认为平板筛选方法有很大局 限性 〔’ 。 因为几丁质酶在其性质 、 酶反应条件及 其能否分泌到胞外等方面存在差异 。 而特异引物 方法也可能因为不 同几丁质酶基 因中引物 匹 配度的原 因造成一些漏检 , 或者检出沉默基 因 。 因此 , 笔者认为对于研究 菌株几丁质酶的分布 情况 , 需要利用平板筛选和 检测的复合方法 。 酶的条件进行了研究 。 他们发现 , 不加诱导物时 几丁质酶的产量很低或几乎没有 。 而在诱导物中 , 细粉几丁质效果最佳 , 一 已酞葡萄糖则会强烈的抑 制几丁质酶的合成 。 在培养基 中加入各种碳源后 几丁质酶的产量都会明显减少 。 无机氮源对酶量 的提高基本上没有作用 , 而有机氮源都能大幅度 提高酶的产量 , 尤其是蛋白陈和酵母膏 。 与此相 反 , 等 ’ 〕发现了能组成型表达几丁质酶的 一 菌株 , 几丁质酶的产量和诱导物无关 , 甚至 在葡萄糖存在的情况下也能产生几丁质酶 。 在 目前的研究中 , 多数产几丁质酶的 菌株 都是在有诱导物的平板上筛选 出来的 , 这些菌株 在没有诱导物存在的情况下是否能够合成几丁质 酶 , 目前尚无这方面的研究结果 。 几丁质酶的合成条件研究 和其他产几丁质酶的微生物一样 , 几丁质 酶通常也认为是诱导酶 , 一般认为几丁质或除几 丁质单糖以外的几 丁质水解产物都可 以作为诱导 物 。 而碳氮源 , 、 温度等培养条件则一般认为 与 的最佳培养条件相同 。 李 力 〔 〕和祈红兵等〔’〕人分别就 产几 丁质 几丁质酶的理化性质 几丁质酶按照底物和酶切方式的不 同 , 分为 内切和外切几 丁质酶 。 已报道的 几 丁质酶中 , 外切酶多于内切酶 。 外切酶的产物即有几 丁单糖 也有几丁二糖 ‘ , ’“ , ” , ” 〕。 几丁质酶作用的最适温 度是 ℃左右 , 最适 偏中性 , 与大多数细菌几 丁质酶最适 一 之间相符 ” 。 。 等 ” 通过在 石 表达 几丁质酶基 因 , 得到纯化的几丁质酶 。 这种酶最适 为 , 最 适温度为 ℃ 。 但在 一 , ℃ 一 ℃都表 现有不 同程度的活性 , 甚 至在 时 , 仍然有 的活性 。 而 ’ 等人发现 , 所检测的 株 条件下产几丁质酶的 中有 株在 的平板上仍有酶活性 。 由于昆虫中肠的碱性环境 , © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 年 微 生 物 学 通 报 人们通常认为相 比酸性和 中性几丁质酶 , 碱性几 丁质酶对杀虫增效作用可能更为明显 〔” 〕。 几丁质酶基因和酶的分子生物学研究 几丁质酶基 因及其核酸序 列特点 目前 中已收录几丁质酶基因序列 的 的 个 亚种 个菌株 表 , 其中 个序列为我国学者 提供 , ’ , 。 表 已克隆几丁质酶基因的苏云金芽抱杆菌 亚种 、 血清型及其基因大小 亚种 基因登陆号 、礴 、 、 、滩 相 同 , 一 序 列 为 ’ ’ , 一 序 列 为 ’ ’ , 转录终止密码子 下游有 一重复序列认为可能是转录终止子 〔‘ 。 研究表明 , 它们的启动子和枯草杆菌营养期的 二 因子所识别 的启动子及 理 基 因的启动子有同源性 , 而 与 中依赖芽抱形成的 基因启动子 和 没有同源性 。 并且有学者通过几丁质酶合成曲线 , 也证明 几丁质酶的产生是从营养期开始 与芽抱 的形成无关 , , 。 几丁质酶的氨基酸序列 几丁质酶分为 个区域 , 从 端开始依次分别为 几丁质酶催化 区 , 粘蛋 白 型 同源 区 一 , 和 几 丁 质 结 合 区 一 飞 , 。 几丁质酶通常为胞外酶 , 因此儿丁质酶 端部分都有信号肤 。 信号肤 信号肤与几丁质酶的分泌有关 。 笔者将表 中 个 几丁质酶信号肤的氨基酸序 列进行了比较 , 发现它们完全一致 , 端都有符合 一般信号肤特征的蛋自质序列 。 几丁质酶催化区域 催化区域是几丁质酶水 解几丁质的区域 。 几丁质酶的催化区域和糖水解 酶 家族的典型活性基序列同源 ’ , 且 不同菌 株之间几丁质酶催化区域的同源性很高 见图 。 