苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的形成及降解

ChineseAgriculturalScienceBulletinVol.23 No.9 2007September http://www.casb.org.cn 植物生理科学 苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的形成及降解 朱育菁,蓝江林,阮传清,刘 芸,刘 波 （ 福建省农业科学院生物技术研究所，福州 350003） 摘 要:【 研究目的】研究苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)伴孢晶体的形成及降解,为其生物 学特性的系统研究和活性成分分析提供理论基础。【 方法】将Bt菌株HD- 1在牛肉膏蛋白胨固体培养 基上30℃下培养24h,制成菌悬液后用日本电子JEM100- CX- II透射电子显微镜观察伴孢晶体的形 成。采用五种溶解方法降解Bt菌株HD- 1和LSZ9408伴孢晶体后,进行SDS- PAGE电泳。【 结果】此 研究的电镜观察表明BtHD- 1在分裂过程中形成芽孢和晶体,晶体为大菱形。BtLSZ9408晶体含有 130和65kDa的毒蛋白,HD- 1晶体含有130、65和25kDa的毒蛋白。【 结论】BtLSZ9408和HD- 1伴 孢晶体都包含CryI和CryII蛋白质毒素。 关键词:苏云金芽孢杆菌;伴孢晶体;降解 中图分类号:Q934文献标识码:A Formation and Decomposition of Crystal of Bacillus thuringiensis Zhu Yujing, Lan Jianglin, Ruan Chuanqing, Liu Yun, Liu Bo (Institute ofBiotechnology, Fujian AcademyofAgricultural Sciences, Fuzhou 350003) Abstract:【 OBJECT】Tostudythe formation and decomposition ofcrystal ofBacillus thuringiensis (Bt), and supply theoretics basis for systmic study on its biological characteristic and analysis of its active compo- nent.【 METHOD】Bt strain HD-1 was cultured on NA culture media for 24h under 30℃, and then was made intobacterial suspension and observed the formation ofcrystal with transmission electron microscope (JEM 100-CX-II). Five dissolution methods were used to decompose the crystals of Bt HD-1 and Bt LSZ9408, after that SDS-PAGE was conducted.【 RESULTS】Bt Hd-1 formed spores and crystals during split process, and the shape ofcrystal was bigdiamond. Bt LSZ9408 contained 130 and 65kDa toxic pro- teins, while Bt HD1 had 130, 65 and 25kDa toxic proteins.【 CONCLUSION】Both of crystals of Bt LSZ9408 and HD-1 contained CryI and CryII type protein toxins. Key words: Bacillus thuringiensis, Crystal, Decomposition 基金项目：国家自然科学基金“ 新型生物杀虫剂BtA的藕合技术及其杀虫效果的研究”（ 30471175）；2006年留学人员择优资助项目“ 新型生物杀虫剂 BtA的藕合机理的研究”。 第一作者简介：朱育菁，女，1972年出生，福建省福州市人，副研究员，博士。从事植物病虫害生物防治研究。通信地址：350003 福州市五四路247号， 福建省农科院生物技术研究所。Tel：0591-87848933，E-mail:zyjingfz@163.com。 通讯作者:刘波，男，1957年出生，福建省惠安人，研究员，博士，从事植物病虫害生物防治研究。通信地址：350003 福建省福州市五四路247号。 E-mail: laeptb@163.com。 收稿日期:2007-05-09，修回日期：2007-06-04。 苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis，简称 Bt） 是一类包括许多亚种并对多种昆虫具有高毒力的产晶 体芽孢杆菌[1]。