TGF_Smad信号通路在肾小球硬化模型中表达的意义

现代生物医学进展 www.biomed.net.cn Progress in Modern Biomedicine 2009 Vol.9 No.23 TGF-β/Smad信号通路在肾小球硬化模型中达的意义 * 张建青 1 于 力 2△ 邓 颖 2 王丽娜 2 郝志宏 2 张 瑶 2 （1广州市番禺区何贤纪念医院儿科 广东广州 511400；2广州市第一人民医院儿科 广东广州 510180） 摘要 目的：通过观察在肾小球硬化动物模型中 TGF-β、Smad2和 Smad7蛋白和 mRNA表达的意义，了解 TGF-β/Smads信号通路 在肾小球硬化中的作用。方法：制备肾小球硬化动物模型，检测 24小时尿蛋白定量、血浆白蛋白及血尿素氮水平，观察肾组织形 态学改变；免疫组织化学检测 TGF-β1、Smad2和 Smad7蛋白水平；荧光定量 PCR检测 TGF-β1、Smad2和 Smad7 mRNA的水平。 结果：TGFβ1、Smad2和 Smad7正常情况下普遍在肾小球系膜细胞、肾小管上皮及间质细胞中有少量表达；模型组 4周时 TGFβ1 和 Smad2蛋白表达增加，Smad7蛋白表达下降；6~8周时 TGF-β1和 Smad2蛋白表达明显增加，Smad7蛋白表达明显下降。模型 组 4周时 TGF-β1和 Smad2 mRNA出现表达上调，6~8周 TGF-β1和 Smad2 mRNA表达明显增加。4周时 Smad7 mRNA表达下 调，6~8周 Smad7 mRNA表达明显下降。模型组与对照组比较有显著性差异（p<0.01）。结论：TGF-β/Smad信号通路参与了肾小球 硬化的纤维化进程，Smad7是 TGF-β/Smad信号通路抑制性调控因子，可能为治疗肾小球硬化提供治疗手段。 关键词：肾小球硬化；转化生长因子 -β；TGF-β/Smad信号通路 中图分类号：R692.31 文献标识码：A 文章编号：1673-6273（2009）23-4460-04 Expression of TGF-β/Smad Signaling Pathway and Its Significance in Glomerulosclerosis Model* ZHANG Jian-qing1, YU Li2△, DENG Yin2, WANG Li-na2, HAO Zhi-hong2, ZHANG Yao2 （1 Department of Pediatrics, Panyu He xian Commemorative Hospital of Guangzhou, Guangzhou 511400, China； 2 Department of Pediatrics, Guangzhou First Municipal People's Hospital, Guangzhou 510180, China） ABSTRACT Objective: According to observe the expression of TGF-β, Smad2 and Smad7 in glomerulosclerosis model, investigate the significance of TGF-β/Smad Signaling Pathway in the development of glomerulosclerosis. Methods: 36 rats were randomly divided into control group and model group. Adriamycin nephropathy was induced in rats in the model groups by intravenous injection of adriamycin. The levels of 24 h urine protein (Upr) , blood album(Alb) and blood urea nitrogen (BUN) of rats in each group were examined. The expression levels of TGF-β, Smad2 and Smad7 in renal tissue were detected by immunohistochemical method and fluorescent quantitation PCR. Results: TGF-β, Smad2 and Smad7 express fewly in mesangial cell, tubules epithelium and interstitial cell. The levels of TGFβ1, Smad2 protein and mRNA in renal tissue were increased in model group in the fourth, the sixth and the eighth week as compared with those in the control group. While