抗沙丁胺醇单克隆抗体制备与鉴定

安徽农业科学，JournalofAnhuiA咖．Sci．2011，39(10)：5931—5932 责任编辑赵艳梅责任校对李岩 抗沙丁胺醇单克隆抗体制备与鉴定 李春生1，吴萌1，李君华1，齐颖颖1，李玉静2，闫静辉h (1．河北省科学院生物研究所，河北石家庄050081；2．河北交通职业技术学院，河北石家庄050035) 摘要[目的]制备特异性抗沙丁胺醇单克隆抗体，为其免疫学检测的建立奠定基础。[方法]用SAL-BSA抗原免疫BALB／c小鼠； 使用细胞融合技术建立抗SAL的单克隆抗体(SALmAh)杂交瘤细胞株；体内诱生腹水法制备sALmAb。并鉴定其免疫学特性。[结果] 筛选出2I)9和lC4两株杂交瘤细胞。其细胞培养上清效价达l：104，腹水效价达1：10。；免疫球蛋白亚型鉴定为IgG。；抗体对SAL的半数 抑制浓度(IC。)为1．14ng／nd；与沙丁胺醇和盐酸克伦特罗的交叉反应率(CR)分别为100．00％和26．09％，与其他化舍物无交叉反应。 [结论]获得了高效价、敏感且异性的抗SAL抗体，为沙丁胺醇残留的免疫学检测方法的建立奠定了基础。 关键词沙丁胺醇；杂交瘤；单克隆抗体 中图分类号$851．34+7文献标识码A 文章编号0517—66ll(2011)10—05931—02 PreparationandIdentificationofMonocionalAntibodiesagainstSallmtamol LIChun·shengetal(BiologyInstitute，HebeiAcademyofScience，Shijiazhuang，Hebei050081) Abstract[Objective]Topreparespecificmonoclonalantibodiesagainstsalbutamolandthustoprovidethebasisfortheimmunologicaldetec- fion．【Method]BAIB／CmicewereimmunizedwithSAL-BSA．Hybridomalines(SALmAb)secretingmonoclonalantibodyagainstSALweree8- tablishedthroughcellfusion．Ascitesof卧LLmAbwereprepared加v／voandtheimmunologicalcharacteristicswereobserved．[Result]Twohybri． domalines，2D9andlc4，wereestablished，andtheindirectEUSAtitersofthecellsupematantandasciteswere1：l×104andl：1×106，respec． tively．TheirisotypewasIgGI．11lemedianinhibitoryconcentration(IC蜘)oftheSALmAbagainstSALWaS1．14ng／=d．Ithadcm够一reactivityof 100．00％againstsalbutamoland26．09％againstclenobuterolhydrochloride．andnocross—reactionwasfoundbetweentheSALmAbandother compounds．[Conclusion]‰hi#一titer，semitiveandspecificanti—SALmonoclonalantibodieshavebeenproduced，whichmakesitpossibletO developimmunoassayfordetectionofSALresidues． Keywords$albutamo；Hybridomns；Monoclonalantibody 、。 沙丁胺醇(salbutamol，SAL)，又名舒喘宁，为选择性B2 受体激动剂。对动物具有促进骨骼肌(瘦肉)生长，减少脂肪 蓄积等作用。常在猪、牛、鸡等畜禽的生产中非法用作促生 长剂，可提高饲料转化率、增加瘦肉产量。但是，食品中沙丁 胺醇的残留能引起心悸、头疼、目眩、呼吸困难，严重影响人 们的健康¨J。另外，检测沙丁胺醇残留的技术手段也相对滞 后。因此，一些不法分子为谋取经济利益，在养殖场非法使 用沙丁胺醇代替“瘦肉精”克伦特罗作为促生长剂旧。1。 目前，检测沙丁胺醇的方法有气相色谱一质谱联用法 (GC·MS)、)高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱联用法 (LC．MS)以及酶联免疫吸附法(ELISA)等p⋯。GC．