自20世纪初被发现以来，世界各国又 相继从昆虫体内或土壤中分离出该种细菌，全世界收 集保藏的Bt已达4万株，在害虫的防治中发挥了巨大 的作用，是近年来发展最快、应用最广的微生物杀虫 剂[2]。中国地域辽阔、生态环境复杂多样，微生物资源 极其丰富，BtLSZ9408（ B. thuringiensis subsp.kurstaki） 是福建省农科院生物技术研究所分离的、对多种鳞翅 目具有高毒力的Bt菌株，有较大的应用潜力[3,4]。 Bt大多数菌株都能产生多种类型的晶体蛋白，不 同亚种甚至同一亚种不同菌株杀虫晶体蛋白的多肽成 植物生理科学 282· · 中国农学通报 第23卷 第 9期 2007年 9月 http://www.casb.org.cn 植物生理科学 分都不同，杀虫蛋白晶体由多种蛋白多肽组成，这些蛋 白多肽在不同类型杀虫蛋白中以不同方式结合而构建 蛋白晶体[5]。CryI、CryIVA和CryIVB蛋白的C端区域 结构相似，富含半胱氨酸蛋白多肽之间通过二硫键能 自我积聚，形成稳定晶体结构，这类伴胞晶体需要一个 更严格的理化条件才能形成一个可溶和具有活性的杀 虫蛋白结晶。CryIIIA蛋白由于其C端区域并不富含 半胱氨酸，组成蛋白晶体的蛋白多肽之间并不是由二 硫键相连而是盐桥作用构成伴胞晶体。71kDa的 CryIIA蛋白、72kDa的CryIVD蛋白和27kDa的CytA 蛋白晶体形成和稳定需要其它多种辅助蛋白(P19， P20，orf1，orf2)存在，表现出苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白 晶体形成的多样性。由于杀虫晶体蛋白这些组成上的 差异，其溶解性也是多种多样[6]。 笔者利用透射电镜观察了Bt菌株HD-1（ B. thuringiensissubsp.kurstaki）的伴孢晶体形成过程，并 采用五种溶解方法对Bt菌株HD-1和LSZ9408伴孢 晶体进行降解，并进行用胰蛋白酶进行激活，为Bt生 物学特性的系统研究和活性成分分析提供理论基础。 1材料与方法 1.1试验时间、地点 试验于在2006年在福建省农科院生物技术研究 所进行。 1.2试验材料 BtHD-1菌株由华中农业大学农业微生物学国家 重点实验室孙明博士赠予。BtLSZ9408由福建省农科 院生物技术研究所生物农药研究中心菌种室提供。培 养基为牛肉膏蛋白胨固体培养基。 1.3试验方法 1.3.1Bt伴孢晶体形成的电镜观察 将 BtHD-1在牛 肉膏蛋白胨固体培养基上30℃下培养24h，而后用少 量无菌水冲洗菌苔，用接种环刮下，制成菌悬液保存于 1.5ml离心管中。电镜观察在福建省农科院电镜室进 行，采用日本电子JEM100-CX-II透射电子显微镜（ 性 能指标：点分辨率为0.04nm；晶格分辨率为0.2nm；最 大倍数为45万）。 1.3.2伴孢晶体的提纯 依据刘波等（ 2005）的方法[7] （ 1）菌的培养和洗涤：将LSZ9408和HD-1菌接种在牛 肉膏蛋白胨固体培养基上，培养到芽孢、晶体游离，然 后用 0.85%生理盐水将培养物洗下，5000r/min离心 30min，离心前称重离心管重。芽孢的初分离。离心后 称取沉淀物湿重，将沉淀（ 晶体和芽孢的混合物）重新 悬浮在蒸馏水中，使成为每毫升含菌0.07g湿重的菌 悬液。用快速混匀器振荡，此时液面上产生很多泡沫， 泡沫里含有大量的芽孢和较少的晶体及营养体碎片。 将泡沫取出，继续振荡，重复数次，直至泡沫减少为止。 （ 2）液体双相分离：将上述去掉泡沫的悬浮液倒入分液 漏斗中，然后加入1%硫酸钠水溶液与四氯化碳）体积 比为（ 7:6:7）振荡10min，静置10min，此时有机相与水 相分开。晶体与很少的芽孢进入上层水相。将油相由分 液漏斗下方流出，从漏斗上方倒出水相，8000rpm离心 30min，将沉淀用重蒸馏水洗一次再离心。将沉淀物称 重、镜检，用水稀释至湿重为10mg/ml的菌悬液。 1.3.3伴孢晶体的降解方法（ 1）采用标准方法[8,9]降 解和激活伴孢晶体，即 50mmol/LNa2CO3·HCl（ pH 9.5）含5%β-巯基乙醇处理伴胞晶体，37℃温育1h； 用胰蛋白酶激活晶体蛋白（ 与晶体蛋白按1:50混合）， 37℃温育1h。 （ 2）0.1NNa2CO3·HCl含1%DTT（ pH9.5），37℃温 育1h。 （ 3）1NNaOH（ pH=9.5），30℃温育4h。 （ 4）1NNaOH2%的β-巯基乙醇，4℃冰箱保存过 夜。 （ 5）Tris-HCl（ pH=9.5）含2%的DTT，37℃温育 1h，4℃保存过夜。 伴孢晶体用上述方法处理后，用12000r/min、4℃ 离心10min，取上清液备样。 1.3.4SDS-PAGE电泳 参照分子克隆实验指南（ 萨姆 布鲁克，2002）[10]进行SDS-PAGE电泳，分子量标准为 预混合蛋白标准P7702V（ BioLabs），分离胶浓度为 10%，层积胶浓度为5%，考马斯亮蓝法染色。 2结果与分析 2.1Bt晶体形成的电镜观察 培养24h的Bt菌株HD-1的透射电镜观察见图 1。电镜观察表明：HD-1菌体为短杆状，细胞分裂时形 成隔膜，隔膜的形成启动了芽孢和晶体的形成，隔膜中 间向母细胞一端凸出形成脊，后隔膜两侧向端部移动， 两边速度不一样，形成亚极型前芽孢，最后连接，前芽 孢形成。