3 分子杂交和Western

nullnull第三章 核酸分子杂交null核酸分子杂交：具有同源性的两条核酸单链在一定条件下,按碱基互补配对原则形成完整或局部互补双链的过程。一、分子杂交的原理一、分子杂交的原理1、DNA变性 热变性：90~100℃ 强酸强碱变性：常采用碱变性 化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等 2、DNA复性 温度：Tm - 20~25℃, Tm=(G+C)%×0.41＋69.3 离子强度：6×ssc DNA的浓度 DNA的复杂程度二、分子杂交（固液相杂交）二、分子杂交（固液相杂交）（一）固相支持物的选择 结合核酸的能力强（大于10µg/cm2) 不能干扰分子杂交的进行 结合牢固，能耐受杂交和洗膜 非特异性吸附少（对蛋白等吸附少） 具有良好的机械性能和韧性 null（二）种类和特征 1、硝酸纤维素膜（NC） DNA结合中等强度，但高盐浓度下可加速结合，并牢固，80~100µg/cm2 依靠疏水作用结合 非特异性吸附少，特异性结合强，背景干净，本底低 质地脆，韧性差，不能反复杂交 2、尼龙膜 结合能力强，350~500µg/cm2 依靠离子键结合 本底高，非特异性吸附多 质地韧，能反复杂交 三、应用三、应用探针：用于检测的带有标记的已知核苷酸片段。血友病（缺乏Ⅷ因子）Ⅷ因子正常人病人null1、诊断基因缺失：血友病（缺乏Ⅷ因子）2、诊断基因突变：位点正好是酶切位点镰刀形红细胞贫血症（血红蛋白基因为探针）null3、基因达分析原癌基因高度活化，检测其mRNA表达水平。正常人癌症病人例如：c-fos、c-myc基因（都是原癌基因，其高表达与某些癌症有关）c-fosc-myc结论：这种癌症主要与原癌基因c-fos的活化有关，而与c-myc关系不大。4、杂交筛选四、电泳四、电泳1、定义：带电物质在电场中的泳动。2、影响因素：样品的物理性状电荷：越多，泳动越快。分子大小：越大，泳动越慢结构：越小，越规则，泳动越快DNA PI＝4， pH=8—＋DNA81％琼脂糖凝胶泳动速度环状线性切刻null电场强度： 同样的分子电压越大，泳动越快，但过快易拖尾，一般为5v/cm。 离子强度（缓冲液）TAE （Tris.乙酸.EDTA）：缓冲能力差，但成本低，最常用。TBE （Tris.硼酸.EDTA）：缓冲能力最好，但成本高，关键 实验用。TPE （Tris.磷酸.EDTA）：一般不用。支持物介质： 琼脂糖（孔径大，可分离100 bp-60 kp的片段） PAGE （孔径小，分离5 bp-500 bp的片段）null3、指示剂溴酚蓝：蓝紫色二甲苯青蓝：海蓝色在1％琼脂糖凝胶中相当于500 bp的DNA片段泳动的距离在1％琼脂糖凝胶中相当于2000 bp的DNA片段泳动的距离1%琼脂糖凝胶甘油／蔗糖null4、染色剂溴化乙锭 （EB）：特染DNA，插入两个碱基之间，紫外线下 发出红色的光，具有强致癌性。null加入方式： 直接加入到胶中（1％琼脂糖） 称1 g琼脂糖粉＋100 mlTAE（一定与缓冲液一致）100℃煮沸，融化琼脂糖，呈清凉的粘稠液体温度降至60 ℃，加入一滴EB，摇匀灌胶加在缓冲液中：EB带正电荷，DNA带负电荷 胶泡在EB中：EB分子小，可扩散。null bp —1534 — 994 — 695 — 515 — 377 — 237 A B C M 五、分子杂交的过程五、分子杂交的过程(一)印迹： 待测的DNA/RNA转移到固相支持物上的过程。Southern印迹：把DNA转移到固相支持物上的过程。 Northern印迹：把RNA转移到固相支持物上的过程。 null1、 Southern blot 提取基因组DNA 定量：1 OD260 = 50 µgDNA 酶切 进行1%琼脂糖凝胶电泳按分子大小分离null转移到固相支持物上虹吸法 电转移法 真空转移法 变性：NaOH 中和：Tris.cl （pH 8.0）中和强碱nullA.