结膜下植入羊膜治疗兔眼中度碱烧伤的实验研究

南方医科大学2007级硕士学位论文 结膜下植入羊膜治疗兔眼中度碱烧伤的实验研究 Experimentalstudyofamnionforthetreatmentofalkali burninrabbits 课来源： 白选 专 业 名 称 学位申请人 指 导 教 师 答辩委员会主席 答辩委员会成员 眼科学 杨怡 金中秋教授 邢怡桥教授 蔡小军教授 张明昌教授 张 虹教授 周和政教授 论文评阅人 张明昌教授 蔡小军教授 沈政伟副教授 2010年05月28日广州 硕士学位论文 Illtlllllllll11111111111111111111111111111tlllUl Y1770302 结膜下植入羊膜治疗中度免眼碱烧伤的 实验研究 硕士研究生：杨怡 指导教师：金中秋 摘 要 随着化学工业的发展，化学性眼烧伤有逐年增多的趋势，眼化学烧伤约占 眼外伤的10％左右，占整个工业件危害的5％～20％．其巾又以碱烧伤为多见。 碱性物质因能与组织细胞中的脂质发生皂化反应，形成的化合物具有脂和水双 溶特点，所以能够很快的穿透上皮组织和角膜基质，并继续向深部渗透；烧伤 后的1周，即在角膜愈合的过程中，再生组织释放胶原酶，又可进一步引起眼 部损害，导致角膜溃疡、角膜穿孔等；而随着结膜的愈合，又可发生睑球粘连、 睑外翻等，因此碱性物质与其他物质导致的眼部烧伤相比，具有组织损伤更严 重，易遗留后遗症，预后不佳的特点，其治疗一直是困扰眼科医师的一个棘手的 问题。 碱烧伤根据烧伤后的组织反应一般可分为轻、巾、重三种不同程度的烧伤。 轻度：多由稀释的弱碱引起。眼睑与结膜轻度充血水肿，角膜上皮有点状损害 或水肿。数日后消退，上皮修复，不留瘢痕，无明显并发症，视力多不受影响。 中度：多由较稀的碱引起。睑皮肤可起水泡或糜烂，结膜水肿，并有小片缺血 坏死灶；角膜混浊水肿，上皮层完伞脱落，形成白色凝固层。严重影响视力， 治愈后会遗留角膜斑翳。重度：多由强碱引起。结膜出现广泛的缺血性坏死， 角膜全层呈灰白或者呈瓷白色浑浊。由于组织坏死，角膜基质层溶解，出现角 膜溃疡或穿孔，碱可立即渗入前房，引起葡萄膜炎、继发件青光眼和白内障等。 角膜穿孔愈合后会形成前粘性角膜白斑、角膜葡萄种等。结膜的缺损愈合时可 中文摘要 造成睑球粘连，最终引起视功能或眼球的丧失。此外眼睑、泪道的烧伤还可引 起眼睑畸形，眼睑闭合不全、泪溢等并发症。 目前临床上将眼部碱烧伤的病程分为4期：即刻、急性期、早期修复期、 晚期修复期，而治疗也是针对各个期的病理生理特点进行的。烧伤即刻的处理 包括局部冲洗，清除固体致伤物，前房穿刺，取出失活组织等：急性期(0．7天) 的处理包括使用人工泪液、皮生长因子等促进上皮愈合，使用维生素C、枸橼 酸、糖皮质激素减少溃疡支持修复，另外减轻患者痛苦预防炎症、青光眼、感 染及结膜疤痕等并发症；早期修复期(7．21天)的处理包括促进上皮修复、减 少溃疡、支持修复、预防并发症等，其用药同急性期，但激素需减量使用或停 用；晚期修复期(21天至数月)的处理包括促进上皮愈合、眼表重建，防止并 发症。以上治疗措施多为药物治疗，而钏+对碱烧伤的手术方法(穿透性角膜移 植术、伞板层的角膜移植术、等)多用于治疗后期碱烧伤所导致的并发症。 近年来，羊膜在眼科领域的应用日趋成熟。羊膜移植亦成为治疗角膜碱烧 伤较为有效的手段之一。羊膜位于胎盘最内层，无血管、神经和淋巴，光滑而 有弹性，是人体最厚的基底膜。人们发现羊膜具有抑制炎症、新生血管生成、 促进上皮细胞修复重建眼表、抑制结膜下的瘢痕形成的诸多作用，经久不愈的 角膜上皮缺损和溃疡可通过一层人羊膜覆盖而得到有效的控制。羊膜的这些作 用与它的结构特点是分不开的：1、羊膜无血管基质可以防止纤维瘢痕组织形成、 控制排斥反应发生；2、厚的基底膜能够为角膜上皮的修复提供基底膜，促进上 皮细胞迁移，加强基底上皮细胞粘附及分化，在防止上皮细胞凋亡上也有重要 作用；3、羊膜基质对成纤维细胞表达细胞因子的水平具有调节作用，它通过成 纤维细胞抑制TGF-Bl的表达，而TGF—B1是一利-在伤U愈合过程巾调节成 纤维细胞活性的细胞因子，因此羊膜能够重建正常上皮表型，消除炎症和瘢痕 化：4、羊膜可使巩膜表面形成一层胶原膜类似一层屏障，这可能是其可以抑制 结膜下瘢痕形成的机制。现有的研究及临床治疗多将羊膜覆盖于碱烧伤后的角 膜表面，观察其对角膜修复的保护和促进作用，但是对受损结膜的研究较少。 在既往的电镜研究中可见羊膜的一维空间内众多纤维交织成网状而形成无数网 硕士学位论文 孔结构，网孔间隙0．5～15lam。有研究者推断羊膜三维牢间内侧是由胶原纤维 和网状纤维相互缠绕组成的一个立体交叉的纤维网架，在胶原蛋白分子上嵌有 蛋白多糖和糖蛋白，这种结构类似于海绵，我们猜想碱烧伤后将羊膜植入结膜 下，羊膜可吸附碱性物质，从而减少碱性物质对结膜的刺激和损伤，同时羊膜 还可起到物理屏障减少碱性物质渗入，起到保护眼表及全眼球的作用，另外上 述的羊膜的一些已经认可的抗炎、抗纤维增生、抑制结膜下瘢痕形成等作用又 可减少烧伤后睑球粘连等眼睑畸形的发生。为证实以上猜想，作者设计了本实 验，将大块羊膜置于球结膜下，观察该方法对眼部碱烧伤的治疗作用和对角膜 及结膜的保护作用。 目的：探索结膜下植入羊膜方式治疗兔眼碱烧伤的可行性研究。比较使用 结膜下植入羊膜联合药物治疗与单独药物治疗的疗效差别。检验羊膜对结膜的 保护作用。 方法：48只(2．5kg-'--3．Okg)同性别的健康无眼疾的新西兰大白兔。随机 分为2组，每组24只。A组处理：氧氟沙星眼液滴眼3／d；地塞米松眼液滴 眼3／d，；10％枸橼酸纳滴眼，3／d；结膜下注射维生素C+庆大霉素2万单位即 刻；1周后停用地塞米松滴眼液；B组处理：氧氟沙星眼液滴眼3／d，地塞米 松眼液，滴眼3／d；10％枸橼酸纳滴眼，3／d，结膜下注射维生素C+庆大霉素2 万单位，即刻，并在结膜下植入羊膜；一周后停用地塞米松。