MS、 HPLC和LC．MS方法准确可靠，但前处理繁琐，对仪器设备 以及操作过程的要求较高，不适于生产、基层单位及现场检 测。ELISA检测是一种基于抗原抗体反应和酶化学反应的 检测方法，具有快速、灵敏、操作简单和一次检测样品量大的 特点，而且不需要复杂昂贵的的仪器设备，对操作者的专业 要求也比较低¨川J。 1材料与方法 1．1试验动物8周龄BALB／e小鼠由河北实验动物中心 提供。 1．2主要试剂和仪器小鼠SP2／0骨髓瘤细胞、免疫原 SAL广BSA和检测原SAL-OVA(卵清蛋白)由河北省科学院生 物研究所细胞生化研究室保存和制备。HAT培养基、HT培 养基、PEG4000、福氏完全佐剂和不完全佐剂以及小鼠单克隆 基金项目 作者简介 收稿日期 河北省科技支撑项目(09227134D)；石家庄市科技支撑 计划项目(10150142A)。 孛春生(1981一)，男，河北平采人，助理研究员，硕士，从事 抗体应用研究，E—mail：hebeiswjc@sina．eom。·通讯作者。 E—mail：yanjinghui@126．corn。 20ll旬l—ll 抗体亚型鉴定试剂盒均购自Sigma公司；DMEM培养基和细 胞培养板购自GIBCO公司；HRP标记羊抗小鼠I如购自北 京中杉金桥生物科技有限公司。其他试剂均为纯。 1．3动物免疫选择8周龄BALB／c小鼠，初次基础免疫采 用颈背部皮下多点注射福氏完全佐剂与等体积免疫原SAL- BSA；二次基础免疫采用颈背部皮下多点注射福氏不完全佐 剂与等体积免疫原SAL-BSA。免疫间隔为2周。断尾取血 分离血清，间接EHSA检测小鼠血清抗体效价。选取最佳免 疫小鼠，于融合前3d腹腔注射免疫原50嵋加强免疫。 1．4杂交瘤细胞株的建立悼o①细胞融合。取对数生长 期的小鼠SP2／0骨髓瘤细胞与免疫脾细胞，按常规方法进行 融合。②阳性细胞克隆。检测培养上清抗体效价。选择强阳 性细胞进行克隆，采用有限稀释法连续亚克隆，直至100％阳 性。得到稳定分泌高特异性、高效价、高亲和力抗体的杂交 瘤细胞株，保存于液氮中。 1．5单克隆抗体的制备及其效价和亚型检测将克隆及扩大 培养的杂交瘤细胞注入提前致敏的BALB／c小鼠腹腔，诱生腹 水产生抗SAL单克隆抗体。收集3—9ml腹水进行抗体的纯 化，采用SDS-PAGE法检测抗体纯度睁枷1，并用凝胶成像系统 进行分析；采用紫外吸收法测定抗体浓度；采用间接ELISA法 测定抗体效价；使用抗体亚型试剂盒鉴定抗体亚型。 1．6抗体敏感性与特异性测定采用阻断ELISA法测定抗 SAL单克隆抗体的敏感性和特异性。以吸光率B／B0(B为 SAL不同浓度下的A蜘值；B。为SAL标准浓度的A椭 值)为纵坐标，以不同浓度SAL的对数值为横坐标，绘制标准 抑制曲线，根据IC∞判定抗体敏感性。检测抗SAL单克隆抗 体与沙丁胺醇、盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、异丙肾上腺素和 去甲肾上腺素的交叉反应性，根据交叉反应率(Cross舢． don，CR)判定抗SAL单克隆抗体的特异性。 万方数据 安徽农业科学 2011生 CR=(沙丁胺醇的IC铂／各结构类似物的IC∞)×100％ (1) 2结果与分析 2．1小鼠杂交瘤细胞株的建立小鼠血清抗体效价检测结 果表明，小鼠的免疫效果较好，抗体效价均达到了l：103一l： 104，IC∞最低为270I∥“。选择免疫效果最好(抗体效价为 l：2．56X104)的小鼠用于细胞融合，平均每孔有1—2株融合 细胞生长，融合率为100％。经阳性细胞克隆后，获得6株杂 交瘤细胞，分别测定其IC柏，筛选出2株高效价、敏感、特异的 杂交瘤，分别命名为2D9和IC4。 2．2抗体的制备及纯化将筛选得到的2139和1C4杂交瘤 细胞分别注射到成年BALB／c小鼠腹腔，收集腹水，经蛋白 纯化后，获得蛋白含量为3．6me／．a，纯度达78％一86％。经 间接EHSA效价检测，2D9杂交瘤细胞株的细胞培养上清液 和腹水抗体效价分别为l：2．56X104和l：4．096×106；1C4杂 交瘤细胞株的细胞培养上清液和腹水抗体效价分别为l： 1．28X104和l：2．048×106。经抗体亚型鉴定，2139和1CA细 胞株所分泌的抗体均为IgG。。 裹1 SAt,mAb的间接ELISA效价 TabIel IndirectELISAliterofanti-SALmAb 杂交瘤细胞株 细胞培养上清液 腹水 生堕垫竺型塑 型竺塑丝型丝堕 2139 l：2．56×104 l：4．096×10‘ lCA 1：1．28X10' 1：2．048×106 2．3抗体敏感性根据吸光率和不同浓度SAL的对数值所 绘制标准抑制回归曲线(图1)。