几 丁质酶 序列 号 的 门勺︸、,﹄,︸勺︸勺‘,﹄,‘勺︸ ”之 “ 了妙 凌似必 了 口 码 二刀 口王 尸“ 乙 臼 不详 血清型 表 中大部分 的 几 丁质酶基 因的 是 , 或 , , 只有两 个不 同 , 分别为 尸 的 , 和 另外 一 个 , 。 等 ‘。 在 一 中得到的几丁质酶基因 大小为 , , 与上述 几丁质酶基因大小相差较大 。 但 中没有该序列 。 上述几丁质酶基 因序列 的同源性很高 。 通过 比较 发 现 , 的 、 尸 的 和 叮 的 认 , 都具有相同的 序 列 ’ ’ , 且它们启动子的保守序列完全 , 置 , 一 , 一 个氨基酸 图 中箭头所指位 被认为对于催化有着重要的作用 参与了几丁质酶的酸碱催化 。 其他 质酶相应位点也完全相同 。 , 一 叮能 株 图左侧为 刀 ” , , 山 图 株 几丁质酶催化区氨基酸序列比较 几丁质酶在 中相应的蛋白质序列号 , 图中小方框表示不相同的氨基酸 , , 艺 ,‘二川护 , 。 , 尸 比￡ , “ 尸扮 , © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 微 生 物 学 通 报 年 粘蛋白 型同源区 区域在 降解不同类型 的不可溶多聚物的酶 中发现 , 如细 菌的几丁质酶 、 纤维素酶和淀粉酶 。 可能和 酶 与底物的结合有关 ” 〕。 在 。 中 , 典型的芳香 族氨基酸是非常保守的 。 几丁质酶的 同源 性也很高 , 表 的 个 几丁质酶中 , 除 的 只有一个 ” 〕外 , 其余 个 几丁质酶都有两个 。 这 个 几 质酶 的第一个 与其他细菌 的 同源性较低 , 但是它们之间的同源性很高 , 除极个别外 , 几乎 完全一致 未列 比较图 。 它们的第二个 与 其他细菌几丁质酶同源性较高而相互之间有些差 异 见图 。 图 株 几丁质酶 氨基酸序列比较 几丁质酶结合域 几丁质酶的 对于酶结合底物起到重要的作用 , 也有一些 这一 区域高度保守 , 特别是芳香族氨基酸 , 并且 几丁质酶的这个区域参与了底物的水解 。 在木聚糖酶 、 纤维素酶的相应区域都存在 图 。 图 株 几丁质酶结合区域氨基酸序列 比较 并非所有的 几丁质酶都有通常的 个结构 几 丁质酶抑真菌研究 目前处 于初始阶段 , 域 。 例如 , 只有几 丁质酶催化域 , 而 缺少 研究论文还很少 。 等 ’ 〕诱变 巧 后筛 , 和 , 但是这不 影 响它 的活性 ’ , 因此 选出一株高产几丁质酶 、 广谱抑制真菌的突变菌 和 并不是水解几丁质所必需的 , 这种情 株 , 并于 年申报了菌株及其基因的专利 。 后 况在其他微生物的几丁质酶中也存在 。 来 , 等困 也发现产几 丁质酶菌株 几丁质酶在杀虫增效和抑制真菌方面 的应用 年英国学者 ’ 率先用 站 站 邢 和 两菌株所产生的几丁质酶对蚊 幼和海灰翅夜蛾的杀虫增效作用分别进行了研究 。 实验运用 了一种特异的几 丁质酶抑制剂阿洛氨菌 素 , 在生测 系统 中通过对 比实验证 明几丁质酶在杀虫活性上 的增效作用 。 随后有多 组学者分别证明了 几丁质酶对小菜蛾 、 埃及伊 蚊的杀虫增效作用 〔’ , , · ” 。 。 等〔’“ 〕在大肠杆菌 中克隆了 一 的几丁质酶基因 , 发现表达的几丁 质酶能够增效 的营养期杀虫 蛋 白对斜纹 夜蛾 幼虫的毒力 , 使得 降低 。 的发酵上清 , 对黑曲霉有很强的抑制作用 。 有报 道称绝大多数的细菌性几丁质酶属于糖水解酶 家族 , 其主要 功能是分解周 围环境 中的几 丁质 , 以满足其 自身对营养的需求 , 而对真菌的抑制能 力较弱或无 〔” 〕。 无论杀虫还是抑真菌试验 , 多数 研究均采用粗几丁质酶或发酵的上清液 , 因此有 些学者认为 , 这些杀虫和抑真菌的作用也不能排 除粗酶和培养液中的其他活性成分所起的作用 。 总之 , 该方面的研究深度和广度都不够 , 缺 乏系统的研究论文 。 目前存在的问和展望 几丁质酶的研究 与应用处 于初始阶段 , 缺 少具有深入 和系统的研究结论 。 