纳豆激酶固态发酵的参数优化

2011 年 21( 1) 生 物 技 术 3 讨论 事实上，核糖醇和木糖醇是同分异构体，它们都是在磷酸 戊糖途径中合成的。文献报道酵母菌 ( Saccharomyces cerevisi- ae) 可以同时生产木糖醇、核糖醇等［11］，同时也从基因工程的 角度探讨提高磷酸戊糖途径的碳硫对核糖醇生产的影响［8］。 但是目前尚未见对发酵制备核糖醇的培养基系统优化的研 究。本文系统考察了 Trichosporonoides oedocephalisATCC 16958 发酵生产核糖醇摇瓶发酵培养条件，结果明，酵母膏是最理 想的氮源，可能是由于酵母膏中含有更多的生长因子，在微生 物发酵制备木糖醇时也发现采用酵母膏作氮源的效果较 好［10］。此外，本文针对 Trichosporonoides oedocephalis ATCC 16958 发酵制备核糖醇，选取了 NaCl、KH2PO4 和 MgSO4 等三 种盐进行了优化试验，在添加 0． 5g /L 上述的三种盐时，发酵 产生的核糖醇量较高，其可能的促进机制和文献报道发酵制 备木糖醇的一致［12，13］。而在发酵 24h添加 0． 2%的柠檬酸，可 以提高核糖醇的产量，其中根本原因是柠檬酸和葡萄糖的联 合代谢可以促进 Ca2 + 的吸收，对丙酮酸激酶的活性产生抑 制［14］，从而有利于磷酸戊糖途径产物核糖醇产量的增加。最 后，将摇瓶培养实验结果在发酵罐中进一步验证，发酵 120h 核糖醇产量为 38． 66g /L。但是从发酵过程曲线可以看出，在 发酵 36h前消耗了大量的葡萄糖，而此时核糖醇的浓度较低， 发酵 36h以后核糖醇的产量一直增加，显然，在进一步的工业 发酵过程中应该通过补料和流加控制的策略来控制培养基中 糖的浓度，在微生物发酵制备木糖醇、赤藓糖醇中均有补料控 制糖浓度的研究报道［15］。本文的研究为今后的进一步采取流 加控制策略来提高核糖醇的生产奠定了基础。 参考文献: ［1］Woodyer Ryan D．，Wymer Nathan J．，Racine F． Michael，et al． Effi- cient production of L － ribose with a recombinant Escherichia coli biocatalyst ［J］． Appl Environ Microbiol，2008，74 ( 10) : 2967 － 2975． ［2］Christ Trevor N．，Deweese Kara A．，Woodyer Ryan D． Directed evo- lution toward improved production of L － ribose from ribitol ［J］． Comb Chem High Throughput Screen，2010，13 ( 4) : 302 － 308． ［3］De Muynck Cassandra，Pereira Catarina，Soetaert Wim，et al． Dehy- drogenation of ribitol with Gluconobacter oxydans: production and stability of L － ribulose［J］． J Biotechnol，2006，125 ( 3) : 408 － 415． ［4］刘琨，谢蓝． 新型核苷类抗病毒药物的研究进展［J］． 药学学报， 2006，41( 8) : 689 － 693． ［5］李良智，芮新生，万屹东，等． 微生物及其酶法生产稀有 L － 戊糖 ［J］．化工进展，2007，26( 5) : 750 － 753． ［6］Kazuya Okano． Synthesis and pharmaceutical application of l － ribose ［J］． Tetrahedron，2009，65 ( 10) : 1937 － 1949． ［7］Kawaguchi Tomoko，Ueda Makoto． Medium for produing ribitol and prdoduction of ribitol［P］． Patent JP11215981( A) ，1999 － 08 － 10． ［8］Mervi H． Toivari，Hannu Maaheimo，Merja Penttil，et al． Enhancing the flux of D － glucose to the pentose phosphate pathway in Saccharomyces cerevisiae for the production of D － ribose and ribitol［J］． Appl Microbiol Biotechnol，2010，85 ( 3) : 731 － 739． ［9］陈双喜，黄明志，储炬，等． 柠檬酸钠对肌苷发酵过程代谢流分布 的调节［J］． 化工学报，2005，56( 9) : 1731 － 1737． ［10］邓立红，王艳辉，张扬，等． 热带假丝酵母发酵生产木糖醇的研究 ［J］．