虹吸法18 - 24hnullB.电转移法300-600 mA 4-8 hnullC.真空转移法30 min – 1h干燥：NC膜 （80 ℃真空干烤2 h） 尼龙膜：干烤/紫外线照射大于30 min 4 ℃保存备用。null 2、Northern blot提取RNA注意事项：A.新鲜组织 B.低温操作 C.避免外源性RNase的污染选择相对洁净的空间，戴手套、口罩 所有用具都是新的，高压灭菌的 试剂：DEPC处理的高压灭菌的三蒸水配试剂 0.1%焦碳酸二乙酯，37 ℃过夜后，高压灭菌 所用玻璃器皿180 ℃干烤5-6 h，彻底灭活RNase，不能烤的用0.5%SDS浸泡过夜null避免内源性RNase的污染应用RNase抑制剂：RNasin（特异性抑制剂） 应用蛋白变性剂：酚、SDS、氯仿 其他：硫氰酸胍，异硫氰酸胍（非特异性抑制剂）②RNA定量定量：1 OD260=40 µgRNA 纯度：OD260/OD280 > 1.8 完整性：电泳完整部分降解全部降解28s 18s 5snull③变性电泳1%琼脂糖甲醛变性电泳： 1%琼脂糖30 ml，60 ℃时加入1.62 ml甲醛原液（37%），再加入EB，灌胶，走电泳。 甲醛可使局部的双链打开④转膜：任选一种 ⑤固定null3、斑点和狭缝印迹（Dot and slot blot）①直接点样：将RNA或DNA变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上，固定后直接进行杂交。 ②真空抽滤装置优点：简单，快速，一张膜可同时进行多个样品的检测。 缺点：不能鉴定所测基因的分子量，特异性不高，有一定的假阳性。null（二）探针标记1、探针：用于检测的已知核苷酸片段。 2、探针种类：基因组DNA探针：酶切基因组DNA，得到某个片段； 克隆化的各种基因片段。含内含子，不适用 Northern杂交cDNA探针：只含外显子，Southern、Northern都可用。 RNA探针：单链，不用变性，特异性高，本底低，但易降解。 寡核苷酸探针：人工合成的一小段核苷酸序列，15-30 bp，简单，杂交时间短，适用于点突变分析，但标记物掺入少，灵敏性差。null3、标记物特性：高度灵敏； 标记物与探针可以结合，并且不能影响探针的碱基 配对特异性； 应不影响探针的主要理化特性、杂交特异性和杂交稳定性，杂交体系的Tm值无较大改变； 检测的方法具有高度特异性。种类非同位素：（生物素、地高辛、荧光素、半抗原）灵敏度和特异性都低同位素：（α、γ32P）灵敏度高，条带清晰，背景干净。null4、标记方法①切口平移法得到的探针是片段null注意事项：null②随机引物法随机引物：4种碱基按照6或8个长度随机组合得到所有寡核苷酸片段。得到的探针也是片段，其长度与随机引物的长度有关。null注意事项：避免了DNaseⅠ加入量的不确定，但有随机引物的量及碱基数的要求。 标记的链是新合成的链，对母链没有进行标记。 若片段过长则含同位素多，射线强，易引起DNA断裂，所以现标现用，不要放置时间过长。 可标记双链、单链DNA或RNA。null③3‘末端标记法标记的是双链，不破坏完整性。酶切后必须是3’凹陷null注意事项：根据不同的酶切位点选择不同的标记核苷酸。 例如：EcoRⅠ位点 5’GAATTC 3‘CTTAAG 不能用于3’凸端的DNA标记。 一般两端标记，否则标记量太少。5’AATTC3’TTAAG只能标记A或Cnull④ 5‘末端标记法5’3’3’5’碱性磷酸酶γ-32P-ATP T4DNA激酶注意事项：只能选γ-32P-ATP，供能。 要求DNA纯度高，末端不能包裹蛋白。null5、探针的纯化凝胶柱层析纯化法：Sephadex G-50 乙醇沉淀法：DNA在一价盐离子存在时与醇不互溶，在低温 （－20℃）过夜，DNA片段可沉出，离心收集 沉淀，TE溶解即可。