固体 豆渣固体发酵产纳豆激酶的工艺优化及其部分酶学性质研究

第 24卷 � 第 1期 2005年 � 2月 大 � 豆 � 科 � 学 SOYBEAN � SCIENCE Vol. 24 � No. 1 Feb. � 2005 豆渣固体发酵产纳豆激酶的工艺优化 及其部分酶学性质研究* 鲍艳霞1 � 钱之玉2 � 陈 � 钧3 � 倪孟祥2 � 王 � 萍3 ( 1. 中国药科大学高职学院, 镇江 212003; 2. 中国药科大学药学院,南京 210038; 3. 江苏大学生物与环境工程学院,镇江 212013) 摘要 � 研究纳豆菌固体发酵产纳豆激酶的工艺及其部分酶学性质。采用单因素和正交试验,对以 豆渣为原料纳豆菌固体发酵生产纳豆激酶的工艺条件进行优化,并利用最佳发酵工艺制备纳豆激 酶粗品,对纳豆激酶的部分性质进行研究。结果表明固体发酵培养基最佳配比:豆渣:麸皮= 5: 2, 初始含水量 65% ,接种量为 10% ,初始 pH 为 8. 0, 培养温度 30 � 。采用最适培养基和优化工艺, 在 250 ml三角瓶中进行验证实验,纳豆激酶的酶的产率可达到 1577U � . g- 1。酶学性质研究表 明,最适反应温度为 60 � , 37 � 以下稳定, 最适反应 pH 为 8. 0,在 pH7- 9溶液中基本稳定。体外 溶栓作用表明, 纳豆激酶溶解纤维蛋白的方式是直接溶解, 而不是通过激活纤溶酶原。 关键词 � 纳豆菌;固体发酵; 纳豆激酶;酶学性质 中图分类号 � R 931� 6 � � 文献标识码 � A � � 文章编号 � 1000- 9841( 2005) 01- 0043- 05 � � 1987年须见洋行从日本食品纳豆中发现了具 有溶解血栓的一种枯草杆菌蛋白激酶[ 1] (纳豆激 酶) , 该酶在体内除可溶解血栓外,还可明显缩短优 球蛋白的溶解时间, 并具口服吸收溶栓的优点,是一 种非常具有开发潜力的食源性溶栓药物。 目前在纳豆激酶( NK)的研究中生产的有: 固体培养发酵, 液体深层发酵等 [ 2] ,进行固体发酵的 培养基主要是以黄豆为主要原料,加入其它必要的 营养成分而得到的。我国是世界上种植大豆的主要 国家,大豆的产量很高, 豆制品的加工也方兴未艾, 然而在豆制品加工过程中作为副产品的豆渣却没有 得到有效地利用,仅作为饲料或作为废弃物处理, 经 济效益是很低的, 同时也造成了大量环境污染。而 豆渣具有较高的营养,据测定[ 3 ] ,每 100 g 干豆渣中 含水分 2. 96 g、蛋白质 13. 21 g、脂肪 19. 18 g、淀粉 3. 75 g、灰分 2. 76 g、总膳食纤维 59. 87 g、可溶性膳 食纤维 6. 55 g、钙 0. 09 g、磷 0. 01 g。我国谢秋 玲[ 4]、王正刚 [ 5]等相继开展了液体发酵条件的研究。 但对以豆渣为原料进行固体发酵的研究还未见报 道。固体发酵具有成本低、设备简单、产酶活力高、 易推广的优点[ 6] 。作者以豆渣为主要原料进行固体 发酵、发酵条件的优化以及发酵条件对酶合成影响 的研究,结果证实是完全可行的,它为充分利用豆资 源提供了新途径。 1 � 材料与方法 1. 1 � 菌种 纳豆菌 (江苏大学生环学院制药工程系筛选并 保存) 1. 2 � 试剂 凝血酶、纤维蛋白原、标准尿激酶均购自中国生 物制品检定所。豆渣购自市场, 其他试剂为国产分 析纯。 1. 3 � 培养基 斜面培养基( g � mL - 1 ) : 蛋白胨 0. 5%, 牛肉膏 0. 5%, NaCl 0. 5% , 琼脂 2% , pH7. 2- 7. 4。 种子培养基( g � mL - 1 ) : 葡萄糖 1%, 蛋白胨 1% , NaCl 0. 5%, pH7. 2- 7. 4。 固体发酵基础培养基: 250 mL 三角瓶中加 5 g * 收稿日期: 2004- 08- 16 � 作者简介:鲍艳霞( 1968- ) ,女,讲师,主要从事生物化学教学工作。电话: 0511- 4409317 � E- mail: Bao12004@ tom. com Administrator 高亮 Administrator 高亮 Administrator 高亮 干豆渣,并加入一定量的水,以用手抓起成团, 按之 散开为度。121 � 灭菌 20 min待用。 1. 4 � 菌体培养与酶液收集 1. 4. 1 � 菌种活化与种子液制备 将保存菌种转接至斜面培养基, 37 � 培养 14h。 