芽孢形成于远离隔膜的一端，晶体形成在在隔 膜的一端。芽孢和晶体在成熟后从细胞中脱离，晶体为 283· · ChineseAgriculturalScienceBulletinVol.23No.92007September http://www.casb.org.cn 植物生理科学 图1培养24h的Bt菌株HD-1的透射电镜观察 菱形，芽孢椭圆形，外带有芽孢衣。 2.2Bt伴孢晶体的降解和激活 采用液体双相分离法提纯 BtHD-1和 LSZ9408 晶体，分别得湿重为1.11g和0.7g的晶体，镜检观察纯 度在90%以上，含有部分芽孢和菌体。SDS-PAGE电 泳试验结果见图 2，BtLSZ9408和 HD-1的晶体用标 准方法降解后均出现明显条带，其它的处理未出现明 显条带。BtLSZ9408有2条主要条带，分子量分别约 正在分裂的 细胞，芽孢正 在形成 分裂时形成 的隔膜 二联体 三联体 正在分裂的细胞，形成隔膜，而后形成前芽孢。 二联体和三联体 对称分裂和不对称分裂 在细胞体内形成游离的芽孢 在细胞体内形成的完整的晶体 细胞体内正在形成的晶体和芽孢 细胞体内形成的成熟的晶体和芽孢 正在脱落的芽孢 正在脱落芽孢的细胞 正在脱落的芽孢 脱落的芽孢 分裂后形成 的子细胞 正在分裂的细胞 脱落的晶体 芽孢衣 已脱落的芽孢和晶体 芽孢一，芽孢外有一层纤维状的芽孢衣 菱形的晶体 一端带缺口的菱形晶体 细胞体内正 在形成的晶 体和芽孢 芽孢二 菱形的晶体 284· · 中国农学通报 第23卷 第 9期 2007年 9月 http://www.casb.org.cn 植物生理科学 为130和65kDa，BtHD-1有3条主要的条带，分子量 分别约为130、65和25kDa。用标准方法激活（ 降解1） 后，BtLSZ9408的130kDa仍然存在，但含量减少，而 65kDa的条带变弱，但在130~65kDa之间出现约6条 带；Bt菌株的 130kDa的带变得非常弱，但保留着 65kDa的主要条带，25kDa的带也变为弱带。 3讨论与小结 苏云金芽孢杆菌产生的杀虫晶体蛋白可分为3种 类型：130~145kDa、65~78kDa和27kDa。不同的亚种 或菌株，其伴孢晶体可由单一的蛋白质毒素组成，也可 能由两个或多个不同大小级别的蛋白质毒素组成。对 鳞翅目害虫有毒性的蛋白主要是前两种类型的蛋 白[11]。该研究的电镜观察表明Bt菌株HD-1在分裂过 程中形成芽孢和晶体，晶体为大菱形。前期的预备试验 还发现BtLSZ9408晶体形态多种，除有菱形晶体外， 还带有不同大小的小方形的晶体。 大量的研究发现，有些Bt菌株能产生多分子量的 复合蛋白。毒蛋白的分子量一般在 125~138kDa、 65~75kDa或25~28kDa[6]。研究的SDS-PAGE电泳结 果表明，BtLSZ9408晶体含有 130和 65kDa的毒蛋 白，HD-1晶体含有130、65和25kDa的毒蛋白。采用 50mmol/LNa2CO3·HCl（ pH9.5）含5%β-巯基乙醇处 理伴胞晶体，BtLSZ9408的65kDa蛋白溶解，而Bt菌 株HD-1的130kDa蛋白溶解。其它的溶解处理和激活 处理未出现条带，可能与电泳样品的浓度不足相关，需 做进一步的试验。 Lereclus等(1993)[12]将苏云金芽孢杆菌杀虫晶体 蛋白的 SDS-PAGE图谱分为 5类：一类含 CryI和 CryII，分子量约为130~140kDa和67kDa；二类仅含 CryI，分子量约为 130~140kDa，三类仅含 CryIII,分子 量约为 67kDa，四类则为 CryIV，分子量为 130，67和 27kDa，另一类则仅含分子量约为40~45kDa的杀虫晶 体蛋白，各类都表现出不同的杀虫活性谱。并且CryI 蛋白一般在pH=9.5条件下溶解，CryII则要求pH约 为 12才能完全溶解。研究结果表明 BtLSZ9408和 HD-1都包含CryI和CryII蛋白。BtHD-1的结果与张 宏宇等（ 2000）的相同，他们报道HD-1的晶体蛋白组 成为CryIA(a)28%，CryIA(b)39%，CryIA(c)33%，CryI- IA，CryIIB[6]；但是却发现多了一条在 25kD左右的蛋 白带。同时这两种菌株的CryI蛋白都在pH=9.5条件 下溶解。 由于细胞产生的蛋白水解酶总是粘附于伴胞晶 体，杀虫晶体蛋白在制样过程中往往产生不同程度的 酶解，而并未完全准确反映多肽的实际分子量[8]。研究 结果也发现除了主要条带外，还有其它非主要的条带 产生，可能与酶解有关。 为了对苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白晶体的多肽组成 有了一个更清晰，更准确的认识，目前常用的方法是对 杀虫晶体蛋白基因的克隆，目前已被克隆和序列化的 116个杀虫晶体蛋白基因表达的蛋白质产物，分子量 从27kDa到140kDa不等 [9]。因此将进一步对这两种 Bt菌株的杀虫晶体蛋白基因的克隆。 参考文献 [1] 邵宗泽,郭延奎,喻子牛.苏云金芽孢杆菌工程菌伴孢晶体的形态 发生[J].微生物学报,2002,42(5):555-559. 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