the levels of Smad7 protein and mRNA were decreased gradually compared with control group. Conclusion: TGF-β/Smad Signaling Pathway Chinese participates in the development of glomerulosclerosis. Smad7 maybe the inhibitor of TGF-β/Smad Signaling Pathway ,which will be a new therapy to glomerulosclerosis. Key words: glomerulosclerosis; TGF-β; TGF-β/Smad Signaling Pathway Library Classification（CLC）: R692.31 Document code: A Article ID:1673-6273（2009）23-4460-04 *基金项目：番禺区科技项目（2007-Z-78-1） 作者简介：张建青，女，主任医师，主要研究方向：小儿呼吸与肾脏 电话：13318896596 △通讯作者：于力，教授，硕士研究生导师，Email：yuli828@yeah.net （收稿日期：2009-09-27 接受日期：2009-10-30） 前言 转化生长因子 β(transforming growth factor-β,TGF-β)是一 种多功能的细胞因子。按照结构和生物学功能的不同，TGF-β 在调节许多基本的生物学过程，如细胞的增殖、分化，胚胎发 育、器官形成、组织的修复和凋亡中起着重要的作用[1]。Smads 蛋白是目前所知的唯一的 TGF-β受体的胞内激酶底物，介导 了 TGF-β的胞内信号转导。已有的研究证实，TGF-β及其细胞 内信号蛋白 Smads的激活在多种器官和组织(如肾、肝、肺、心 等)的纤维化过程中发挥着重要作用。已经证实 Smads蛋白是 TGF-β/Smad信号通路中细胞内信号转导的中介分子[2]，肾小球 硬化和纤维化进程与 TGF-β高表达有关，其细胞内信号分子 Smads蛋白在肾小球硬化中表达变化尚未见报道。本研究通过 观察在肾小球硬化动物模型中 Smad2和 Smad7蛋白和 mRNA 的表达，了解 TGF-β/Smads信号通路在肾小球硬化和肾间质纤 维化中的作用。 1 材料与方法 1.1 实验动物模型制备及分组 雄性 SD(Spraque-Dawley)大鼠，购于广州医学院实验动物 4460· · 现代生物医学进展 www.biomed.net.cn Progress in Modern Biomedicine 2009 Vol.9 No.23 中心，标准大鼠饲料喂养，自由饮食。大鼠随机分成 2组，对照 组和模型组，每组按时间点分为第 4周、第 6周和第 8周，各 6 只，共 36只。模型组尾静脉注射阿霉素（注射用盐酸多柔比星， 由深圳万乐药业有限公司提供）5mg/kg，第 7天重复由尾静脉 注射阿霉素 3mg/kg；对照组在相应时间点注射生理盐水替代。 各组于第二次注射阿霉素后开始计算天数，于第 4周、第 6周 和第 8周各组处死大鼠。 1.2 观察指标及方法 1.2.1 24小时尿蛋白定量 分别在处死大鼠前一天，每组随机 选取 6只大鼠入代谢笼，留取 24小时尿液，用溴甲酚氯仿法测 定 24h尿蛋白定量。 1.2.2 血液生化检测 分别在处死大鼠前一天，每组随机选取 6 只大鼠入代谢笼，10%水合氯醛 0.5ml/100g腹腔注射麻醉后， 将大鼠置于手术台，暴露肾脏和腹主动脉。经腹主动脉采血 3ml送检，进行血浆白蛋白及血尿素氮水平检测。 1.2.3 肾组织形态学检查 大鼠处死采血后迅速取出一侧肾脏， 将肾皮质平均分为 6小块，每块重约 100g，放入液氮罐冻存， 用于提取 RNA。剪取另一侧肾脏，取少许肾皮质，常规石蜡包 埋切片，HE染色，光镜下观察肾脏组织病理学改变。 1.2.4 免疫组织化学检测 TGF-β1、Smad2和 Smad7蛋白水平 采用 SABC免疫组化试剂盒（SA1022），购自武汉博士德公司。 石蜡切片，二甲苯脱蜡至水，抗原修复，BSA封闭，TGF-β1 和 Smad2、Smad7一抗工作液浓度为 1：200，采用 DAB显色，苏木 素复染后，逐级脱水，中性树胶封片。片中出现棕黄色颗粒为阳 性结果，每组染色以 PBS代替一抗作为阴性对照，以一抗试剂 公司提供的阳性对照片作为阳性对照。采用捷达 801高清晰形 态学图像分析系统对肾组织免疫组化结果进行半定量分析。用 积分光密度表示物质的相对含量。 1.2.5 荧光定量 PCR检测 TGF-β1、Smad2和 Smad7 mRNA的 水平 采用 trizol法（Invitrogen life technologies公司）一步法提 取肾脏肾皮质总 RNA，紫外分光光度计测定 RNA的纯度及含 量。TGFβ1及内参照 β-actin引物由北京赛百盛基因公司合成。 