取一环活化菌种, 接入种子培养基, 37 � 、200r � min - 1 摇瓶培养 14h。 1. 4. 2 � 固体发酵条件 取种子培养液接种于固体培养基中, 37 � 培养 96h,间时拍打,使其均匀生长。 1. 4. 3 � 纳豆激酶粗品的制备 固体发酵培养物中按 1 � 15的体积加入 0. 9% 的生理盐水, 4 � 浸提 24h, 5000r � min- 1 离心 10 min, 取上清夜, 先加入硫酸铵使饱和度至 35% , 离 心除去杂蛋白, 再加入硫酸铵使饱和度至 75% , 搅 拌溶解后冷处静置过夜,离心收集沉淀, 超滤除盐, 得纳豆激酶粗品。 1. 5 � 纳豆激酶活性测定 1. 5. 1 � 纤维蛋白平板法 [ 7] 1. 5. 2 � Folin- 酚测蛋白酶活力[ 8] 标准曲线的绘制 配制不同浓度的酪氨酸标准 溶液, 采用 Fo lin - 酚法测其 OD680nm 值, 分别以 OD 680nm值和酪氨酸浓度为纵坐标和横坐标, 做标准 曲线。 酪蛋白的酶解 精确称取 4g 酪蛋白, 用少量氢 氧化钠溶解后, 用 pH7. 8的磷酸缓冲液配制成一定 浓度的蛋白溶液, 加入一定量的酶液, 40 � 水浴加 热 10分钟, 加入 2ml10%的三氯乙酸终止反应, 离 心分离,取滤液 1m l按 Folin- 酚法测其 OD680值, 作为测定纳豆激酶催化酪蛋白水解的最适 pH 和温 度的酶促反应速度。 2 � 结果 2. 1 � 标准曲线 尿激酶标准曲线进行线性回归得方程: y = 0. 344x- 0. 3139 � r= 0. 9985 酪氨酸标准曲线进行线性回归得方程: y = 7. 2854x- 0. 0018 � r= 0. 9995 2. 2 � 固体发酵条件的研究 2. 2. 1豆渣与麸皮的含量比对产酶的影响 以豆渣为发酵基质, 同时作为氮源,加入不同比 例的麸皮作为碳源, 37 � 培养 96 h,用纤维蛋白平 板法测定纳豆激酶的酶活, 以固体基础培养基产酶 的相对酶活为 100%作为考察指标, 比较豆渣与麸 皮的不同比例对产酶的影响。试验结果见表 1。 表 1 � 豆渣与麸皮的含量比对产酶的影响 T able 1� Effects of different soybean residue/ wh eat bran on natt okinase activity 豆渣:麸皮 Soybean residue � w heat b ran 5� 0 5� 2 5� 5 2� 5 0� 5 相对酶活 Relat ive act ivity/ % 100. 0 133. 7 112. 1 97. 2 90. 5 � � 结果表明, 添加麸皮有利于微生物产酶。因为 麸皮除含有淀粉质等碳水化合物以外, 还含有多种 维生素和金属离子, 如 B 族维生素和生物素以及 镁、磷、铁、钙等金属离子,它们是微生物必需的生长 因子。同时麸皮使培养基松散, 从而改善通风状态, 有利于微生物产酶。豆渣�麸皮= 5 �2 时, 产酶最 高。 2. 2. 2 � 培养基含水量的影响 以豆渣干基为基准,加入一定量的水使其含水 量分别达到 50%、60%、70%、80%、90% ,比较不同 含水量对产酶的影响。 表 2� 培养基含水量的影响 Table 2 � Effects of mo isture content on natt okinase activity 相对湿度( % ) Moistur e content 50 60 70 80 90 相对酶活( % ) Relat ive act ivity 62. 3 83. 3 100. 0 92. 7 85. 4 � � 表 2的结果表明, 最适含水量为 70%。固体发 酵中,培养基含水量直接关系到氧气的供应和微生 物的生长状态, 从而影响产酶量。固体发酵含水量 过低,影响营养基质的溶解和传递以及颗粒的润胀 等条件,不利于细胞生长。含水量过高影响透气性, 使基质成团,影响氧的传递和发酵热的散失,导致酶 活力下降。 2. 2. 3 � 接种量对产酶的影响 以种龄 14h的液体种子进行接种量试验,结果 见表 3。 表 3� 接种量对产酶的影响 Table 3 � Effects o f the inoculum on nattokinase activ ity 接种量( % ) Inoculum 6 8 10 12 14 相对酶活( % ) Relat ive act ivity 91. 