观察在烧伤后第l 天、第3天、第5天、第10天、第14天、第21天、第30天两组的角膜透明 度、结膜充血程度、眼部瘢痕及角膜新生血管的分级，另取两只健康无眼疾的 新西兰大白兔建立碱烧伤模型后观察其自然转归。30天后处死实验动物，取组 织行病理检查。 各种观察指标分级如下：角膜透明度分级：O级全角膜透明、眼内结构清楚 可见；l级角膜轻度混浊，虹膜纹理不清，但能看清楚瞳孔缘，房水状态可看清； 2级瞳孔缘模糊不清，房水状态无法看清，虹膜纹理不清；3级隐约看出虹膜颜 色，余窥不清；4级看不到任何前房结构。 角膜新生血管分级：0级无新生血管；1级新生血管少于1个象限；2级新生 中文摘要 血管1’2个象限，侵入角膜内侧小于4mm；3级新生血管2’3个象限：4级新生血管 3’4个象限，覆盖整个角膜表面。 结膜充血分级：O级血管正常；1级血管轻度充血，小于2个象限，不伴有球 结膜水肿；2级血管充盈迂曲明显．伴有球结膜水肿，面积大于2个象限；3级全 部球结膜血管充血迂曲，伴有球结膜水肿和睫状充血。 眼部瘢痕分级：0级无粘连；1级轻度粘连，易被钝性分离；2级轻到中 度粘连，能够分开；3级中到重度粘连，分开有难度；4级粘连紧密，分开时球 结膜有破损。 结果：羊膜无脱出，且14天后羊膜植入处的羊膜基本溶解。烧伤后短时间 内未见新生血管生成，l周后均开始出现新生血管。烧伤后一天，两组角膜透明 度无显著差异(Z=-一0．763，P=O．445)，两组均未见新生血管长入，两组结膜充 血比较，A组明显重于B组，有显著统计学差异(左一3．658，P：-O．000)。烧伤 后30天，烧伤后第30天角膜透明度两组无显著差异(Z=-O．421，P>O．05)B组 眼部结膜疤痕明显轻于A组有显著差异(Z一2．291，P=O．022)，角膜新生血管 A组与B组无显著差异(庐一0．406，P=O．685)。烧伤30天后取结膜组织，从光 镜下观察该组织，可见B组结膜组织的纤维增生轻于A组：B组结膜组织层次清 晰，上皮组织较完整，A组结膜组织层次不清，上皮修复不佳；且A组肌肉(眼 外肌)组织紧缩，肌纤维收缩，B组肌肉(眼外肌)形态接近正常横纹肌。比较 两组角膜的光镜检查，未见明显差异，均呈现出角膜基质大量炎症细胞浸润， PMN，淋巴细胞均较多，基质水肿，炎症反应强烈，未见使用羊膜组的角膜炎症 较A组减轻等现象。 结论：结膜下植入羊膜后可有效的保护受损后的结膜，减轻炎症，抑制纤维 增生，预防睑球粘连等眼睑畸形的发生，严重的睑球粘连及眼睑畸形给后期进 行穿透性角膜移植手术带来困难，预防睑球粘连等眼部畸形可为碱烧伤后行角 膜移植等复明手术提供的更好的条件。但是该方法对于角膜的保护作用不理想， 可通过改进操作方法(取较大的羊膜伞周剪开角巩膜缘处的结膜，分离筋膜将 羊膜置于结膜下同时覆盖角膜，再将结膜与羊膜缝合)以达到同时保护结膜及 IV 硕士学位论文 角膜的作用。另外我们观察期限只是烧伤后30天，长远来讲碱烧伤后对结膜的 保护实质上也是对角膜的保护。该实验研究提示药物联合结膜下植入羊膜治疗 中度碱烧伤的效果优于单独药物治疗；该方法通过改进后可作为碱烧伤后保护 受损结膜的一种简单的方法，但应用于临床还需进一步研究。 关键词：碱烧伤 羊膜睑球粘连结膜实验研究 V 厂 硕士学位论文 Experimentalstudyofpreservedamnion forthetreatmentofalkaliburninrabbits Name：YANGYi Supervisor：JINZhong—qiu ABSTRACT AstheChemicalIndustrydeveloped，Chemicaleyesbumbecometypical，it takes10％oftheophthalmicinjurycase．and5％to20％ofthewholeindustryinjury． Alkalibumisthemosttypicalcaseofchemicaleyesbum，becausethecompound whichcreatebythesaponificationreactionofalkalineandlipidCanbedissolvedby bothwaterandlipid，itcanpenetratetheepithelialtissueepitheliumandcomear stromaquicklyanddeeply；duringtheagglutinationofcorneal，itleadstoafurther damagebythecollagenasewhichsecretebytherebomfunction；duringthe agglutinationofconjunctiva，itwillleadtosymblepharosis，SO，alkalibumsmore seriousthanotherchemicalsubstancesandit’Sreallyatoughcaseforcureing treatment．Currentlyclinicalcourseofeyesalkaliburncanbedividedintofourparts： immediatelystage，acutestage，earlierrestorationstage，terminalrestorationstage； therearepertinentremedyforeachstage．