第 24卷 � 第 1期
2005年 � 2月
大 � 豆 � 科 � 学
SOYBEAN � SCIENCE
Vol. 24 � No. 1
Feb. � 2005
豆渣固体发酵产纳豆激酶的工艺优化
及其部分酶学性质研究*
鲍艳霞1 � 钱之玉2 � 陈 � 钧3 � 倪孟祥2 � 王 � 萍3
( 1. 中国药科大学高职学院, 镇江 212003; 2. 中国药科大学药学院,南京 210038;
3. 江苏大学生物与环境工程学院,镇江 212013)
摘要 � 研究纳豆菌固体发酵产纳豆激酶的工艺及其部分酶学性质。采用单因素和正交试验,对以
豆渣为原料纳豆菌固体发酵生产纳豆激酶的工艺条件进行优化,并利用最佳发酵工艺制备纳豆激
酶粗品,对纳豆激酶的部分性质进行研究。结果表明固体发酵培养基最佳配比:豆渣:麸皮= 5: 2,
初始含水量 65% ,接种量为 10% ,初始 pH 为 8. 0, 培养温度 30 � 。采用最适培养基和优化工艺,
在 250 ml三角瓶中进行验证实验,纳豆激酶的酶的产率可达到 1577U � . g- 1。酶学性质研究表
明,最适反应温度为 60 � , 37 � 以下稳定, 最适反应 pH 为 8. 0,在 pH7- 9溶液中基本稳定。体外
溶栓作用表明, 纳豆激酶溶解纤维蛋白的方式是直接溶解, 而不是通过激活纤溶酶原。
关键词 � 纳豆菌;固体发酵; 纳豆激酶;酶学性质
中图分类号 � R 931� 6 � � 文献标识码 � A � � 文章编号 � 1000- 9841( 2005) 01- 0043- 05
� � 1987年须见洋行从日本食品纳豆中发现了具
有溶解血栓的一种枯草杆菌蛋白激酶[ 1] (纳豆激
酶) , 该酶在体内除可溶解血栓外,还可明显缩短优
球蛋白的溶解时间, 并具口服吸收溶栓的优点,是一
种非常具有开发潜力的食源性溶栓药物。
目前在纳豆激酶( NK)的研究中生产的
有:
固体培养发酵, 液体深层发酵等 [ 2] ,进行固体发酵的
培养基主要是以黄豆为主要原料,加入其它必要的
营养成分而得到的。我国是世界上种植大豆的主要
国家,大豆的产量很高, 豆制品的加工也方兴未艾,
然而在豆制品加工过程中作为副产品的豆渣却没有
得到有效地利用,仅作为饲料或作为废弃物处理, 经
济效益是很低的, 同时也造成了大量环境污染。而
豆渣具有较高的营养,据测定[ 3 ] ,每 100 g 干豆渣中
含水分 2. 96 g、蛋白质 13. 21 g、脂肪 19. 18 g、淀粉
3. 75 g、灰分 2. 76 g、总膳食纤维 59. 87 g、可溶性膳
食纤维 6. 55 g、钙 0. 09 g、磷 0. 01 g。我国谢秋
玲[ 4]、王正刚 [ 5]等相继开展了液体发酵条件的研究。
但对以豆渣为原料进行固体发酵的研究还未见报
道。固体发酵具有成本低、设备简单、产酶活力高、
易推广的优点[ 6] 。作者以豆渣为主要原料进行固体
发酵、发酵条件的优化以及发酵条件对酶合成影响
的研究,结果证实是完全可行的,它为充分利用豆资
源提供了新途径。
1 � 材料与方法
1. 1 � 菌种
纳豆菌 (江苏大学生环学院制药工程系筛选并
保存)
1. 2 � 试剂
凝血酶、纤维蛋白原、标准尿激酶均购自中国生
物制品检定所。豆渣购自市场, 其他试剂为国产分
析纯。
1. 3 � 培养基
斜面培养基( g � mL - 1 ) : 蛋白胨 0. 5%, 牛肉膏
0. 5%, NaCl 0. 5% , 琼脂 2% , pH7. 2- 7. 4。
种子培养基( g � mL - 1 ) : 葡萄糖 1%, 蛋白胨
1% , NaCl 0. 5%, pH7. 2- 7. 4。
固体发酵基础培养基: 250 mL 三角瓶中加 5 g
* 收稿日期: 2004- 08- 16
� 作者简介:鲍艳霞( 1968- ) ,女,讲师,主要从事生物化学教学工作。电话: 0511- 4409317 � E- mail: Bao12004@ tom. com
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干豆渣,并加入一定量的水,以用手抓起成团, 按之
散开为度。121 � 灭菌 20 min待用。
1. 4 � 菌体培养与酶液收集
1. 4. 1 � 菌种活化与种子液制备
将保存菌种转接至斜面培养基, 37 � 培养 14h。
取一环活化菌种, 接入种子培养基, 37 � 、200r �
min
- 1 摇瓶培养 14h。
1. 4. 2 � 固体发酵条件
取种子培养液接种于固体培养基中, 37 � 培养
96h,间时拍打,使其均匀生长。
1. 4. 3 � 纳豆激酶粗品的制备
固体发酵培养物中按 1 � 15的体积加入 0. 9%