3 100. 0 118. 5 82. 2 77. 6 � � 该试验表明采取 10%的接种量较为合适,接种 量过低会使生长缓慢、发酵周期延长; 过高的接种 量,会造成培养基含水量不均匀、温度上升过快, 不 44 � � � � � � � � � � � � � � � 大 � 豆 � 科 � 学 � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � 1期 Administrator 高亮 Administrator 高亮 Administrator 高亮 Administrator 高亮 易控制。 2. 2. 4 � 培养基 pH 值对产酶的影响 用 HCl和 NaOH 调节水的 pH , 再用来调节培 养基的湿度。取不同初始 pH 的发酵培养基进行固 体发酵,结果见表 4。 表 4� 培养基 pH 值对产酶的影响 T able 4� Effects of pH medium on natt okinase activity pH 4. 0 5. 0 6. 0 7. 0 8. 0 9. 0 10. 0 11. 0 相对酶活( %) Relat ive act ivity 0 71. 9 85. 3 100. 0 102. 1 74. 6 69. 7 54. 4 � � 结果显示: pH 值为 8. 0左右时产酶最高, pH 值 过低或过高则酶活下降。 2. 2. 5 � 培养温度对产酶的影响 将基本培养基置于不同温度下培养, 结果见表 5。 表 5� 培养温度对产酶的影响 Table 5� Effects of temperatur e on nattokinase activ ity 温度( � ) Temperatur e 20 25 30 37 45 相对酶活( % ) relat ive activity 62. 8 65. 5 110. 2 100. 0 85. 9 � � 该试验表明纳豆菌在 30 � 左右产酶最高。 2. 2. 6 � 培养基组成正交试验 根据单因素的试验结果, 选择豆渣 �麸皮、含水 量、pH、温度在 250mL 三角瓶中进行 L9( 3 4 )的正交 试验[ 9] 。 比较极差 R,含水量、pH 对发酵效果影响较为 显著。其最佳配方组成为豆渣 �麸皮= 5� 2,含水 量 65% ,培养基的初始 pH 值为 8. 0, 温度为 30 � , 在此条件下发酵水平的酶的产率可达到 1577 U � g - 1。 2. 3 � 纳豆激酶的酶学性质 2. 3. 1 � 纳豆激酶最适 pH 和温度 用浓度为 0. 1mo l/ L 的不同 pH 值缓冲液( pH5 - 11)稀释粗酶液,再分别与相应 pH 值缓冲液配制 的 1%酪蛋白底物混合, 40 � 下反应 10min, 用 Folin 法测定蛋白酶活力, 结果见图 1。.酶作用的最适 pH 值为 8, 在 pH6- 9的范围内均具有较高活力。 � � 将粗酶液用 pH7. 4的磷酸缓冲液适当稀释后, 图 1 � 纳豆激酶的最适 pH F ig� 1 � Optimal pH of NK 图 2� 纳豆激酶的最适温度 Fig� 2 � Optimal temperature o f NK 在不同温度下反应 10m in, 测定蛋白酶活力结果见 图 2。酶的最适反应温度为 60 � , 在 40 � - 60 � 之 间均具有较高的活力,高于 70 � ,酶活力迅速下降。 2. 3. 2 � 酶的稳定性 热稳定性将粗酶液用 pH7. 4 的磷酸缓冲液适 当稀释后, 在不同温度 ( 20 � , 30 � , 37 � , 45 � , 50 � , 55 � , 60 � , 65 � )下各保温 2h 后测其酶活。 从图 3 可以看出, 37 � 以下保温 2h对酶活不影响, 37 � 以上保温 2h 酶活下降。超过 60 � 保温 2h, 酶 活力完全丧失, 说明酶对高温较为敏感, 但在 37 � 以下贮存稳定, 24h后残余酶活力仍在 95%以上。 pH 值对酶稳定性的影响 纳豆激酶经 35% - 65% 饱和度硫酸铵盐析后, 取等量盐析液经 8000rpm 离心 30min, 获得等量的沉淀物, 分别以 pH 为 2. 