Remedyforimmediatelystageinclude rinsing，clearthesolidvulnerant，punctureofanteriorchamber,takethedevitalized tissueout，etc⋯Remedyforacutestage(O一7days)includingusingartificialtearand EGFforadvancingtheepidermiscuring．vitaminC&citricacidcitral& glucocorticoidforreducecankerandpainwhentheycanalsopreventthesyndrome ofinflammation&glaucoma&infections&conjunctivescar；remedyforearlier restorationstage(7—21days)includingadvancetherestorationofepidermis，prevent cankerandsyndromeaswhatwedoforacutestage，butmustbeattentionforthe hormoneusage；remedyforterminalrestorationstage(21days-severalmonths) includingepidermisrestoration&eye-surfacerebuild&syndromeprevention．Most ABSTRACT oftheseremedyaremedication，operation(1ikepartialpenetratiogkeratoplasty,whole lamellarkeratoplasty,ect．．)usuallyuseforsyndromewhichcausedbyuppereyes alkalibum．Amnioticlocatedinthedeepestofplacental，itcontainsnovascular, noneuronandnolymph，smoothlyandflexible，it’Sthethickestbasementmembrane． Recently,it’Sfoundmultifunctionofinflammatoryinhibition，hemalreborn& epidermisrestoration&eye—surfacerebuildingandinhibitionofconjunctival cicatrization，it’Salsocancurethelongtimeinjuryofcornealepidermisandcanker bycoveralayerofamniotic．Amnioticequippedthesefunctionbyitsstructure： 1．Therearenoangiogenesisinsidewhichcanpreventthefibrosiscicatrizationand controltheexclusivereaction；2．ThickbasementmembraneCanprovidematerialfor cornealepitheliumrestoration，itcanalsoadvancetheepitheliamovementand 硕士学位论文 bum．Observetheprotectionofamnionforconjunctiva． Methods： Themodelswithcornealalkalibumwereestablishedin48Newzealand rabbits．The48rabbitsweredividedrandomlyinto2groups．GroupAwastreatedwith Ocuflox，dexamethasoneophthalmic，citricacid，vitamincandgentamicin．GroupB wastreatedwithOcuflox，dexamethasoneophthalmic，citricacid，vitamincand gentamicin，besidesinsetedamnionundertheconjunctiva．Theeffectwasmeasured bythedegreeofclarityforcomea，congestionforconjunctiva，newvesselsfor comea，cicatricleforconjunctiva．The30mday,wehaveputtedtheanimalsto death，senttheircorneasandconjunctivatohadpatho—checking． Result： TheeffectofGroupBwassuperiortotheGroupA．Inthe1辄day，thedegreeof congestionforconjunctivaofGroupBwasmoregentlythanGroupA，butthedegree ofclarityforcomeaofGroupBWasinthesamemannerwithGroupA．Inthe30‘“ day，thedegreeofcicatricleforconjunctivaofGroupBwasmoregentlythanGroup A．Thesameresultwasbeprovedbypatho-checking． Conclusion： Embeddedtheamnioticinconjunctivacaneffectivelyeffortforprotectbroken conjunctiva，anti-inflammatory，preventfibroplasiaandsymblepharonbutnotshowed aobviousresultforcomeaprotection．