的生理盐水, 4 � 浸提 24h, 5000r � min- 1 离心 10
min, 取上清夜, 先加入硫酸铵使饱和度至 35% , 离
心除去杂蛋白, 再加入硫酸铵使饱和度至 75% , 搅
拌溶解后冷处静置过夜,离心收集沉淀, 超滤除盐,
得纳豆激酶粗品。
1. 5 � 纳豆激酶活性测定
1. 5. 1 � 纤维蛋白平板法 [ 7]
1. 5. 2 � Folin- 酚测蛋白酶活力[ 8]
标准曲线的绘制 配制不同浓度的酪氨酸标准
溶液, 采用 Fo lin - 酚法测其 OD680nm 值, 分别以
OD 680nm值和酪氨酸浓度为纵坐标和横坐标, 做标准
曲线。
酪蛋白的酶解 精确称取 4g 酪蛋白, 用少量氢
氧化钠溶解后, 用 pH7. 8的磷酸缓冲液配制成一定
浓度的蛋白溶液, 加入一定量的酶液, 40 � 水浴加
热 10分钟, 加入 2ml10%的三氯乙酸终止反应, 离
心分离,取滤液 1m l按 Folin- 酚法测其 OD680值,
作为测定纳豆激酶催化酪蛋白水解的最适 pH 和温
度的酶促反应速度。
2 � 结果
2. 1 � 标准曲线
尿激酶标准曲线进行线性回归得方程: y =
0. 344x- 0. 3139 � r= 0. 9985
酪氨酸标准曲线进行线性回归得方程: y =
7. 2854x- 0. 0018 � r= 0. 9995
2. 2 � 固体发酵条件的研究
2. 2. 1豆渣与麸皮的含量比对产酶的影响
以豆渣为发酵基质, 同时作为氮源,加入不同比
例的麸皮作为碳源, 37 � 培养 96 h,用纤维蛋白平
板法测定纳豆激酶的酶活, 以固体基础培养基产酶
的相对酶活为 100%作为考察指标, 比较豆渣与麸
皮的不同比例对产酶的影响。试验结果见表 1。
表 1 � 豆渣与麸皮的含量比对产酶的影响
T able 1� Effects of different soybean residue/ wh eat
bran on natt okinase activity
豆渣:麸皮
Soybean residue � w heat b ran 5� 0 5� 2 5� 5 2� 5 0� 5
相对酶活
Relat ive act ivity/ %
100. 0 133. 7 112. 1 97. 2 90. 5
� � 结果表明, 添加麸皮有利于微生物产酶。因为
麸皮除含有淀粉质等碳水化合物以外, 还含有多种
维生素和金属离子, 如 B 族维生素和生物素以及
镁、磷、铁、钙等金属离子,它们是微生物必需的生长
因子。同时麸皮使培养基松散, 从而改善通风状态,
有利于微生物产酶。豆渣�麸皮= 5 �2 时, 产酶最
高。
2. 2. 2 � 培养基含水量的影响
以豆渣干基为基准,加入一定量的水使其含水
量分别达到 50%、60%、70%、80%、90% ,比较不同
含水量对产酶的影响。
表 2� 培养基含水量的影响
Table 2 � Effects of mo isture content on natt okinase activity
相对湿度( % )
Moistur e content
50 60 70 80 90
相对酶活( % )
Relat ive act ivity
62. 3 83. 3 100. 0 92. 7 85. 4
� � 表 2的结果表明, 最适含水量为 70%。固体发
酵中,培养基含水量直接关系到氧气的供应和微生
物的生长状态, 从而影响产酶量。固体发酵含水量
过低,影响营养基质的溶解和传递以及颗粒的润胀
等条件,不利于细胞生长。含水量过高影响透气性,
使基质成团,影响氧的传递和发酵热的散失,导致酶
活力下降。
2. 2. 3 � 接种量对产酶的影响
以种龄 14h的液体种子进行接种量试验,结果
见表 3。
表 3� 接种量对产酶的影响
Table 3 � Effects o f the inoculum on nattokinase activ ity
接种量( % )
Inoculum
6 8 10 12 14
相对酶活( % )
Relat ive act ivity
91. 3 100. 0 118. 5 82. 2 77. 6
� � 该试验表明采取 10%的接种量较为合适,接种
量过低会使生长缓慢、发酵周期延长; 过高的接种
量,会造成培养基含水量不均匀、温度上升过快, 不
44 � � � � � � � � � � � � � � � 大 � 豆 � 科 � 学 � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � 1期
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易控制。
2. 2. 4 � 培养基 pH 值对产酶的影响