食品与发酵工业，2004，( 9) : 37 － 40． ［11］Toivari Mervi H．，Ruohonen Laura，Miasnikov Andrei N，et al． Met- abolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for conversion of D － glucose to xylitol and other five － carbon sugars and sugar alcohols［J］． Appl Envi- ron Microbiol，2007，73: 5471 － 5476． ［12］Azuma M．，Ikeuchi T．，Kiritani R．，et al． Increase in xylitol produc- tion by Candida tropicalis upon addition of salt［J］． Biomass and Bioener- gy，2000，19( 2) : 129 － 135． ［13］Tavares Joo M．，Duarte Luís C．，Amaral － Collao M． T．，et al． Phosphate limitation stress induces xylitol overproduction by Debaryomyces hansenii［J］． FEMS Microbiology Letters，1991，171: 15 － 120． ［14］Goel Akshay，Lee Jinwoon，Domach Michael M．，et al． Metabolic fluxes，pool and enzyme measurements suggest a tighter coupling of energet- ics and biosynthetic reactions associated with reduced pyruvate kinase flux ［J］． Biotechnol Bioeng，1999，64( 2) : 129 － 134． ［15］Ryu Y． W．，Park C． Y．，Park J． B．，et al． Optimization of erythri- tol production by Candida magnoliae in fed － bach culture［J］． Journal of Industrial Microbiology ＆ Biotechnology，2000，25: 100 － 103． 纳豆激酶固态发酵的参数优化 周伏忠1，2，陈晓飞1，陈国参1，2，谢宝恩1，宁萌2 ( 1．河南省微生物工程重点实验室，河南 郑州 450008; 2．河南省科学院生物研究所有限责任公司，河南 郑州 450008) 摘要:方法:在对实验室分离的纳豆激酶产生菌进行菌株鉴定及其酶学性质研究的基础上，对影响菌株固态发酵产酶的工艺 参数进行了优化研究。结果:发酵温度、发酵时间及培养基碳氮比、料水比、pH对纳豆激酶的产生都有较大影响，而接种量对纳 豆激酶影响较小; 在优化条件下，纳豆激酶固态发酵酶活可达到 8 300U /g，为已知最高纳豆激酶单位酶活。 关键词:纳豆激酶;固态发酵; 参数;酶活性;优化 中图分类号: Q939． 9 文献标识码: A doi: 10． 3969 / j． issn． 1004 － 311X． 2011． 01． 032 Study on the Optimization of Nattokinase Solid Culture Conditions ZHOU Fu － zhong1，2，CHEN Xiao － fei1，CHEN Guo － can1，2，XIE Bao － en1，NING Meng2 ( 1． Key Laboratory of Microbial Engineering of Henan Province，Zhengzhou 450008，China; 2． Institute Co． Ltd of Biology，Henan Academy of Sciences，Zhengzhou 450008，China) Abstract: Objective: Tested and optimalized the influence of fermentation factors on the nattokinase activity with our a seperated Bacillus subtilus strain．Method: The flask solid fermentation technique and the transparant circle method on the plate was decided． Result: The fac- tors of culture temperature 29 － 30℃，duration time 72hrs，the water － substance ratio 60 － 70%，and the pH7． 