目前在研究中要 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 年 微 生 物 学 通 报 注意的问题有 以下几方面 。 首先 , 需要筛选高产 几丁质酶的 菌株 。 在已报道的 菌株中 , 其几 丁质酶的活性与其他芽抱杆菌相 比并不是很 高 。 另外需要加强 几丁质酶杀虫增效及抑制真菌方 面研究 , 进一 步明确几 丁质酶的作用 。 其次 , 要 对 几丁质酶的表达方式进行研究 , 以确定其是 诱导型酶还是组成型酶 , 以及 几丁质酶的合成 是否与传统 发酵工艺相吻合 。 总之 , 苏云金芽 抱杆菌几丁质酶的应用 基础研究还需要更加系统 和深人 。 参考文献 【 郑爱萍 , 李 平 中国生物杂志 , , 〔 邱立 友 , 王 明道 , 戚元 成 , 等 微 生 物学通 报 , 侧场 , 一 〔 〕 , , 一 , 以 , 。 爵 , 以 一 」 , 一 , , , 卜 群 , , 一 〔 〕 , , 群 , , 一 【 一 , 一 石 , , 。 一 即 群 , , 一 〔 」林 毅 , 关 雄 生物技术 , 《 “ , 一 【 李 力 , 黄胜元 , 关 雄 中国病毒学 洲〕 , 【 祁红 兵 刘 铭 , 李红敬 信阳 师范学院学报 自然科学 版 , , 一 科 仁 , , 。 , 。 卜 , , 一 孙胜利 , 喻子牛 , 贾新成 微生物学杂志 , 【 一 , 一 , 一 , 尸 , , , , 〔 」 , 一 , , ‘ , ,。 , , 一 仁 」钟万芳 , 姜丽华 , 阎文昭 , 等 遗传学报 , 「 」 , 、 盯 肠 , 抖 , 一 」 , 、 。七 , 一 」 、 巨 , ‘ ‘, 灯 , , ‘ , 陈少波 , 昊根福 科技通报 , 以 ” , 网 遭 矛 竺 ‘ 竺 ‘ 吃 而 竺今 健而 竺汾 竺 石 竺而 竺 ‘ 竺而 竺厅 竺石 竺石 竺 竺 函 竺而 竺而 竺而 竺 石 竺 面 竺 ‘ 竺 石 竺石 竺 石 竺 舀 、 竺 云 竺 面、 , 硒 竺石 竺而 性任 竺 ‘ 了 理 衬 理 面 性 ‘ 竺 ‘ , 云典尸了 悠厂 吧 三 旦 石健而 , 场 旦 些 矛 科技信息 堆肥生物技术治理废油泥的研究 在本刊 以拓 年 已报导发展堆肥生物技术治理农村有机废弃物 。 这里介绍堆肥生物技术治理废弃油泥的研 究成果 。 俄罗斯喀山大学研究人员对石化生产中废弃的油泥 含有沥青 、 树脂 、 苯酚 、 二甲苯等有毒或致癌性的碳氢化合 物 进行了治理的研究 。 用化学方法清除这些废弃油污是解决不了这一难题 , 而用堆肥生物技术途径以治理带来机会 , 即 某些特定微生物在治理油污过程中起重要作用 , 如木屑作为填充物含有某些特定微生物 , 通过它们的分解吸收 , 清除转化 油泥中污染物 , 同时使这些特定微生物能有效维持生命活力 还得向堆积物中洒些微生物所需的 “ 养料 ” , 其中如聚丙烯 化合物生产中所产生的各种废弃物 , 以满足这些特定微生物的 “ 嗜好 ” 。 部署就绪后 , 在这些堆积物中通风以强化微生物 的活动 , 并在堆肥场底层通过一管子收集废液 如此的堆肥 年后 , 油泥中的碳氢化合物含量由最初 的 盯 降至 岁 , 其中多环芳烃馏分减少 , 这样 , 从原来的有毒害环境基本 转为无害化 所有这些含油泥堆积物变为可培植 的土壤 , 为种植蔬菜如水萝 卜等开辟新基地 , 生长的蔬菜的安全性还得监测 〕 从 目前试验研究结果看来 , 这项堆肥生物技 术综合治油污是有效的 , 大大缩短时间 , 使其无害化 , 净化受污染的土壤 , 使其恢复肥力 , 能正 常地服 务农业 以 安全生 产 。 这里面还有些问题需要进一步探究 废油污堆肥治理起主要作用是哪些解烃微生物 起综合治理油污微生物 又是哪些 代谢油污 含油泥 的中间产物的残留 , 其安全性监测 以及何种微生物继续起作用呢 经治理后 去 污土壤的结构性 肥力 恢复到何种水准 要不另一类有益微生物以提高土壤肥力呢 所有这些问题需 要经多年的重复性 实验探究 , 以确保农业生产安全 。 柯 为