TGFβ1 引 物 为 sense 5'-GTGGACCGCAACAACGCA-3'， Anti-sense 5'-ACCAAGGTAACGCCAGGAAT-3', 大 小 为 209bp；Smad2引物 sense 5'- GTTCCTGCCTTTGCTGAGAC -3' ，Anti-sense 5'- TCTCTTTGCCAGGAATGCTT -3'，大 小 为 220bp；Smad7引物 sense 5'-TCCTGCTGTGCAAAGTGTTC-3'， Anti-sense 5'-TCTGGACAGTCTGCAGTTGG-3'，大小为211bp； β-actin引物序列为 Sense 5-GACCTTCAACACCCCAGCCA-3， Anti-sense 5-GTCACGCACGATTTCCCTCTC-3，大小为 258 bp。取 2ul RNA进行逆转录反应合成 cDNA，随后采用 25ul反 应体系进行 PCR反应。将 β-actin PCR产物回收后等比稀释为 不同浓度的 DNA片段，再同时 PCR，做出标准曲线，以其他基 因与 β-actin同时在相应退火温度进行 PCR，做出标准曲线的 同时，可以得到相应基因表达含量。 1.2.6 统计学方法 检验结果用 x±s表示，采用 SPSS 13.0统计 软件，多组均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）， 两两比较采用 LSD法，p＜0.05为显著性差异，有统计学意义。 2 结果 2.1 各组 24h尿蛋白定量变化 模型组 2 周时即出现大量蛋白尿，4 周时蛋白尿持续增 加，6周达高峰，8周仍维持在较高水平。模型组与对照组比较 均有显著性差异（p<0.01）。见表 1。 2.2 血液生化指标的变化 模型组 4~8周血浆白蛋白持续降低；模型组与对照组比较 均有显著性差异（p<0.01）。模型组 4周至 8周血尿素氮增高， 肾功能受损，并出现肾功能急剧恶化。模型组与对照组比较均 有显著性差异（p<0.05）。见表 2。 2.3 肾组织病理学改变 光镜检查见模型组 4周系膜细胞增生和上皮细胞空泡变 性，细胞外基质逐渐增加。6周细胞外基质明显增多，毛细血管 塌陷，出现部分局灶节段性硬化。8周肾小球数量明显减少，肾 小球内出现玻璃样变，80%肾小球结构破坏，肾小管萎缩呈肾 小球硬化的改变。见图 A1~A4。 2.4 TGF-β1、Smad2和 Smad7蛋白表达水平的变化 正常情况下 TGFβ1、Smad2和 Smad7普遍在肾小球系膜 细胞、肾小管上皮及间质细胞中有少量表达，在胞浆内出现浅 棕色颗粒呈弱阳性。模型组 4周时 TGFβ1和 Smad2蛋白表达 明显增加，在增生的细胞胞浆中出现深棕色颗粒为强阳性表 达。随着病变的进展，细胞逐渐空泡变、数量减少，6~8周时在 残存的系膜细胞中，仍见强阳性的棕色颗粒。TGF-β1和 Smad2 免疫组化半定量分析与对照组比较，各组均有显著性差异 （p<0.01）。相反，模型组 4周时 Smad7蛋白表达下降，随着病变 的进展，6~8周时 Smad7蛋白表达明显下降。TGF-β1、Smad2 和 Smad7免疫组化半定量分析与对照组比较，各组均有显著 性差异（p<0.01）。见表 3。 2.5 TGF-β1 mRNA表达水平的变化 模型组 4 周时 TGF-β1 和 Smad2 mRNA 出现表达上调， 6~8周 TGF-β1和 Smad2 mRNA表达明显增加。4周时 Smad7 mRNA表达下调，6~8周 Smad7 mRNA表达明显下降。见表 4。 注：与对照组比较▲▲P<0.01 Note: Compared with control group,▲▲P<0.01 表 1 各组 24h尿蛋白定量结果（x±s，mg/24h） Table 1 Quantitation of 24-hour urine protein（x±s，mg/24h） Groups N The 4th week The 6th week The 8th week Control group 6 16.73±3.79 15.39±3.28 16.84±2.84 Model group 6 60.62±4.68▲▲ 95.39±8.43▲▲ 88.59±22.29▲▲ p <0.01 <0.01 <0.01 4461· · 现代生物医学进展 www.biomed.net.cn Progress in Modern Biomedicine 2009 Vol.9 No.23 注：与对照组比较▲p<0.01 Note: Compared with control group,▲P<0.01 3 讨论 肾小球硬化是各种原因引起的肾小球损伤的晚期变化，是 终末期肾的基本病变。