5 were suited for nattoki- nase secreation，nevertheless the influence of inoculum was small． Conclusion: At the optimizing conditions，the activity of nattokinase could reach 8 300 U /g per gram crude． 19 生 物 技 术 2011 年 21( 1) Key words: nattokinase; solid culture; fermenting factors; fibrinolytic activity; optilization 收稿日期: 2010 － 05 － 25; 修回日期: 2010 － 12 － 10 资助项目:河南省省属科研单位社会公益预研项目( “纳豆激酶高产菌 株选育及其酶学性质研究”，0641180203) 作者简介:周伏忠( 1965 － ) ，男，硕士，研究员，研究方向: 应用微生物 技术，Tel: 371 － 63382181，Email: zdsyszfz001@ 163． com。 传统溶栓药物如尿激酶、链激酶等具有人体内半衰期短、 口服无效、易出血等缺点。自 1987 年日本科学家须见洋行从 纳豆食品中分离到具有强烈纤溶活性的纳豆激酶以来，微生 物源溶栓药物的研发受到广泛重视［1 － 3］。近年来，我国科技 人员从豆豉、药酒等原料中分离到多株纳豆激酶产生菌，并开 展了菌株鉴定、发酵、提纯及工程菌构建等多方面研究，取得 明显成效［4 － 8］。在纳豆激酶固体发酵技术研究方面，王正刚 ( 2001) 、鲍艳霞等( 2004 ) 、熊迎新 ( 2005 ) 、杨郁 ( 2007 ) 、李永 飞( 2007) 、郭海勇( 2008) 、夏丽( 2010) 、仓义鹏等用纳豆菌、大 豆或豆渣麸皮、苹果渣等为原料发酵生产的纳豆激酶制剂单 位酶活在 1 577 ～ 5 440 U /g 之间［9 － 16］; 作者从河南省农家自 制豆豉品中分离到 1 株纳豆激酶高产菌株［17］，进行了菌株分 析鉴定和固态发酵参数的优化实验，取得良好的实验结果: 在 优化条件下，本研究获得的纳豆激酶固态发酵酶活在实验室 内达到 8 300U /g以上，为已知文献报道的纳豆激酶的最高单 位酶活。现将实验结果报道如下: 1 材料与方法 1． 1 材料 1． 1． 1 实验材料 菌株 T( 肽园) 为作者实验室分离保藏的纳豆激酶高产菌 株，经生理生化分析和 16S rDNA 分子鉴定，确定为枯草芽孢 杆菌( Bacillus subtilus ssp． ) ［18］，实验室保存。大豆、麦麸等由 市场购买。 1． 1． 2 试剂 牛纤维蛋白原、凝血酶、尿激酶等标准品均购自中国药品 生物制品检定所;氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠等化学试 剂均为国产分析纯。 1． 1． 3 仪器 恒温培养箱;洁净工作台;冷冻干燥机;粉碎机;高速冷冻 离心机，微量加样枪等。 1． 2 方法 1． 2． 1 纳豆激酶的发酵与浸提 1． 2． 1． 1 固态发酵方法:每个三角瓶加干物料 20g，调整碳氮 比，加不同量的蒸馏水; 1%接种量接种，30℃恒温培养 72h，培 养结束后进行冷冻干燥、粉碎。 1． 2． 1． 2 单因子实验的发酵参数变化情况: 见各发酵实验 组。 1． 2． 1． 3 正交试验设计: 根据单因素发酵实验结果，选 取波动较大的因子如培养基碳氮比、初始 pH值和培养基加水 量等设计固态发酵正交试验，实验方案如下。 1． 2． 1． 4 粗酶浸提方法:固体发酵完成后每克发酵物料中加 入 0． 9%生理盐水 5mL，4℃浸提 4h，4500 r /min离心 20min，取 上清液即得纳豆激酶粗酶液。 1． 2． 2 纳豆激酶的活性测定 采用“琼脂糖 －纤维蛋白平板法”测量，然后与标准尿激 酶酶活比对的方法进行; 具体方法参见实验室已发表文 献［15，16］。测得的透明圈面积和尿激酶酶活之间的回归方程为 y = 1． 935x + 53． 505，相关系数 R2 = 0． 9908。 表 1 培养基碳氮源、pH和加水量的 L13 ( 33 )正交试验方案设计 Table 1 Orthogonal experimental design L13 ( 33 ) of media carbon /nitro- gen ratio，pH and water － substance ratio Levels A( carbon /nitrogen) B( pH values) C( water － substance ratio，% ) 1 2∶ 1 7． 0 70 2 1∶ 1 7． 5 75 3 1∶ 2 8． 0 80 Experimental No． Designated levels and combinations 1 1 1 2 2 1 2 1 3 1 2 3 4 1 3 2 5 2 1 1 6 2 1 3 7 2 2 2 8 2 3 1 9 2 3 3 10 3 1 2 11 3 2 1 12 3 2 3 13 3 3 2 2 结果与分析 2． 