沙丁胺醇免疫原的合成与鉴定

2010年第5期 沙丁胺醇免疫原的合成与鉴定 吴玉苹1’2王 宾¨，王自良2，张海棠2 (1．中国农业大学生物学院，北京100094；2．河南科技学院动物科学学院，河南新乡453003) 摘要：将沙丁胺醇(SAL)经过琥珀酸单酯化后，采用混合酸酐法与载体蛋白偶联，用紫外扫描 (UV)和变性凝胶电泳(SDS—PAGE)方法检验偶联效果，推算分子结合比；制备全抗原后免疫 BALB／c小鼠，间接EI。ISA测定多抗血清效价，阻断EI。ISA鉴定其敏感性。UV和SDS—PAGE 分析结果表明，成功制备了BSA—HS—SAL，SAL—HS与BSA的分子结合比为11：1；ELISA结 果表明，获得了高效价、敏感的SAL多克隆抗体，为SAL残留免疫学检测方法的建立奠定了基础。 关键词：沙丁胺醇；人工抗原；合成；混合酸酐法；鉴定 中图分类号：$859．84文献标识码：A 文章编号：1004—3268(2010)05一0114—04 IdentificationoftheArtificiallySynthesizedSalbutamolAntigen WUYu—pin91”，WANGBinh．WANGZi—lian92，ZHANGHai—tan92 (1。CollegeofBiologicalScience，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100094，China； 2．TheAnimalScienceCollege，HenanInstituteofScienceandTechnology，Xinxiang453003，China) Abstract：Inthisstudy，themixedanhydridereactionwasemployedtoconjugatesalbutamolsul— fate(SAL)withlargecarrierprotein．ThemonosuccinylderivativeofSAL(SAL—HS)waspre- paredbymixingtheSALhaptenwithsuccinicanhydrideinagivencondition，linkedtobovinese— rumalbumin(BSA)andaBSA—HS—SALconjugationobtained．TheimmunogenofBSA—HS— SAI。wasidentifiedbyUVspectrogramandSDS—PAGE．BALB／cmicewereimmunizedwith BSA—HS—SALandthetitreofpolyclonalantibody(pAb)wasdeterminedbyindirectELISA． ThesensitivityofpAbwasidentifiedbyblockingELISA．TheresultsofUVspectrogramand SDS—PAGEshowedthatthecharacteristicpeakofBSA—HS—SALhasbeenchangedcompared toBSAandSAL．TheCOniugationratioofSALtoBSAwasabout11：1．pAbsanti—SALof hightiterandsensitivityhavebeenproducedbyimmunizingBALB／cmice，whichmadeitpossi— bletoestablishimmunoassayfordetectingSALresiduesinfeedandanimalfood． Keywords：Salbutamol；Aritificialantigen；Synthesis；Mixedanhydridereaction；Identification 沙丁胺醇(Salbutamol，SAL)，又名羟甲异丁肾 上腺素，羟甲叔丁肾上腺素，化学名1一(4一羟基一3一 羟甲基苯基)一2一(叔丁氨基)乙醇，是一种人工合成 的B2一肾上腺素受体激动剂(B2一激动剂)【l】，其中 有活性作用的是R一型沙丁胺醇，临床常用其硫酸 盐形式治疗支气管哮喘[2]。此外，SAL还具有一定 的营养重分配作用[3巧J，常被用作饲料添加剂非法用 于肉用畜禽生产。为防止SAI。超标的畜产品进入 市场，必须建立一种简便、快速、灵敏、准确的检测方 法，对SAI。残留进行有效的监测。