Wecanimprovethisbycuttingtheconjunctiva whichisnearbythecorneoscleraljunctionandcuttingtheanadesmawhichisunder theconjunctiva．Thenputtingalargeramniotictocovertheimpairedcorneaandto undertheconjunctiva,suttheconjunctivaupontheamnionwith7-0stitch．This methodmaysimultaneouslyprotecttheconjunctivaandcornea．Otherwisewe observedthisexperimentonlyfor1 month，long-termtosay，ifwehaveprotectedthe conjunctivawewillprotectthecornea．Thereasonissymblepharonwillcutdownthe effectionofceratopalsty．Sothetreatmentofembedtheanmionundertheconjunctiva iseffectiveonprotectingconjunctiva． KEYWORDS：Alkalibum；Amnion；Symblepharon；Conjunctiva；Empirical study 硕士学位论文 目 录 摘 要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯I ABSTRACT⋯⋯⋯．⋯⋯．⋯⋯．⋯⋯⋯⋯．⋯⋯．⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯．⋯．．．⋯．⋯⋯⋯⋯．⋯⋯．⋯⋯⋯⋯．．i 第一章 引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l 第二章和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 第三章结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8 第四章讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．10 第五章结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．14 附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．15 参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯19 攻读学位期间成果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．21 综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．22 致j射⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．31 学位论文原创性声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．33 统计学审稿证明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．34 硕士学位论文 第一章 引言 随着化学工业的发展，化学性眼烧伤有逐年增多的趋势，其中又以碱烧伤 为甚，其具有较强的穿透力，致盲率极高。碱性物质是人们经常会接触到的， 并可能造成眼部损伤。碱性物质能与组织细胞中的脂质发生皂化反应，形成的 化合物具有脂和水双溶特点，所以能够使其很快的穿透上皮组织和角膜基质， 并继续向深部渗透；在角膜的愈合过程中，再生组织又释放胶原酶，可进一步 引起损害；随着结膜的愈合，应纤维增生可发生睑球粘连及睑外翻⋯，因此碱烧 伤比其他物质导致的眼部烧伤更加严重，其治疗一直是一个棘手的问题。 对于角膜来说，眼部碱烧伤后，角膜上皮损伤脱落形成缺损，在伤后72 小时内，周围上皮通过移行和增生使缺损区面积缩小。之后新生的上皮进行缘 开始发生剥脱，使上皮缺损区增大。伤后角膜表面出现多形核细胞，在24小时 内达到峰值，3天后减弱。 受伤后1周出现第二个多形核细胞高峰，此时，多 形核细胞以角膜周边深基质浸润和上皮缺损区浅巾层浸润为主，数量多，尤其 是角膜病变明显的溃疡边缘处，表现为上皮愈合速率再次停滞，缺损区扩大， 容易发生角膜溃疡。之后如果上皮长时间的不能修复，加上组织局部炎性渗出 增多，最终导致瘢痕性睑球粘连及角膜瘢痕性血管化。 对于结膜来说，眼部碱烧伤后结膜内细胞崩解脱落，结膜内微血管血栓形 成，炎症细胞浸润，之后结膜上皮不规则增生，如长期上皮不能修复机组织局 部炎性渗出增多可导致睑球粘连。 以上为碱烧伤后，眼部角膜及结膜组织的主要病理变化，根据这些病理变 化，碱烧伤临床病程分为即刻、急性期、早期修复期、晚期修复期，并针对各 个期进行治疗。烧伤即刻的处理包括冲洗，清除固体致伤物，前房穿刺，取出 失活组织等；急性期(0-7天)的处理包括使用人工泪液、表皮生长因子等促进 上皮愈合，使用维生素C、枸橼酸、糖皮质激素减少溃疡支持修复，并减轻患者 痛苦预防炎症、青光眼、感染及结膜疤痕等并发症；早期修复期(7．21天)的 处理包括促进上皮修复、减少溃疡支持修复、预防并发症用药同急件期，但激 第一章 引言 素需减量或停用；晚期修复期(21天至数月)的处理包括促进上皮愈合、眼表 重建，防止并发症。 