用 HCl和 NaOH 调节水的 pH , 再用来调节培
养基的湿度。取不同初始 pH 的发酵培养基进行固
体发酵,结果见表 4。
表 4� 培养基 pH 值对产酶的影响
T able 4� Effects of pH medium on natt okinase activity
pH 4. 0 5. 0 6. 0 7. 0 8. 0 9. 0 10. 0 11. 0
相对酶活( %)
Relat ive act ivity
0 71. 9 85. 3 100. 0 102. 1 74. 6 69. 7 54. 4
� � 结果显示: pH 值为 8. 0左右时产酶最高, pH 值
过低或过高则酶活下降。
2. 2. 5 � 培养温度对产酶的影响
将基本培养基置于不同温度下培养, 结果见表
5。
表 5� 培养温度对产酶的影响
Table 5� Effects of temperatur e on nattokinase activ ity
温度( � )
Temperatur e
20 25 30 37 45
相对酶活( % )
relat ive activity
62. 8 65. 5 110. 2 100. 0 85. 9
� � 该试验表明纳豆菌在 30 � 左右产酶最高。
2. 2. 6 � 培养基组成正交试验
根据单因素的试验结果, 选择豆渣 �麸皮、含水
量、pH、温度在 250mL 三角瓶中进行 L9( 3 4 )的正交
试验[ 9] 。
比较极差 R,含水量、pH 对发酵效果影响较为
显著。其最佳配方组成为豆渣 �麸皮= 5� 2,含水
量 65% ,培养基的初始 pH 值为 8. 0, 温度为 30 � ,
在此条件下发酵水平的酶的产率可达到 1577 U �
g
- 1。
2. 3 � 纳豆激酶的酶学性质
2. 3. 1 � 纳豆激酶最适 pH 和温度
用浓度为 0. 1mo l/ L 的不同 pH 值缓冲液( pH5
- 11)稀释粗酶液,再分别与相应 pH 值缓冲液配制
的 1%酪蛋白底物混合, 40 � 下反应 10min, 用 Folin
法测定蛋白酶活力, 结果见图 1。.酶作用的最适 pH
值为 8, 在 pH6- 9的范围内均具有较高活力。
� � 将粗酶液用 pH7. 4的磷酸缓冲液适当稀释后,
图 1 � 纳豆激酶的最适 pH
F ig� 1 � Optimal pH of NK
图 2� 纳豆激酶的最适温度
Fig� 2 � Optimal temperature o f NK
在不同温度下反应 10m in, 测定蛋白酶活力结果见
图 2。酶的最适反应温度为 60 � , 在 40 � - 60 � 之
间均具有较高的活力,高于 70 � ,酶活力迅速下降。
2. 3. 2 � 酶的稳定性
热稳定性将粗酶液用 pH7. 4 的磷酸缓冲液适
当稀释后, 在不同温度 ( 20 � , 30 � , 37 � , 45 � ,
50 � , 55 � , 60 � , 65 � )下各保温 2h 后测其酶活。
从图 3 可以看出, 37 � 以下保温 2h对酶活不影响,
37 � 以上保温 2h 酶活下降。超过 60 � 保温 2h, 酶
活力完全丧失, 说明酶对高温较为敏感, 但在 37 �
以下贮存稳定, 24h后残余酶活力仍在 95%以上。
pH 值对酶稳定性的影响 纳豆激酶经 35% -
65% 饱和度硫酸铵盐析后, 取等量盐析液经
8000rpm 离心 30min, 获得等量的沉淀物, 分别以
pH 为 2. 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11的缓冲液溶解并
于 37 � 作用 60m in、4 � 放置 24h、室温 24h 后测定
溶液的酶活,结果见图 4。由图可知, 该酶在 pH7-
9较稳定。
2. 4 � 纳豆激酶溶解纤维蛋白的作用方式
由于使用的纤维蛋白原等试剂中含有少量的纤
451期 鲍艳等霞:豆渣固体发酵产纳豆激酶的工艺优化及其部分酶学性质研究
溶酶原,因此无法判断纳豆激酶的活性是激活还是 直接溶解性质,将纤维蛋白平板经 85 � 加热 30min
图 3 � 温度对纳豆激酶稳定性的影响
Fig� 3 � Effect of temperature on the stability o f NK
图 4 � pH 对纳豆激酶稳定性的影响
F ig� 4 � Effect o f pH on the st abilit y of NK
制成加热平板[ 10] , 则其中的纤溶酶原因加热失活。
尿激酶在加热纤维蛋白平板上不形成溶解圈, 而它
与纤溶酶原的混合液则表现出溶纤活性, 说明尿激
酶的溶纤作用是通过激活纤溶酶原。纳豆激酶则无