认为 TGF-β1主要通过促进细胞外基质 注：与对照组比较▲p<0.01 Note: Compared with control group,▲P<0.01 表 2 各组血白蛋白及尿素氮变化（x±s，g/L，mmol/L） Table 2 Changes of blood album and blood urea nitrogen（x±s，g/L，mmol/L） Groups N The 4th week The 6th week The 8th week Alb BUN Alb BUN Alb BUN Control group 6 34.2±3.5 4.72±1.0 38.7±1.9 5.5±0.7 39.5±3.7 5.4±0.9 Model group 20.5±1.6▲ 8.7±1.6▲ 19.4±2.3▲ 10.2±2.6▲ 12.6±2.5▲ 23.2±3.5▲ p <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 图 A1~A4 模型组及对照组肾组织形态学改变（HE染色，×40） Fig.A1 to A4 Morphology changes of nephridial tissue in each group (HE staining,×40) 注：图 A1：模型 4周，系膜细胞增生和上皮细胞空泡变性，系膜基质增多，可见钉状突起。图 A2：模型 6周，细胞外基质明显增多，毛细血管塌陷， 基底膜皱缩，肾小球囊扩张，出现局灶节段性硬化。图 A3：模型 8周，肾小球硬化加重，肾小球囊增厚，玻璃样变，肾小管萎缩。图 A4：对照组，肾小 球结构清晰，HE染色下细胞核染成蓝色，胞浆红色。 Note: Fig.A1: At the fourth week, model group shows mesangial cellular proliferation, epithelial cellular vacuolar degeneration and groundplasm increase, nail apophysis can be seen. Fig.A2: At the sixth week of model group, Extracellular Matrix increased obviously, blood capillary collapsed, basilar membrane shrunken, glomerular capsule expanded and focus and segmented sclerosis occurred . Fig.A3: At the eighth week of model group, glomerulosclerosis aggravated, glomerular capsule thickened and shows hyaline degeneration, kidney tubules shrunken. Fig.A4: In the control group, architecture of glomerulus was clear, nucleus became blue and cytoplasm became red after HE staining. Index N Control group Model group The 4th week The 6th week The 8th week The 4th week The 6th week The 8th week TGF-β1 6 1.20±0.08 1.19±0.12 1.20±0.07 3.10±0.17▲ 4.46±0.15▲ 5.55±0.12▲ Smad2 6 1.11±0.04 1.09±0.14 1.16±0.10 4.38±0.13▲ 4.56±0.14▲ 5.85±0.19▲ Smad7 6 1.08±0.05 1.03±0.07 1.07±0.18 2.38±0.07▲ 2.51±0.12▲ 2.45±0.12▲ p >0.05 >0.05 >0.05 <0.01 <0.01 <0.01 注：与对照组比较▲p<0.01 Note: Compared with control group,▲P<0.01 表 3 各组 TGF-β1、Smad2和 Smad7蛋白表达变化（x±s） Table 3 Changes of TGF-β1, Smad2 and Smad7 protein in each group（x±s） Index N Control group Model group The 4th week The 6th week The 8th week The 4th week The 6th week The 8th week TGF-β1 6 3.70±0.77 3.09±0.44 3.13±0.38 13.10±1.37▲ 12.43±1.15▲ 11.65±1.07▲ Smad2 6 2.71±0.35 3.12±0.37 2.16±0.11 10.38±1.53▲ 11.05±1.32▲ 12.35±2.21▲ Smad7 6 3.08±0.43 2.98±0.91 2.18±0.14 4.64±1.57▲ 5.29±1.49▲ 5.55±1.15▲ p >0.05 >0.05 >0.05 <0.01 <0.01 <0.01 表 4 各组 TGF-β1、Smad2和 Smad7 mRNA表达变化（x±s） Table 4 Changes of TGF-β1, Smad2 and Smad7 mRNA in each group（x±s） 4462· · 现代生物医学进展 www.biomed.net.cn Progress in Modern Biomedicine 2009 Vol.9 No.23 沉积 /降解减少，进一步促进肾小球硬化的进程[3]。