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11的缓冲液溶解并 于 37 � 作用 60m in、4 � 放置 24h、室温 24h 后测定 溶液的酶活,结果见图 4。由图可知, 该酶在 pH7- 9较稳定。 2. 4 � 纳豆激酶溶解纤维蛋白的作用方式 由于使用的纤维蛋白原等试剂中含有少量的纤 451期 鲍艳等霞:豆渣固体发酵产纳豆激酶的工艺优化及其部分酶学性质研究 溶酶原,因此无法判断纳豆激酶的活性是激活还是 直接溶解性质,将纤维蛋白平板经 85 � 加热 30min 图 3 � 温度对纳豆激酶稳定性的影响 Fig� 3 � Effect of temperature on the stability o f NK 图 4 � pH 对纳豆激酶稳定性的影响 F ig� 4 � Effect o f pH on the st abilit y of NK 制成加热平板[ 10] , 则其中的纤溶酶原因加热失活。 尿激酶在加热纤维蛋白平板上不形成溶解圈, 而它 与纤溶酶原的混合液则表现出溶纤活性, 说明尿激 酶的溶纤作用是通过激活纤溶酶原。纳豆激酶则无 论在纤维蛋白平板还是在加热平板上都形成溶解 圈,且它与纤溶酶原混合后纤溶活性变化不大,说明 纳豆激酶主要是直接降解纤维蛋白,因而是一种溶 纤酶,而不是纤溶酶原激活剂。 3 � 结论 实验结果表明以豆渣为原料, 纳豆菌固体发酵 的最佳条件为: 豆渣 �麸皮= 5 �2,含水量 65%, 培 养基的初始 pH 值为 8. 0,温度为 30 � ,在此条件下 发酵水平的酶活可达到 1577 U � g - 1。酶的最适反 应温度为 60 � , 37 � 以下稳定, 最适反应 pH 为 8. 0, 在 pH7- 9溶液中基本稳定。体外溶栓作用表 明,纳豆激酶溶解纤维蛋白的方式是直接溶解,而不 是通过激活纤溶酶原。 参 � 考 � 文 � 献 1 � Chang C T , Fan M H , Kuo F C. Potent fibrinolyt ic en zyme f rom a mu tant of Bacillus IMR - NK [ J ] . J ou rnal Agricultur e Food Chemist ry, 2000, 48( 8) : 3210. 2 � 李道棠.固态发酵[ J] .生命科学. 1992( 4) : 15- 17� 3 � 蔺新英.豆渣纤维粉营养组成及对高血脂、糖尿病干预作用的实 验研究[ D] .山东师范大学, 2002� 4 � 谢秋玲,郭勇.纳豆激酶液体发酵条件的优化[ J] .华南理工大学 学报(自然科学版) , 1999, 27( 5) : 127- 131. 5 � 王正刚,丁贵平,蔡正森. 纳豆激酶的发酵工艺研究 [ J ] .氨基酸 和生物资源, 2001, 23( 2) : 17- 21� 6 � 段金柱,曹淡君.固体发酵与液体发酵产纤维素酶产率与催化性 能的比较[ J] .粮食与饲料工业, 2003, 3: 24- 26. 7 � 王敏,王俊,邵明远.链霉菌产生的新型纤溶酶的纤溶性质和溶栓 作用[ J] .药学学报, 1998, 7: 28. 8 � 张龙翔. 生化实验方法和技术 [ M ]� 北京: 人民教育出版社, 1981. 9 � 周润兰,喻胜华.应用概率统计 [ M ] . 北京: 科学出版社, 1999, 182- 192. 10 金莉蓉,徐桂芝.脑梗死的凝血纤溶状态和蚓激酶的作用[ J] . 中 国新药与临床杂志, 1999 , 18( 1) : 48- 50. STUDY ON THE TECHNOLOGIES AND SOME ENXYME PROPERTY OF NATTO- KINASE PRODUCED FRCM THE SOLID FERMENTATION OF SOYBEAN RESIDUE Bao Yanxia1 � Qian Zhiyu2 � Chen Jun3 � Ni Mengx iang2 � Wang Ping3 (1. A ut itude Vocational S chool of China Pharmaceut ical Univer si ty , J iangsu Zhenj iang 212003; 2. S chool of P harmacy of China Pharmaceut ical Universi ty , J iangsu