除了药物治疗，对于严重的眼部碱烧伤还可采取手术治疗。碱烧伤后期大 量的角膜新生血管及长期的炎症反应使角膜移植等手术的成功率降低，因此近 年来开始尝试在烧伤早期行角膜移植术，包括穿透性和伞板层的角膜移植术， 早期手术可能由于主动去除已严重损伤的角膜组织，减少了后续的长期炎症反 应，所以减少了角膜严重血管化并保持了长期的植片透明性。羊膜由于有良好 的抗炎和分隔作用，而且材料相对易得，可用于碱烧伤的各个阶段。近年来多 项研究显示，碱烧伤早期行羊膜移植有利于促进角膜上皮修复，抑制各种炎性 因子的浸润。 羊膜从细胞滋养层衍化而来，是人两层胎膜的内层，正常羊膜薄而透明， 无血管，厚度为0．02～0．05mm。羊膜移植己在早期不同的医学专业文献中有记载。 1940年Rotth首次用火的胎膜(包括羊膜和绒毛膜)重建结膜表面。由于当时制 备方法不妥和制片包含有绒毛膜而使其具有强的抗原性，结果导致制片大部分 失败。60年代虽再有关于羊膜移植的报道，但仍未获得较好的效果而未引起重 视。1995年Kim乘lTseng¨1重新进行羊膜移植的研究，优于改进了羊膜的处理和保 存方法，获得了令人鼓舞的临床结果，逐渐被眼科医师所接受。 在既往的电镜研究巾可见羊膜的一维牢间内众多纤维交织成网状而形成无 数网孔结构，网孔间隙O．5～15um。“。张亦霞Ⅲ等推断其三维空间内侧是由胶 原纤维和网状纤维相互缠绕组成的一个立体交叉的纤维网架，在胶原蛋白分了 上嵌有蛋白多糖和糖蛋白。近年来，人们发现羊膜具有抑制炎症、新生血管生 成及促进上皮细胞修复重建眼表的作用。经久不愈的角膜上皮缺损和溃疡可有 效通过一层人羊膜覆盖而控制。羊膜的这些作用与它的结构特点是分不开的， 羊膜含有眼表面上皮细胞(结膜细胞及角膜上皮细胞)生长所需要的物质，可 延长其生命，维持克隆n·引，它具有加速上皮化用于治疗有基质溃疡的持续性角 膜上皮缺损n1，羊膜也可刺激结膜上皮的非杯状细胞的分化，羊膜羊膜无血管基 质可以防止纤维瘢痕组织形成，控制排斥反应发生嫡3，厚的基底膜能够促进上皮 硕士学位论文 细胞迁移，加强基底上皮细胞粘附及分化，羊膜基质也能清除炎症细胞，促使 他们迅速凋亡，羊膜基质中还含有不同形式的蛋白酶抑制因子，使得羊膜移植 后基质炎症和角膜新生血管得到缓解。有学者研究指出，羊膜能消除炎症及瘢 痕化，其所以能够重建正常上皮表型是因为羊膜基质对成纤维细胞表达细胞因 了的水平具有调节作用，它通过成纤维细胞抑制TGF一131的表达，而TGF一131 是一种在伤口愈合过程中调节成纤维细胞活性的细胞因子。有文献报告，羊膜 rfl已经检测出几种生长因子，确切的作用机制需进一步研究。羊膜也能清除炎 症细胞，促使他们迅速凋亡。羊膜移植术可以和角膜移植术联合使用，再加上 他取材容易，多用于常规疗法无效的持续性角膜上皮缺损。 现有的研究多将羊膜覆盖于碱烧伤后的角膜表面，观察其对角膜修复的保 护和促进作用，对受损结膜的研究较少，为了了解羊膜对结膜是否也有保护作 用，我们设计了本实验，将羊膜置于球结膜下，观察该方法对碱烧伤后角膜及 结膜的保护，报告如下。 第二章材料和方法 第二章材料和方法 一、材料： 1、羊膜的制备：从乙肝病毒、丙肝病毒、衣原体、人免疫缺陷病毒及梅毒 均阴性的健康孕妇剖宫产的胎盘采取。取材均在无菌操作下完成。将胎盘用无 菌生理盐水冲洗干净，置于的l：2000的庆大霉素生理盐水中浸泡10分钟。钝性 分离羊膜，上皮面向上。将羊膜平铺于手术贴膜的纸片上，羊膜粗燥面与纸的 粗糙面相贴并修剪成一定大小，置于乘有甘油的小瓶中，在一25。冰箱中保存， 备用。 2、主要试剂：①维生素C注射液(2ml：0．59)：湖北天医药业股份有限公 司： ②硫酸庆大霉素注射液(2ml：8万单位)：武汉滨湖双鹤药 业有限公司； ③氧氟沙星滴眼液：湖北东盛制药有限公司； ④地塞米松磷酸钠滴眼液：武汉五景药业有限公司 ⑤3％戊巴比妥钠、10％枸橼酸钠、Immol／LNaOH(购原料自配) ⑥0．9％氯化钠；孛射液(500m1)、滤纸 3、主要设备：①显微手术器械及TOPCON公司的OMS600眼科手术显微镜。 错误!未找到引用源。光学显微镜：日本OLMPUS产 4、实验动物：50只(2．5kg'～3．Okg)同性别的健康无眼疾的新西兰大白兔， 由广州军区武汉总医院动物实验中心提供，购自武汉万千佳禾实验动物养殖有 限公司。 二实验方法： 1、羊膜的制备：从乙肝病毒、丙肝病毒、衣原体、人免疫缺陷病毒及梅毒均 阴性的健康孕妇剖宫产的胎盘采取。取材均在无菌操作下完成。将胎盘用无菌 生理盐水冲洗干净，置于1：2000的庆大霉素生理盐水中浸泡10分钟。钝性分离 硕士学位论文 羊膜，上皮面向上。将羊膜平铺于手术贴膜的纸片上，羊膜粗燥面与纸的粗糙 面相贴并修剪成一定大小，置于乘有甘油的小瓶中，在一25。冰箱中保存，备用。 2、碱烧伤模型制作：3％戊巴比妥钠以lml／kg从兔的耳缘静脉行静脉注射，对 实验对象进行麻醉，将直径8mm的滤纸片浸于lmol／LNaOH溶液中，lmin后取出， 吸去多余的NaOH。开睑器撑开兔眼，用眼科镊将滤纸片置于角膜中央，与角膜 接触15s后取下，滴一滴生理盐水入兔眼结膜囊，15s后立即用生理盐水冲洗角 膜表面和结膜囊lmin。建立巾度碱烧伤模型。巾度碱烧伤的判断：结膜水肿充 血，可有小片缺血坏死灶；角膜混浊水肿，上皮层完全脱落，形成白色凝固层。 3、动物分组：48只(2．5kg～3．Okg)同性别的健康无眼疾的新西兰大白兔。 随机分为2组，每组24只。A组处理：氧氟沙星眼液滴眼3／日，地塞米松眼液滴 眼3／日，10％枸橼酸纳滴眼，3／日，结膜下注射维生素C+庆大霉素2万单位即 刻，1周后停用地塞米松滴眼液；B组处理：氧氟沙星眼液滴眼3／日，地塞米 松眼液，滴眼3／日，10％枸橼酸纳滴眼，3／日，结膜下注射维生素C+庆大霉素 2万单位，即刻，并在结膜下植入羊膜，一周后停用地塞米松。