目前，SAL的残 留检测主要依靠理化检验方法，如气相色谱(GC)、 高效液相色谱(HPLC)、气一质联用(GC—MS)、液一 质联用(HPLC—MS)等f6]，尽管这些方法有很高的 灵敏度和准确性，但存在需要昂贵的仪器、样品前处 理复杂、繁琐费时、不能现场操作等缺陷，限制了其 应用[7]。免疫学分析方法由于具有灵敏、快速、特 收稿日期：2009一10—16 基金项目：国家“十一五”科技支撑重大项目(2006BAK02A21／I) 作者简介：吴玉苹(1978一)，女，河南延津人，讲师，硕士．主要从事动物微生物与免疫学研究。 *通讯作者：王宾(1957一)，男，北京人，教授，博士，博士生导师，主要从事动物疫苗的研究和开发工作。 ·114· 万方数据 河南农业科学 异、简便等优点，近年来国内外在兽药、农药残留检 测领域广泛应用‘8‘。本研究采用混合酸酐法制备 BSA—HS—SAL人工抗原，旨在为SAL残留免疫 学检测方法的建立奠定基础。 l和方法 1．1材料 1．1．1 试剂 SAL为江苏金坛产品，纯度≥ 99．5％；牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白 (0VA)、1，4丁二醇缩水甘油醚为Pierce产品；弗 氏完全佐剂(FCA)和弗氏不完全佐剂(FIA)为Gib— co产品；其他试剂市售所得，均为AR级。 1．1．2主要仪器 U一3000紫外扫描仪(UV)，日 本岛津公司产品；FTS—E1585一Q冷冻干燥机，美 国STONERIDGG公司生产；Bio—Rad一550型酶 标仪，美国Bio—Rad公司生产；AE260电子天平生 产，德国METTLER公司生产；H19321酸度计，美 国HANNA公司生产。 1．1．3试验动物SPF级6周龄雌性BALB／c小 鼠，购自郑州大学医学院实验动物中心，由河南科技 学院残留物免疫检测研究室动物房饲养。 1．2人工抗原的合成 1．2．1沙丁胺醇半琥珀酸单酯(HS—SAL)的合成 参照文献[9]的方法，称硫酸沙丁胺醇718mg溶 于50mL无水甲醇中，通过真空旋转蒸发器将溶剂 除去，制得黄色油状残留物即沙丁胺醇碱，用 100mL无水甲醇溶解，搅拌情况下加入300mg琥 珀酸酐，室温下搅拌3h，真空旋转蒸发仪蒸干溶 剂，得到黄色结晶油状的沙丁胺醇半琥珀酸单酯。 1．2．21，4一丁二醇缩水甘油醚法连接载体蛋白 称取40mgBSA溶于2mLPBS中，4℃过夜，将 HS—SAL溶于1，4一二氧六环、PBS和三丁胺的混 合物中，再加入氯甲酸异丁酯，室温搅拌30min； 40mgBSA(2mLPBS溶解过夜)逐滴加入到上述 混合物中，停止搅拌，收集反应液，在4℃下对 1000mLPBS(pH7．2)透析，每天换液1次，透析 7d，透析后的反应物反应液进一步用葡聚糖凝胶 SephadexG一25柱纯化，4℃搅拌过夜；反应物在 4℃下PBS液透析5d，每天换透析液2次。透析后 得到纯化的BSA—HS—SAL。同法制得包被抗原 0VA—HS—SAL。冻干～20℃保存备用。 1．3人工抗原的鉴定 1．3．1紫外扫描鉴定 用PBS配制SAI。与BSA 标准溶液，然后称取BSA—HS—SAI。溶于PBS中， 用紫外吸收法测定其蛋白质的浓度和特征峰，调节 BSA—HS—SAL溶液的蛋白质浓度与BSA标准溶 液一致，在波长220～400nm范围内进行紫外扫 描，根据峰的变化判断偶联效果，并计算BSA与 HS—SAL的分子结合比[10。。 1．3．2SDS—PAGE鉴定参照郭尧君[111介绍的 方法配制各种电泳溶液，选择浓缩胶质量浓度为 5％，分离胶为12％，浓缩胶电压为120V，分离胶电 压为60V，考马斯亮蓝染色，根据条带分子量的大 小变化判断偶联效果[1引。 1．3．3多抗血清(pAb)鉴定 1．3．3．1SALpAb制备用BSA—HS—SAL免 疫6周龄雌性BALB／c小鼠5只，免疫剂量为 50,g／只，背部皮下4～6点注射。首免3周后加强 免疫，用无菌PBS溶解BSA—HS—SAL，与等量 FlA混合乳化，共免4次，每次间隔3周，免疫剂量 同首次免疫。每隔2周加强免疫1次，3次免疫后 16d断尾采血分离血清，--20℃保存备用。 1．3．3．2效价测定 采用间接ELISA测定SAL 效价，基本程序参照Tijssen[121的方法。以待测孔 OD。。。值≥NCOD4。。值的2．1倍(P／N≥2．1)，判为 阳性。 1．3．3．3敏感性鉴定采用阻断ELISA鉴定其敏 感性。阻断EI，ISA测定抗血清对SAL的50％抑 制浓度(IC5。)，并以IC。。