论在纤维蛋白平板还是在加热平板上都形成溶解
圈,且它与纤溶酶原混合后纤溶活性变化不大,说明
纳豆激酶主要是直接降解纤维蛋白,因而是一种溶
纤酶,而不是纤溶酶原激活剂。
3 � 结论
实验结果表明以豆渣为原料, 纳豆菌固体发酵
的最佳条件为: 豆渣 �麸皮= 5 �2,含水量 65%, 培
养基的初始 pH 值为 8. 0,温度为 30 � ,在此条件下
发酵水平的酶活可达到 1577 U � g - 1。酶的最适反
应温度为 60 � , 37 � 以下稳定, 最适反应 pH 为
8. 0, 在 pH7- 9溶液中基本稳定。体外溶栓作用表
明,纳豆激酶溶解纤维蛋白的方式是直接溶解,而不
是通过激活纤溶酶原。
参 � 考 � 文 � 献
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STUDY ON THE TECHNOLOGIES AND SOME ENXYME PROPERTY OF
NATTO- KINASE PRODUCED FRCM THE SOLID FERMENTATION OF SOYBEAN RESIDUE
Bao Yanxia1 � Qian Zhiyu2 � Chen Jun3 � Ni Mengx iang2 � Wang Ping3
(1. A ut itude Vocational S chool of China Pharmaceut ical Univer si ty , J iangsu Zhenj iang 212003;
2. S chool of P harmacy of China Pharmaceut ical Universi ty , J iangsu N anj ing 210038;
3�Biological and Envi ronment E ngineer ing S chool of J iangsu Univer sity , Zhenj iang, 212013)
Abstract � Study on the technolog ies and some enzyme pr operty of Natto- kinase produced from the so lid
fermentat ion of soybean residue w as conducted� With sing le- facto r and o rthogonal test� The r esults
46 � � � � � � � � � � � � � � � 大 � 豆 � 科 � 学 � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � 1期
show ed that the opt imal medium of so lid fermentation w as as fo llow s soybean w as r esidue: w heat bran w as
5�2; init ial mo istur e content w as 65% ; the inoculum size w as 10%; init ial pH 8. 0, and temperature w as
30 � . Natto- kinase act iv ity w as 1577 U � g- 1 when the st rain w as grow n on the opt imal medium under
the above culture condit ions in 250 mL Er lenmeyer f iask. The optimum temperature and pH for hydro lysis
of casein w ere 60 � and 8. 0 respectively. The enzyme w as stable up to 37 � , w ithin the pH r ange o f 7- 9.
The f ibrinolysis act ivity w as perfo rmed by deg rading the f ibrous pro tein direct ly according to the exper-i
ment in vit ro.
Key words � Natto st rain; Solid fermentat ion; Nat to- kinase; Proper ties
� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
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