另取两只健康无 眼疾的新西兰大白兔建立碱烧伤模型后观察其自然转归。 4、结膜下植入羊膜的方法：将羊膜从冰箱取出，复温，浸泡于1：2000的庆大 霉素生理盐水中30分钟，备用。用显微剪将模型眼上方距角膜缘2mm处与角膜缘 平行剪一约2cm的球结膜切u，．显微剪分离筋膜，用无齿显微镊将备用的O．6X 1．2cm大小羊膜从切口处仔细塞入结膜下，尽量使其平伏于巩膜上，7—0丝线缝 合结膜切U。 三、研究指标的观察和测定： 1、术后处理及观察：两组均给氧氟沙星眼液滴眼3／d，地塞米松滴眼3／d， 10％枸橼酸纳滴眼3／d，分别于烧伤后1天，3天，5天，10天，14天，21天，30天， 观察模型眼的大体情况，包括：角膜透明度，新生血管、结膜充血及眼部瘢痕情 况，分级情况女¨下旧1 角膜透明度分级：0级伞角膜透明、眼内结构清楚可见：l级角膜轻度混浊， 第二章材料和方法 虹膜纹理不清，但能看清楚瞳孔缘，房水状态可看清；2级瞳孔缘模糊不清，房 水状态无法看清，虹膜纹理不清；3级隐约看出虹膜颜色，余窥不清；4级看不 到任何前房结构。 角膜新生血管分级：O级无新生血管；1级新生血管少于1个象限；2级新生 血管1-2个象限，侵入角膜内侧小于4mm；3级新生血管2—3个象限：4级新生血管 3-4个象限，覆盖整个角膜表面。 结膜充血分级：O级血管正常；1级血管轻度充血，小于2个象限，不伴有球 结膜水肿；2级血管充盈迂曲明显．伴有球结膜水肿，面积大于2个象限；3级全 部球结膜血管充血迂曲，伴有球结膜水肿和睫状充血。 眼部瘢痕分级：O级无粘连；1级轻度粘连，易被钝性分离；2级轻到中度粘 连，能够分开；3级巾到重度粘连，分开有难度；4级粘连紧密，分开时球结膜 有破损。 14天时，处死一只未经治疗的实验对象，取角膜组织，正中切成两半， 制备光镜及电镜标木。 光镜制备过程如下：1、取材：取切成两半的角膜中的一半，将标本立即置 于409／L福尔马林溶液中固定2小时(每半个角膜占一个瓶)；2、第二次取材： 将组织根据需要切成相应形状，连同标记号码包在小块纱布内，并用大头针别 好，放入制样杯内(杯内盛自来水)；3、自来水荡洗3次，每次20分钟，以便 沈去甲醛：4、梯度乙醇脱水：50％、70％、80％、90％、100％、100％浓度的乙醇每 级20分钟；5、组织透明：二甲苯III各30分钟浸泡组织；6、浸蜡I，将组织 放入蜡锅内浸蜡l小时，浸蜡II，将组织放入包埋机预热的蜡池内浸泡3小时；7、 组织包埋：准备好有冷却水的盒．了及包埋板条，先滴入半包埋孔蜡，将组织按 要求的面朝下轻压时期贴稳，将包埋横孔加满蜡，放上对应的标签，稍静置后 将整个包埋模孔条放入冰水内冷却，冷却后将保佑组织的蜡块推压出，放到相 应的盒内；8、切片；9、苏木素一伊红染色，封片，光镜下观察。 电镜制备过程：1、取材，放入有2．5％戊二醛的EP管中；2、再次取材(将 原有材料修剪)放入装有1／IOML的PBS的EP管内；3、PBS洗3次，每次15分钟； 6 硕士学位论文 之后步骤送电镜室制作切片。 30天时将实验对象处死(包括一只未经治疗的新西兰大白兔)，取带lmm巩 膜组织的角膜组织，正中切成两半(光、电镜各一半)，另取B组植入羊膜处的结 膜组织及A组对应的结膜组织(带肌肉组织及不带肌肉组织)。光镜标本制备： 过程同前。另取标本立即置于2．5％戊二醛巾，4。C冰箱保存，送电镜室制片、 观察、拍照。 四、数据处理： 等级资料采用两独立样木非参数检验(Mann—Whitney检验)，双侧，Q=0．05， 应用SPSS13．0软件包进行数据处理。 第三章结果 一、 大体改变： 第三章结果 植入羊膜后1天、3天、7天、14天、21天、30天分别观察，羊膜无脱出，且 14天后羊膜植入处的羊膜基本溶解。烧伤后两组均出现角膜上皮损伤脱落，形 成缺损，伤后3天，缺损区面积缩小，3天后新生的上皮进行缘开始剥脱，上皮 缺损区增大，之后缺损区再次减小。这个过程与以往的研究相符。烧伤后短时 间内未见新生血管生成，1周后均开始出王见新生血管。结膜充血情况则随观察天 数的增加而减轻。 硕士学位论文 烧伤后30天的角膜及结膜的大体情况；图3-4为B组烧伤后30天的角膜及结膜的 大体情况。 表3-2烧伤后30天角膜透明度眼部结膜疤痕及结膜充血比较(单位：眼) Table3-2ComparisonofclarityforCorneal＆symblepharon＆Corneal neovascularization(30daysafterburned) 注：采用Mann-Whitney检验 二、碱烧伤后病理检查： l、烧伤后30天：A组角膜上皮修复，修复上皮约3’4层细胞，见较多成纤维细胞 及新生血管炎症减轻，内皮受损。(见图3—5) 2、烧伤后30天：B组亦见角膜上皮修复，修复上皮约3、4层细胞，见较多成纤维 细胞及新生血管炎症减轻。 (见图3—6) 3、比较两组角膜的光镜检查，未见明显差异，均呈现出角膜上皮修复、较多成 纤维细胞及新生血管长入，未见使用羊膜组的角膜炎症较A组减轻、新生血管减 少等现象。 4、与角膜组织不同，烧伤30天后取结膜组织，从光镜下观察该组织，可见B组 (使用羊膜组)结膜组织的纤维增生轻于A组(未使用羊膜组)；A组肌肉(眼 外肌)组织紧缩，肌纤维收缩，其外见纤维增生(见图3-7)，B组肌肉(眼外 肌)形态接近正常横纹肌，包裹肌肉的结膜组织未见明显增生(见图3-8)；A 组结膜组织层次不清，上皮修复不佳(见图3-9)，B组结膜组织层次清晰，上 皮组织较完整(见图3一10)。 9 第四章讨论 第四章讨论 随着化学工业的发展，化学性眼烧伤有逐年增多的趋势，眼化学烧伤约占 眼外伤的10％左右，占整个工业件危害的5％～20％n引。其中又以碱烧伤为甚。 根据烧伤后的组织反应，一般可分为轻、中、重三种不同程度的烧伤。