曲线回归方程为Y= 一32．595x+48．1(r=0．9841)，，c∞为1．14ng／“，表明抗 SAL单克隆抗体对SAL具有较高的敏感性。 肆芒 薹_：耋- 许互 器量 聋昌 ≥ 坞。【s^L妇咖1)】 圈1抗SAL单克隆抗体的标准抑制回归曲线 啦．1 ICm-basedregresaon删ofSAILmAbdeterminedby blockingELISA 裹2抗SAL单克隆抗体与SAIL及其类似物的交叉反应性 Table2 C嗍．realitybeCwemSAILmAbamiSALmmiogo嵋。嘶 pounds 当Uo厶物mPound．s 陀。∥形d 交叉Uroe竺si'删率．1鬈Vlt％y- 沙丁胺醇Salbutamol 1．14 100．00 盐酸克伦特罗Clenhuterol4．37 26．09 莱克多巴胺 2．00×104 <0．Ol Bactopamine 异丙肾上腺素 2．00X10' <0．Ol Isoproterenol 去甲肾卜腺素 2．(30x104 <0．Ol !!塑!Pi堡eb巫堡 2．4抗体特异性抗SAL单克隆抗体对盐酸克伦特罗有 26．09％的交叉反应性，对莱克多巴胺等其他肾上腺激素类 无交叉反应，说明所制备的抗SAL单克隆抗体具有很高的特 异性(表2)。 3结论与讨论 单克隆抗体的交叉反应性表示单抗与竞争结合物的结 构特异性，是揭示类似化合物与其交叉的重要化学参数。制 备的抗SAL单克隆抗体除对沙丁胺醇具有特异性反应外，还 对盐酸克伦特罗有一定的交叉反应，这可能是由于在抗原合 成过程中，沙丁胺醇产生了与盐酸克伦特罗相似的化学结 构。也有文献曾报道，制备的抗SAL抗体对盐酸克伦特罗都 有较高的抑制率¨卜12】。该研究中，抗SAL抗体对盐酸克伦 特罗的抑制效果不是很明显。抑制率为26．09％。因此，可通 过进一步优化来消除对盐酸克伦特罗的抑制效果。 免疫学方法具有灵敏度高、过程简单和分析速度快等优 点，可作为首筛法对大量样品进行快速筛选分析，再将疑似 阳性样品使用确证分析法进行确证，这样可以降低大批量样 品的分析成本并提高分析效率。沙丁胺醇为小分子物质，将 其连接到大分子蛋白载体上，借助载体蛋白的T细胞表位间 接诱导B细胞激活、分化与增殖，从而产生特异性抗体。抗 小分子物质抗体的免疫学特性主要体现在抗原抗体反应的 结合容量、敏感性和特异性。笔者制备的抗SAL单克隆抗体 效价达到了l：106，其敏感性(IC卯)为1．14ng／ml，且对SAL 具有较强的识别能力，与克伦特罗的交叉反应率为26．09％。 与其他化合物均无交叉反应。因此，通过该研究获得了高效 价、敏感、异性的抗SAL抗体，为沙丁胺醇残留免疫检测方法 的建立奠定了基础。 参考文献 [1]KIMYs，SAINZRD，FERLAZZOJ，eta1．Effect《maternaladminimra- tionofsalbutar∞ltosowsollpoetnatal粤m汕andc￡m∞characteristicsin theprogencyAustrilian[J]．AgricuhureResearch，1994，45(7)：271—272． [2]HANSENJA，NEIESSENJL，GOODBANDRD，eta1．Interactiveeffects amongp啦'ueinsomatropintheBeta-adrener西cagordstsabutamol，anddi- etaryLysineon掣m曲pe商wm∞ceandnitrogenbalanceoffinishingswine [J]．JournalofAnimalScience，1994，72(3)：1540—1541． [3]WARRISSPD，BROWNSN，ROLPHTP,eta1．Interactionsbetweenthe beta-adrenergicagonistsalbutamolandgenotype011Ⅱ删qualityinpip [J]．Journal0fAnimalScience，1990．68(1)：3669—3676． [4]刘宣兵，庞玉芳，侯玉泽。等．沙丁胺醇的毒副作用及其残留检测[J]． 上海畜牧兽医通讯．2008(4)：83—84． [5]GUYD，ANNEBD．Determination0f母·唧is协inurineby811enzyme Immunoa娜basedontheu∞ofallanti—salbutamolantiserum[J]．Analyt- icaChimicaActa，1993，275(6)：241—247． 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