1 培养温度对纳豆激酶酶活的影响 表 2 培养温度对纳豆激酶酶活的影响 Table 2 Influence of culture temperature on the nattokinase activity Culture temperature( ℃ ) 25 28 31 34 37 40 NK activity( u /g) 2 872． 6 4 801． 9 4 924 4 418． 2 3 666． 5 3 513． 2 图 1 培养温度对纳豆激酶酶活的影响 Fig． 1 Influence of culture temperature on the nattokinase activity 可见，菌株的适宜发酵温度为 29 ～ 30℃。 2． 2 培养基初始 pH值对纳豆激酶酶活的影响 表 3 培养基初始 pH值对纳豆激酶酶活的影响 Table 3 Influence of media pH on the nattokinase activity pH 4． 0 5． 0 6． 0 7． 0 8． 0 9． 0 10． 0 NK activity( u /g) 3 831． 9 4 876． 9 5 068． 4 6 225． 4 6 489． 6 4 711． 7 4 252 图 2 培养基初始 pH值对纳豆激酶酶活的影响 Fig． 2 Influence of media pH on the nattokinase activity 29 2011 年 21( 1) 生 物 技 术 可见，培养基初始 pH值以 7． 0 ～ 8． 0 为好。 2． 3 培养基加水量对纳豆激酶酶活的影响 表 4 培养基加水量对纳豆激酶酶活的影响 Table 4 Influence of water － subatance ratio on the nattokinase activity Water － substance ratio( % ) CK 50 60 70 80 90 NK activity( u /g) 5 068． 4 141． 0 6 192． 7 6 199． 2 5 020． 3 4 782． 3 图 3 － 1 培养基加水量对纳豆激酶产酶的影响 Fig． 3 － 1 Influence of water － substance ratio on the nattokinase activity 图 3 － 2 培养基加水量实验 不同加水量处理的透明圈用 T50 ～ T90表示，Z50另一实验株，数据略。 Fig． 3 － 2 Radical water culture experiments T50 － T90 : transparent zone of the different amount of water treatment; Z50 : another experimental strains，data omitted． 可见，培养基加水量在 60 ～ 70%之间对于纳豆激酶的产 生是比较合适的。 2． 4 发酵时间和接种量对纳豆激酶酶活的影响 表 5 不同接种量对纳豆激酶酶活的影响 Table 5 Influence of inocula proportion on the nattokinase activity Culture time( h) 24 36 48 60 72 84 96 inocula( 1% ) 1 552． 2 4 240． 7 5 262． 8 4 758． 7 5 559． 7 5 373． 4 5 559． 7 ( 2% ) 1 785． 7 5 044． 3 5 008． 2 5 262． 8 5 189． 5 6 251． 2 5 786． 7 ( 3% ) 1 736． 8 4 829． 5 5 116． 7 5 226． 1 6 017． 3 5 672． 8 5 978． 6 Note: The Aspergillus orange 3． 042 inoculum proportion were 2 － 3 × 108， 0． 5%。 图 4 发酵时间和接种量对纳豆激酶酶活的影响 Fig． 4 Influence of fermentation duration and inoculum proportion on the nattokinase activity 由表 5、图 4 可以看出，发酵时间对纳豆激酶活性的有较 大影响，36h后逐渐进入产酶高峰期，以 72 ～ 84h为宜;同时可 以看出，接种量对纳豆激酶活性的影响不大。 2． 5 正交试验 按照正交试验设计进行组合培养基碳氮比、初始 pH值和 培养基加水量等因子，正交试验结果如下。 