轻度： 多由稀释的弱碱引起。眼睑与结膜轻度充血水肿，角膜上皮有点状损害或水肿。 数日后消退，上皮修复，不留瘢痕，无明显并发症，视力多不受影响。中度： 多由较稀的碱引起。睑皮肤可起水泡或糜烂，结膜水肿，并有小片缺血坏死灶； 角膜混浊水肿，上皮层完全脱落，形成白色凝固层。严重影响视力，治愈后会 遗留角膜斑翳。重度：多由强碱引起。结膜出现广泛的缺血性坏死，角膜伞层 呈灰白或者呈瓷白色浑浊。由于组织坏死，角膜基质层溶解，出现角膜溃疡或 穿孔，碱可立即渗入前房，引起葡萄膜炎、继发件青光眼和白内障等。角膜穿 孔愈合后会形成前粘性角膜白斑、角膜葡萄种等。结膜的缺损愈合时可造成睑 球粘连，最终引起视功能或眼球的丧失。此外眼睑、泪道的烧伤还可引起眼睑 畸形，眼睑闭合不全、泪溢等并发症。 1、碱烧伤的病理生理及修复：碱性物质与眼球接触后，引起角膜上皮迅速 水肿及坏死脱落，迸一步损伤基质及迅速渗透。结膜和眼睑的烧伤可引起远期 的睑球粘连、睑外翻等后遗症。碱烧伤后的病理过程可分为急性期、角膜溶解 期、组织修复期⋯。 急性期为烧伤后1周内，组织缺血、水肿和广泛坏死，组织内细胞崩解 脱落，角膜胶原纤维板凝固坏死，并伴多核细胞浸润。木实验一周内未取角膜 及结膜组织行病理检查，但大体观察来看存在角膜上皮剥脱缺损，角膜水肿， 与病理过程的组织水肿、坏死相符。 角膜溶解期为烧伤后2—3周，如不干预，该期足组织进入再生和溃疡加 深、扩大、相互交错的过程，此期结膜角膜组织巾充满了多核细胞和成纤维细 胞，结膜和角膜上皮不规则增生。此期对应本实验烧伤后14天，本实验角膜未 见溃疡。 IO 硕士学位论文 组织修复期为烧伤后4周，此期由于长期上皮不能修复及持续组织的局 部炎症，可导致疤痕性睑球粘连及角膜瘢痕性血管化。本实验B组结膜组织由于 羊膜的保护未出现纤维组织增生。 机体对细胞和组织的损伤有很强的修复力，表现为结构和功能不同程 度的恢复，这一过程称修复。修复由损伤周围未受伤的细胞分裂增生来完成。 碱烧伤后有上皮组织的再生，纤维组织的再生和血管的再生，肌肉组织再生等。 图3-5及图3-6可见角膜上皮再生，均可见有纤维细胞增生，这是因为在损伤的 情况下，受损处的成纤维细胞或未分化的间叶细胞转变为纤维细胞。 2、碱烧伤的并发症：包括角膜混浊、血管翳、睑球粘连等。碱烧伤后角膜 常常不能完全上皮化，持续性上皮学孙常导致角膜无菌性溃疡甚至穿孔；烧伤 后的组织炎症诱发大量新生血管长入角膜和角膜疤痕形成；炎症持续引起纤维 组织增生(亦为修复过程)，纤维组织增生可导致后期的结膜囊缩窄、睑球粘 连、闭合不全和泪液分泌及分布功能障碍。因此碱烧伤后对角膜的保护和结膜 的保护是预防并发症的关键。 3、创伤后结膜的修复及睑球粘连的形成：结膜创伤是一个复杂的动态修复 过程，可分为三个阶段：炎性期、增殖期、重塑期u¨。炎症期的主要特点是炎 症反应，伴随有中性粒细胞和单核细胞浸润及组织淤血，血小板释放趋化因子 吸引巾件粒细胞、单核细胞和淋巴细胞进入创伤区，这些炎性细胞进一步释放 其他炎性因子等。增殖期主要是结膜的再上皮化和成纤维细胞活性提高、数量 增加，伴随着新生血管形成和肉芽组织增殖，主要表现为成纤维细胞激活、增 殖和产生基质。结膜重塑期也是成纤维细胞起主要作用，不仪参与伤口的收缩、 新机制的沉积和合成，而且参与创伤修复后的修饰。成纤维细胞产生具有蛋白 分解活性的酶促作用，保障细胞移动进入临时性的胶原基质中，这些酶称为基 质金属蛋白酶可以分解细胞外基质，参与伤U的收缩n2’。31。碱烧伤严重时，结 膜在这个修复过程中，出现结缔组织形成，结膜组织被增生的纤维组织所代替， 在睑球结膜之间形成瘢痕性粘连，碱性化学伤所引起的睑球粘连是各式各样的， 部分的或者是广泛的，这与结膜的坏死程度有关，粘连特别容易发生在两个互 第四章讨论 相接触的表面，结缔组织在结膜下进行性增殖、瘢痕挛缩，可以发展成睑内翻 等畸形。因此对于结膜的保护，预防碱烧伤后睑球粘连，及一些眼睑畸形主要 是减轻损伤，抑制炎症及各种炎症因子的激活，抑制纤维组织增生，隔离受损 结膜之间的接触面。实验中使用的羊膜便可有效抑制炎症，减少碱性物质向眼 内渗入，减轻眼表及眼内损伤。 4、羊膜保护结膜的作用：从本实验结果可以看出，烧伤后一天，两组结膜 充血比较，A组重于B组，有显著差异(乒一3．658，P=-O．000)(见表3-1)。烧伤 后30天，B组眼部结膜瘢痕显著轻于A组(Z=-2．291，P=O．022)。光镜下观察烧 伤30天后结膜组织，可见B组(使用羊膜组)结膜组织的纤维增生轻于A组(未 使用羊膜组)；B组结膜组织层次清晰，上皮组织较完整，A组结膜组织层次不 清，上皮修复不佳；且h组肌肉(眼外肌)组织紧缩，肌纤维收缩，A组肌肉(眼 外肌)形态接近正常横纹肌。这说明结膜下植入的羊膜起到了保护结膜的作用。 分析羊膜的作用机制与以下几点有关：首先羊膜基质中含有一种成分，它可以 抑$1JTGF-13信号传递、抑制正常人角膜缘成纤维细胞的增殖和分化为纤维细胞m’： 第二有研究证明，羊膜可抑制结膜下的瘢痕形成，机制可能与羊膜使巩膜表面 形成一层胶原膜类似一层屏障有关⋯1；这个胶原膜屏障也可减少碱性物质向眼 内渗透，减少全眼球损伤，另外在既往的电镜研究中可见羊膜的一维空间内众 多纤维交织成网状而形成无数网孑L结构，网孔间隙0．5～15um¨1。张亦霞¨1等 推断其三维空间内侧是由胶原纤维和网状纤维相互缠绕组成的一个立体交叉的 纤维网架，在胶原蛋白分了上嵌有蛋白多糖和糖蛋白。羊膜的这种类似海绵的 显微结构，在烧伤后早期植入可以吸附碱性物质，减轻碱性物质对眼表及眼内 的损伤。以上几点不难解释为何B组的结膜恢复较A组好。再有在结膜下植入羊 膜的过程需要剪开结膜分离筋膜，这个操作可能本身清除了坏死物质，起到了 清除碱件物质的作用。