TGFβ具有 双重调节作用，高浓度是抑制细胞增殖，低浓度促进细胞增殖。 TGFβ1促进 ECM的沉积，首先 TGFβ1可明显增加细胞外基 质成分如胶原Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ及纤粘连蛋白的表达。TGFβ1可在转 录和翻译水平上对胶原蛋白产生影响，上调 mRNA表达，使胶 原组织合成增加。其次通过减少基质金属蛋白酶的表达以及促 进纤溶酶原激活剂抑制物和影响金属蛋白酶组织抑制剂 (TIMPs)的合成来减少 ECM的降解。TGFβ1可促进 ECM的合 成和沉积，进而加速肾小球硬化过程。TGF-β是各种肾病肾小 球硬化和肾间质纤维化发生、发展的必需因子，其过度产生在 许多肾病中引起不可逆的间质纤维化[4]。体外实验或动物模型 表明几乎所有孤立的肾小球硬化单个危险因素都能影响 TGF-β的表达，支持 TGF-β在肾小球硬化的形成和发展中发 挥重要作用。 Smad蛋白家族是近几年发现的 TGF-β超家族细胞内信 号转导分子，Smad通路是目前所公认的介导 TGF-β胞内反应 的主要通路，使 TGF-β在细胞内信号转导的研究取得突破性 进展。Smads蛋白按结构和功能分为 3类[5]：第 1类是受体调节 型 Smad 蛋白(R-Smads)包括 Smad1、Smad2、Smad3、Smad5 和 Smad 8；第 2 类是共同调节型 Smad 蛋白 (Co-Smads)，即 Smad4；第 3 类是抑制型 Smad 蛋白(I-Smads)，包括 Smad6 和 Smad7。其中 Smad2，3，4，7蛋白参与 TGF-β/Smad信号转导。 磷酸化的 TGF-β受体 I(TβRI)可结合并活化 R-Smads，从而解 除了 R-Smads蛋白 N端 MH1 区和 C 端 MH2 的相互抑制作 用，与Ⅰ型受体分离，并与 Smad4形成异聚体转录复合物，进 入核内，调节靶基因的转录。Song等[6]研究表明肾小球疾病可 能是由氧化的低密度脂蛋白(Ox-LDL)诱导 TGF-β/Smad 通路 刺激系膜细胞中 PAI-1 升高引起的，进而引起细胞外基质 (ECM)合成增加而降解减少。但 Smad7可竞争性地与活化的Ⅰ 型受体牢固结合，阻止 R-Smads的磷酸化，抑制信号转导。 Hul-lett等[7]也发现在 F344大鼠的肾移植给 Lew受体(F344至 Lew)的肾小球硬化实验模型中给予 1,25-(OH)2D3，受体移植 肾寿命明显延长，而且能预防肾小球硬化相关的组织学改变， 并且移植物中的 Smad2表达明显减少，而 Smad7蛋白表达增 加。这些进一步表明 TGF-β/Smad通路是导致肾小球硬化和肾 间质纤维化的关键通路。我们的前期工作[8,9]已经观察到肾病患 儿外周血单个核细胞 TGF-β的变化与意义，认为测定外周血 单个核细胞中 TGF-β蛋白和 mRNA表达可作为观察病情活动 的免疫学指标。 我们的研究，利用免疫组化染色，发现 TGF-β、Smad2和 Smad7主要在正常肾组织的肾小球系膜细胞、肾小管上皮及间 质细胞中有少量表达。与对照组相比，Smad2蛋白和 mRNA表 达在肾小球硬化中的表达均明显增加，与 TGF-β1上调呈正相 关；而 Smad7蛋白和 mRNA表达却明显下降，与 TGF-β1上调 呈负相关。随着肾小球硬化的加重 Smad2蛋白和 mRNA的表 达逐渐增加，而 Smad7蛋白和 mRNA的表达逐渐减少，说明肾 组织和肾细胞内确实存在有 Smad2正调控和 Smad7负调控的 平衡。 因此，我们认为 TGF-β/Smad信号通路参与了肾小球硬化 纤维化进程，Smad2蛋白正调控过度和 Smad7负调控不足是 导致肾小球硬化和肾间质纤维化的主要原因。在肾小球硬化中 Smads蛋白与 TGF-β的信号转导关系密切，深入了解 TGF-β 胞内信号转导蛋白 Smads与肾小球硬化和肾间质纤维化的关 系，有助于防止肾小球硬化的发生和发展[10]。因此，应用 Smads 蛋白拮抗剂及 Smads蛋白序列基因通过某种途径转入体内是 今后临床上防治肾小球硬化的有效手段。但 TGF-β胞内信号 转导蛋白 Smads 与肾小球硬化的关系尚不清楚，通过观测 Smad2和 Smad7蛋白和 mRNA的表达在肾小球硬化中作用， 有助于深入研究 TGF-β在肾小球硬化中作用的分子机制和肾 小球硬化的发病机理。为进一步探讨阻断 TGF-β表达，延缓肾 小球硬化的进展提供新的思路。 参考文献（References） [1] Cheng J, Grande J P. 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