作为敏感度。 2结果与分析 2．1 UV鉴定结果 BSA的最大吸收峰在278nm，SAL的最大吸 收峰在276nm，BSA与HS—SAI。偶联后，在233～ 304am处紫外吸收峰发生上移(图1)，表明偶联成 功；依据朗伯一比尔定律，推算出HS—SAL与BSA 的分子结合比为11：1。 14．80 14．00 1：1．(J0 12．00 11．00 10．()() 9．00 8．00 7．0() 6．OO 5．00 4．00 3．OO 2．00 1．OO ()．00 波长／rim 图1 liSA、SAlt,和lISA—Ills—SAL的紫外扫描光谱 2．2 SDS—PAGE鉴定结果 图2表明，BSA的泳动速度大于BSA—HS一 · 115· 万方数据 2010年第5期 SAL，说明BSA—HS—SAL的分子量大于BSA，证 明SAL与BSA已成功偶联。 1．蛋白质Marker；2．BSA标准物；3．偶联物BSA—HS—SAL 图2 SAL偶联物的SDS—PAGE鉴定 2．3 pAb鉴定结果 2．3．1 间接ELISA效价测定结果经过4次免疫 后，分别用OVA—HS—SAL包板测定免疫小鼠的 血清效价，结果见表1。由表1可知，5只小鼠血清 抗体效价均在1：6400以上，说明获得了较好的免 疫效果，其中2号小鼠效价最高，达到1：25600。 2．3．2pAb敏感性鉴定结果用OVA—HS— SAL包板，做阻断ELISA，5只小鼠均产生了一定 的抑制。2号小鼠抗血清对SAL的抑制效价见表 2。SAL在0～250ftg／L范围内，将其A伽值转化为 B／B0，再对Lg[-SAL-]进行回归分析，此小鼠的线性 回归方程、R2、IC5。分别为：y一--34．609x+102．56，R2 为0．9689，IGo为33．01弘∥L。 表1 BSA—HS—SAL免疫组小鼠抗SAL血清效价 小鼠编号 抗血清稀释倍数 400 阴性对照 空白对照 2．753 2．175 1．416 1．084 0．620 0．382 0．217 0．076 0．069 3讨论 大多数兽药是小分子物质(分子量小于1ooo)， 本身不具有诱导产生抗体的能力。因此，将小分子 物质与载体蛋白质偶联制备人工抗原成为建立兽药 酶免疫分析方法的关键。常作为兽药人工抗原的载 体蛋白质有BSA、OVA、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人 血清蛋白(HAS)、结核杆菌毒素蛋白(TT)等。同 一半抗原选用不同的载体制备人工抗原得到的抗体 质量也有所不同[1引。BSA物理化学性质稳定、不易 变性、价廉易得，且赖氨酸含量高，自由氨基多，在不 同的pH和离子强度下均有较大的溶解度，在含有 有机溶剂(如吡啶、N，N一二甲基甲酰胺)情况下均 可和半抗原进行偶联，且在偶联后仍保持可溶状态， 是经常使用的载体蛋白质。本试验选用BSA作为 抗原获得了较好的抗体。 在有机小分子半抗原的免疫分析中，合成具有 免疫原性的人工抗原是建立免疫分析方法的关键。 一般在合成人工抗原后先用物理化学方法初步鉴 · 】】6 · 定。鉴定小分子人工抗原常用的方法有UV、lR、 SDS—PAGE、核磁共振碳谱(C13一NMR)、标记抗原 示踪法等。UV和SDS—PAGE是目前鉴定人工抗 原较为适用的方法，但最终还要靠免疫结果来验证。 本研究用UV法和SDS—PAGE鉴定偶联效果，结 果表明，这2种方法均取得了较好的结果。 本研究成功合成了SAL人工抗原，免疫 BALB／c小鼠制备出高效价的pAb，为抗SAL单克 隆抗体(mAb)的进一步研制和免疫学分析方法的 建立奠定了基础。 参考文献： [1]AlejandraH，CarlosF，MarcelaP，eta1．Validationofa chiralHPLCassayfor(R)-salbummolsulfate[J]．Pharrna— ceuticalandBiomedicalAnalysis，2004，34：45—51． [2]KimYS，SaimRD，FedazzoJ，eta1．Effectofrmtemalad— ministrationofsalbutamoltOsowsonpostnatalgrowthand carcasscharacteristicsintheprogencyAustrilian[-J]．Ag一一 cultureResearch。