碱烧伤后结膜的保护意义重大，因为结膜损伤后带来的 睑球粘连等眼睑畸形不仪严重影响患者的生活质量，还给后期进行角膜移植等 复明手术带来了困难。 5、本实验对于角膜的作用：本实验结果可见烧伤后一天，两组角膜透明度 硕士学位论文 无显著差异(Z=-O．763，P=O．445)，两组均未见新生血管长入，烧伤后30天， 角膜透明度两组无显著差异(Z=-O．421，P>O．05)，角膜新生血管A组与B组无 显著差异(Z=--O．406，P=O．685)。光镜下检查两组角膜亦未见使用羊膜组炎症 浸润及水肿好于未使用羊膜组。提示结膜下植入羊膜对角膜并没有起到保护作 用。虽然已有很多文献研究证明羊膜可以促进碱性角膜烧伤后溃疡的愈合和减 少疤痕的形成n5l，但报道的均是将羊膜覆盖角膜，这样可为角膜上皮的生长提供 理想的基底膜，促进迅速上皮化及创U愈合，还可产生多种生长因了，有利于 上皮化、移行、增生及上皮细胞的粘附性，调节结膜上皮转化为角膜性上皮细 胞，降低损伤角膜的炎细胞浸润，抑制蛋白酶的活性，改善演变生理微环境， 促进愈合等作用n6|。我们的实验将羊膜置于结膜下未能成功提供角膜上皮生长 的基底膜，因此未起到促进角膜的作用。这也从侧面说明，碱烧伤后行羊膜移 植术，羊膜能保护角膜最主要的是其为角膜上皮细胞的生长提供了基底层，重 建了受损的角膜表面。 6、不足：a、操作不易：羊膜柔软有弹性，容易卷边，不易在结膜下铺平，故 结膜切口需开的较大，需要耐心操作；b、虽然该方法对结膜的保护十分明显， 但因为羊膜未覆盖角膜，起不到为角膜上皮的生长提供基底膜的作用，故对角 膜的作用不大。可改进操作，取较大的羊膜全周剪开角巩膜缘处的结膜，分离 筋膜将羊膜置于结膜下同时覆盖角膜，再将结膜与羊膜缝合，这样也许可以起 到同时保护结膜和角膜的作用；C、本实验由于在设计之初认为结膜下植入羊膜 主要可减少角膜并发症的发生，因此在造模时侧重于损伤角膜，从结果看出该 方法主要起到保护结膜预防结膜疤痕的形成，我们反过来想如果换一种造模方 法如直接滴NaOH溶液入结膜囊巾，可能会得到更好的实验结果；d、除改变造模 方法外，在下一步的研究中可在同一只眼中取植入羊膜的结膜组织与未植入羊 膜的结膜组织进行比较；也可在上下球结膜均植入羊膜与药物治疗进行比较。 第五章结论 第五章结论 综上所述，结膜下植入羊膜后可有效的保护受损后的结膜，减轻炎症，抑 制纤维增生，预防睑球粘连等眼睑畸形的发生，严重的睑球粘连及眼睑畸形给 后期进行穿透性角膜移植手术带来困难，预防睑球粘连等眼部畸形可为碱烧伤 后行角膜移植等复明手术提供的更好的条件。但是该方法对于角膜的保护作用 不理想，可通过改进操作方法(取较大的羊膜全周剪开角巩膜缘处的结膜，分 离筋膜将羊膜置于结膜下同时覆盖角膜，再将结膜与羊膜缝合)以达到同时保 护结膜及角膜的作用。另外我们观察期限只是烧伤后30天，长远来讲碱烧伤后 对结膜的保护实质上也是对角膜的保护。该实验研究提示药物联合结膜下植入 羊膜治疗中度碱烧伤的效果优于单独药物治疗；该方法通过改进后可作为碱烧 伤后保护受损结膜的一利-简单的方法，但应用于临床还需进一步研究。 14 硕士学位论文 附 图 图3．1A组烧伤后1天 A 图3．2B组烧伤后l天 Figure3-21 daysafterburnedforB 图3．3A组烧伤后30天 Figure3-330daysafterburnedforA 15 附 图 图3-4B组烧伤后30天 Figure3-430daysafterburnedforB 图3．5A组烧伤后30天角膜组织(10×4) Figure3—5：Corneal30daysafterburnedforA(10×4) 图3．6B组烧伤后30天角膜组织(10X4) Figure3—6：Corneal30daysafterburnedforB(10×4) 16 硕士学位论文 图3-7：A组带肌肉的结膜组织(10X10) Figure3—7-ConjunctivawithmuscleforGroupA(10×10) 图3-8：B组带肌肉的结膜组织(10×10) Figure3-8ConjunctivawithmUSCleforGroupB(10×10) 图3-9：A组不带肌肉组织的结膜组织(10X4) Figure3-9ConjunctivawithoutmuscleforGroupA(i0X4) 17 附 图 图3-10：B组不带肌肉的结膜组织(10×10) Figure3—10ConjunctivawithoutmuscleforGroupB(10×10) 18 硕士学位论文 【1】1 【2】 【3】3 【4】 【5】 【6】 [7】 [8】 【9】 [10】 【1 1】 【12】 【13】 参考文献 张卯年．眼创伤学[M】．第l版．北京：军事医学科学出版社，2007．32 KimJC，TsengSC．Transplantationofpreservedhunmanamnioticmembranefor surfacereconstructionin severelydamagedrabbitcornea[J]．Cornea， 1995．14(2)：473-84 文道源，李舒梅，林卡莉等．新鲜羊膜、冻干羊膜、羊膜细胞外基质的形态 研究【J】．中国实用眼科杂志，2003，21(10)：734．738 张亦霞，张明昌．维生素C浸泡羊膜对眼碱烧伤后移植的可用性研究【J】．眼科 新进展，2006，26(11)：836．838 BaumJ．Thygesonlecture．Amnioticmembranetransplantation：whyis it effective?[J]Comea．2002，2l(4)：339-41 TouhamiA，GrueterichM，TsengSC．TheroleofNGFsignalinginhumanli