N anj ing 210038; 3�Biological and Envi ronment E ngineer ing S chool of J iangsu Univer sity , Zhenj iang, 212013) Abstract � Study on the technolog ies and some enzyme pr operty of Natto- kinase produced from the so lid fermentat ion of soybean residue w as conducted� With sing le- facto r and o rthogonal test� The r esults 46 � � � � � � � � � � � � � � � 大 � 豆 � 科 � 学 � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � 1期 show ed that the opt imal medium of so lid fermentation w as as fo llow s soybean w as r esidue: w heat bran w as 5�2; init ial mo istur e content w as 65% ; the inoculum size w as 10%; init ial pH 8. 0, and temperature w as 30 � . Natto- kinase act iv ity w as 1577 U � g- 1 when the st rain w as grow n on the opt imal medium under the above culture condit ions in 250 mL Er lenmeyer f iask. The optimum temperature and pH for hydro lysis of casein w ere 60 � and 8. 0 respectively. The enzyme w as stable up to 37 � , w ithin the pH r ange o f 7- 9. The f ibrinolysis act ivity w as perfo rmed by deg rading the f ibrous pro tein direct ly according to the exper-i ment in vit ro. Key words � Natto st rain; Solid fermentat ion; Nat to- kinase; Proper ties � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � 欢迎订阅 2005年《大豆科学》 《大豆科学》是由黑龙江省农业科学院主办的学术性期刊。国内外公开发行,季刊, 16 开 本,每期 12万字左右。国内每期订价: 7� 00元, 全年 28� 00元, 邮发代号: 14- 95。国外每期 订价: 10� 00美元(包括邮资 ) ,全年 40美元。国外总发行由中国国际图贸易总公司, 北京 399信箱。国外代号: Q5587。 《大豆科学》是中国自然科学核心期刊,中国科学引文数据库来源期刊。主要刊登有关大 豆遗传育种,品种资源,生理生态,耕作栽培、病、虫、杂草防治,营养施肥,生物技术及食品加工 等方面的科研,学术论文,国内外研究进展评述,研究简报,学术活动简讯、新品种介绍等。 《大豆科学》主要面向从事大豆科学研究的科技工作者, 农业院校师生、国营农场、各级农 业技术推广部门的技术人员和民营企业科技人员。 本刊热忱欢迎广大科研单位及有关企业在我刊刊登广告, 广告经营许可证号: 2301004010071。 订阅办法:全国各地邮局,如在邮局漏订, 可到编辑部补订。通过邮局汇款至哈尔滨市学 府路 368号《大豆科学》编辑部。邮政编码: 150086,联系电话: ( 0451) 86668735。 网址: ht tp: / / ddkx. chinajournal. net. cn � E. mail: dadoukx@ sina. com 471期 鲍艳等霞:豆渣固体发酵产纳豆激酶的工艺优化及其部分酶学性质研究