1994，45(7)：271-272． (下转第119页) 9 l 0 9叮够∞∞ O O 0 O 8 7 9 8∞∞凹卯 0 O O O 1 2 1 5毖玛加强 O O 0 O 6 2 1 8∞舛孔弱 O l O O 4 5 4 5"鲳鸱鸺 O 1 O 0 5 4 l 3卯％趴趴 1 1 O l 6 9 2 1卯钉"驼 1 2 1 2 2 3 5 6孙¨舵钉 2 2 1 2 6 7 8 7钉坞弱韶 2 3 2 2 万方数据 河南农业科学 菌株生长的影响，结果见表2。由表2可见，除 40mg／L黄芪多糖对大肠杆菌标准菌株 ATCC25922和临床分离的大肠杆菌LYG没有抑 菌作用外，其余均显示了不同程度的抑菌作用。其 中，对大肠杆菌标准菌株ATCC25922以20mg／L 抑菌效果最好，对临床分离大肠杆菌LYG和沙门 氏菌XM以10mg／L抑菌效果最好，对葡萄球菌标 准菌株ATCC25923以40mg／L抑菌效果最好。 表2黄芪多糖对供试菌株生长的影响 oD6：。值 注：同行数据肩标不同字母表示差异显著(P<0．05)，相同字母表示差异不显著(P<0．05) 3讨论 在提取黄芪多糖的相关研究中，认为碱法提取 比水提法收率高[3]，其中氧化钙提取法比碳酸钠 好[4]，但未见关于氧化钙提取黄芪多糖最佳pH的 报道。本试验通过比较pH值为8、9、10、11条件下 碱法提取黄芪多糖的收率，寻找最佳pH值。根据 陈芳艳等[53和王淑萍等[6]提取黄芪多糖时对温度、 液固比、提取时间、提取次数的研究结果，本试验其 他提取参数分别为：提取温度100℃，液固比6；1， 提取时间1h，提取3次。结果表明，在其他条件均 相同的情况下，pH值为9的氧化钙溶液提取所得 黄芪多糖收率为3．43％，收率最高。 有研究报道[7]，黄芪多糖在体外可显著抑制乳 酸菌和芽孢杆菌的生长。本试验选用4种菌株研究 黄芪多糖的体外抑菌作用，结果表明，黄芪多糖对4 种菌株的生长均有不同程度的抑制作用，再次证明 了黄芪多糖具有抑制细菌生长的作用。 参考文献： 钟凯，杨国宇，王艳玲，等．黄芪多糖对内毒素诱发大 鼠实验性乳腺炎的影响I-J]．河南农业科学。2008(2)： 107-110． 李宏全，段县平，马海利，等．黄芪多糖提高鸡抗氧化作 用对免疫功能的影响I-J]．山西农业大学学报，2002，22 (1)：78—81． 刘瑞生，张述斌，王必慧，等．黄芪多糖的提取和含量测 定研究l-J]．国外畜牧学——猪与禽，2009，29(I)：72- 73． 李红民，黄仁泉，王亚洲．提高黄芪多糖提取收率的工 艺研究[J]．西北大学学报：自然科学版，2000，30(6)： 509-510． 陈芳艳，梁永彬，王林川，等．黄芪多糖提取方法的研究 l-J]．广东畜牧兽医科技，2004，29(5)：37-38． 王淑萍，李晓静，张桂珍．黄芪多糖提取分离纯化工艺 的优化研究YJ]．分子科学学报，2008，24(1)：68—72． 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沙丁胺醇人工抗原合成及鉴定研究[期刊论文]-食品科学2006,27(12) 2. 熊少伶 沙丁胺醇单克隆抗体制备及ELISA检测试剂盒研制[学位论文]2009 3. 邓爱科 亲和层析-酶联免疫吸附法检测β<,2>-兴奋剂的研究[学位论文]2006 4. 胥传来.王武康.贺铁明 食品中残留盐酸克伦特罗免疫原的合成与鉴定[期刊论文]-食品科学2004,25(12) 5. 刘宣兵.张改平.邓瑞广.侯玉泽.王自良.刘庆堂.游雷鸣.柴书军.LIU Xuan-bing.ZHANG Gai-ping.DENG Rui- guang.HOU Yu-ze.WANG Zi-liang.UU Qing-tang.YOU Lei-ming.CHAI Shu-jun 沙丁胺醇人工抗原的合成与鉴定[期 刊论文]-畜牧与兽医2008,40(10) 6. 贺铁明.胥传来.王武康 盐酸克伦特罗免疫原的合成与鉴定[期刊论文]-中国粮油学报2004,19(2) 7. 邱阳生 抗沙丁胺醇单克隆抗体制备、鉴定与初步应用研究[学位论文]2002 8. 李颖 沙丁胺醇单克隆抗体的制备与ELISA检测方法的初步建立[学位论文]2006 9. 王艺熹 沙丁胺醇兔单克隆抗体的制备及ELISA快速检测试剂盒的研制[学位论文]2008 10. 胡颖 沙丁胺醇单克隆抗体的制备及其间接ELISA检测方法的建立[学位论文]2010 本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_hnnykx201005032.aspx