表 6 正交试验结果与分析 Table 6 Result of the Orthogonal experiment and its analysis Experimental No． Designated levels and combinationsNK activity( u /g) 1 1 1 2 6 570 2 1 2 1 7 691 3 1 2 3 6 650 4 1 3 2 6 530 5 2 1 1 5 711 6 2 1 3 7 563 7 2 2 2 6 627 8 2 3 1 7 309 9 2 3 3 7 393 10 3 1 2 7 142 11 3 2 1 8 346 12 3 2 3 6 530 13 3 3 2 7 605 K1 27 441 26 986 29 057 K2 34 603 35 844 28 554 K3 29 623 28 837 28 136 k1 6 860． 25 6 746． 5 7 264． 25 k2 6 920． 6 7 168． 8 5 710． 8 k3 7 405． 75 7 209． 25 7 034 Range 545． 5 462． 75 1 553． 45 Order C ＞ A ＞ B Excellent level A3 B3 C1 Excellent combination A3 B3 C1 图 5 正交试验 图中 T1 ～ T5 对应表 5 中的正交试验 1 ～ 5，T6 ～ T13透明圈实验结果图 略去。 Fig． 5 Orthogonal experiment T1 ～ T5 : corresponding to the orthgonal test of Tab． 5; Results Chart of T6 － T13 transparent zone figures were omitted． 从表 6、图 5 可以看出，由不同因子、不同水平组合的各个 实验组之间的酶活有较大差异，以第 11 实验组( A3 B2 C1 ) 酶 活最高，达到 8 345． 97U /g;然而，对表 5 试验结果进行直观分 析可见，影响酶活的主次因素依次为: C ＞ A ＞ B，最佳工艺参 39 生 物 技 术 2011 年 21( 1) 数组合为 A3 B3 C1。 3 讨论 近年来，日本、韩国以及我国台湾等地科技人员从各国传 统豆类发酵制品如纳豆、豆豉等原料中分离到多株纳豆激酶 产生菌，开展了菌株分离鉴定、发酵工艺、纯化分离、工程菌构 建以及溶栓等多方面的研究。在我国，纳豆激酶发酵单位在 1 577 ～ 5 440U /g之间徘徊，对纳豆激酶的性质、溶栓效果等 进行了广泛研究。纳豆及其制品作为一种新型的心脑血管疾 病预防保健剂具有诸多的优势，得到大家的广泛认可; 本文对 纳豆中的关键有效因子———纳豆激酶的固态发酵技术参数进 行了优化和分析研究。在本实验研究优化的发酵工艺条件 下，纳豆激酶单位酶活达到 8 300U /g以上;该酶活显著高于已 发表文献报道的纳豆激酶单位酶活［9 － 16，19］，本实验研究为下 一步的纳豆激酶分离纯化与酶学性质研究及开发应用打下了 基础。 参考文献: ［1］SumiH，HamadaH，TsushimaH，et al． A novel fibrinolytic enzyme ( nat- tokinase) in the vegetable cheese Natto: a typical and popular soybean food in the Japanese diet［J］． Experientia，1987，43( 10) : 1110． ［2］谢秋玲，郭勇．纳豆激酶液体发酵条件的优化［J］．华南理工大学学 报:自然科学版，1999，27( 5) : 127 － 131． ［3］梁思宇，陆兆新，邹晓葵，等．高溶纤酶活性枯草芽孢杆菌的分离筛 选与鉴定［J］．微生物学通报，2001，28( 5) : 25 － 28． ［4］刘晓兰，杜连祥，路福平，等． 根霉 12 号固体发酵产生纤溶酶工艺 条件的研究［J］．菌物系统，2003，22( 3) : 481 － 488． ［5］彭勇，张义正． 解淀粉芽孢杆菌 DC － 4 豆豉溶栓酶成熟肽编码序 列的克隆及表达［J］．应用与环境生物学报，2002，8( 3) : 285 － 289． ［6］武临专，陈昉，王以光，等． 一种产生纤溶酶的链霉菌 C － 3662 的 鉴定及发酵研究［J］．微生物学报，2002，42( 5) : 600 － 606． ［7］许爱清，刘晓兰．脉抱霉发酵豆渣产纤溶酶研究［J］．食品与发酵工 业，2008，34( 1) : 77 － 79． ［8］闵伟红，李佳，王影，等． 高产纤溶酶霉菌固体发酵工艺条件的优 化［J］． 食品科学，2008，29( 1) : 207 － 211． ［9］王正刚，丁贵平，蔡正森．纳豆激酶的发酵工艺研究［J］． 氨基酸和 生物资源，2001，23( 2) : 17 － 21． ［10］鲍艳霞，钱之玉，陈钧．豆渣固体发酵产纳豆激酶的工艺优化及其 部分酶学性质研究［J］．大豆科学，2005，24( 1) : 43 － 47． ［11］熊迎新，尹宗宁，李婉宜．纳豆激酶固体浅盘发酵工艺的优化［J］． 中国生化药物杂志，2005，26( 1) : 15 － 17． ［12］杨郁，张丽靖，董本祥．固体发酵及干燥粉碎条件对纳豆激酶活性 的影响研究［J］． 浙江农业科学，2008，( 2) : 241 － 242． ［13］李永飞，王正刚，卢泽民，等． 固体发酵纳豆激酶培养基的优化 ［J］． 粮食加工，2008，33( 1) : 58 － 63． ［14］郭海勇，王波，乔继伟，等．纳豆激酶固体发酵条件优化［J］． 吉林 师范大学学报，2008，( 2) : 66 － 68． ［15］夏丽，沙维，张丽萍． 紫外线诱变选育高产纳豆激酶菌株的研究 ［J］．农产品加工·创新版，2010，( 4) : 29 － 34． ［16］仓义鹏，张宏志，董明盛．苹果渣固态发酵产纳豆激酶的工艺优化 ［J］．食品科学，2010，31( 15) : 180 － 185． ［17］周伏忠，贾蕴莉，陈国参，等．产纤溶酶菌株的分子鉴定及其液体 产酶特点分析［J］． 河南科学，2008，( 5) : 549 － 553． ［18］陈晓飞，杜迅，刘安邦，等．纳豆激酶酶学性质的初步研究［J］． 河 南科学，2008，( 10) : 1212 － 1214． ［19］周伏忠，陈晓飞，陈国参，等．高活力纳豆激酶制备及贮藏方法的 初步研究［J］． 河南科学，2009，( 6) : 675 － 677． 专题综述 REVIEW ARTICLES EST － SSR标记在蔬菜遗传育种中的应用 韩明利1，崔娜1，2* ，于志海1，李天来2，侯丽霞3 ( 1．沈阳农业大学生物科学技术学院; 2．沈阳农业大学园艺学院，设施园艺省部共建教育部重点实验室，辽宁 沈阳 110161; 3．山东农业科学院蔬菜所，山东 济南 250100) 摘要: EST － SSR标记技术是一种有效的功能分子标记方法，它是从 EST 序列中开发的 SSR 标记。该文简单综述了 EST － SSR标记技术开发的基本原理、相对于其他分子标记技术的优点以及该分子标记在蔬菜作物遗传育种如遗传图谱构建、种质资 源和遗传多样性分析、引物通用性、比较作图和品种鉴定、亲缘关系和物种起源进化方面的应用现状。最后指出了现阶段 EST － SSR标记开发过程和应用中存在的几个问题以及应采取的相应措施，并对发展前景进行了展望。 关键词: EST － SSR;蔬菜作物; 遗传育种;应用 中图分类号: S641． 2 文献标识码: A doi: 10． 3969 / j． issn． 1004 － 311X． 2011． 01． 033 Application of EST － SSR Markers in Vegetable Crops of Genetic Breeding HAN Ming － li1，CUI Na1，2* ，YU Zhi － hai1，LI Tian － lai2，HOU Li － xia3 ( 1． Biological Science and Technology College，Shenyang Agricultural University; 2． College of Horticulture，Key Laboratory of Protected Horticulture，Ministry of Education，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110161，China; 3． Shandong Agricultural Academy，Laboratory of Vegetables，Jinan 250100，China) Abstract: EST － SSR marker is one of the effective functional molecular mark methods，which is developed SSR makers from EST． The basic principle and advantages relatived to others in the field of EST － SSR markers development and the application outlook of the vegeta- ble crops were reviewed，which involved in the genetic map construction，germplasm resources and genetic diversity analysis，commonality of primer and comparative mapping，variety identification，genetic relationship and origin of species evolve． In the final，some existing problems and relative measures and prospects for EST － SSR maker were discussed in order to provide reference for reader studying． Key words: EST － SSR; the vegetable crops; genetic breeding; application 49