null（三）固－液相杂交杂交体系的建立（复性过程）杂交温度：Tm－（15-25℃） 加入甲酰胺后固定为42℃离子强度：5ⅩSSC或6ⅩSSC 1ⅩSSC：0.15 M Nacl，0.15 M柠檬酸钠DNA的浓度：先做预实验 探针一般50 µl／cm2为宜探针长度：杂交时间：一般24 h（不小于16 h)。null杂交过程预杂交起封闭作用，减少非特异性结合null预杂交液6ⅩSSC 0.5％ SDS 5ⅩDanhart‘s溶液（含有聚乙烯吡咯烷酮，Ficoll 100和BSA三种大分子物质） 50％甲酰胺 100 µg/ml变性鲑精DNA时间：5－6 h 温度：42℃预杂交液的量：0.2 ml/cm2null杂交在预杂交液中直接加入探针，杂交16－24 h。洗膜室温洗： 1ⅩSSC 0.1% SDS 洗15min，洗掉吸附的探针。65 ℃特异性洗膜0.1ⅩSSC 0.1％ SDS洗掉非特异结合的探针，边洗边用盖革计数器测量，直到背景无噪音为止。放射自显影－70℃，3天。nullnullnullWestern blot一、定义把蛋白质转移到固相支持物上的过程，是一种检测蛋白质表达水平的方法。二、原理利用抗原－抗体特异性反应来检测转移至膜上的微量蛋白质null三、过程1、提取蛋白质RIPA裂解液Tris.cl (pH7.5) 50 mM Nacl 150 mM NP-40 1% 脱氧胆酸钠 0.5% SDS 0.1% EDTA 1 mM PMSF 1 mM Na3VO4 1 mM先用现加（提取总蛋白，主要是 胞浆蛋白的裂解液）null2、蛋白定量测定OD280：可测定芳香族氨基酸的含量 考马斯亮蓝G250染色：侧链集团与G250显色，根据深浅测定蛋白质含量。 福林－酚试剂法（Lowry)null1 2 3 4 5 6 sampl 1 sam 2 sam 31 2 4 8 16 32 10 10 10 (µl)BSA (1 mg/ml)999 998 996 992 984 968 990 990 990 (µl)NS浓度 （µg/µl)1 2 4 8 16 32+ A液 0.9 ml50℃，10 min+ B液 0.1 ml室温，10 min+ C液 3 ml50℃，10 min平衡到室温，650 nm测吸光度值（2 g酒石酸钾钠＋100 gNacl溶于500 ml 1 MNaOH中，再定容至1000 ml）（ 2 g酒石酸钾钠＋1 g 5H2O.CuSO4，先溶于少量水中，再定容至90 ml，再加入10 ml 1 MNaOH）（市售的酚试剂，1:15稀释）改良的Lowry法：null根据品绘制标准曲线null3、SDS－PAGE不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS（与蛋白结合，使蛋白变性，亚基分开，并使蛋白质带上相同的电荷，这样蛋白在电场中的泳动速度只与其单个亚基的分子大小有关，与其空间构象和本身带电多少无关）null浓缩原理：浓缩胶中Arc的浓度是5％，形成的孔径大，蛋白泳动快 分离胶中Arc的浓度是8％，形成的孔径小，蛋白泳动慢蛋白质拥挤在 交界面初。Tris－甘氨酸系统浓缩胶pH=6.8，泳动速度为Cl>蛋白质>甘氨酸分离胶pH=8.8，甘氨酸不再影响蛋白泳动nullnull5Ⅹ电泳缓冲液Gly 23.5 g Tris 3.375 g250 ml H2O使用时：76 ml 5Ⅹbf + 4 ml 10% SDS 400 ml5Ⅹloading bf0.5 M Tris.cl pH 6.8 5 ml SDS 1 g β-巯基乙醇 0.6 ml 50%甘油 8 ml 0.25%溴酚蓝 1 ml H2O 44 ml使用时与蛋白样品混合，稀释成1Ⅹ，100℃煮沸5 minnull聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（单丙）和甲叉双丙烯酰胺（双丙）聚合而成 聚合过程需要催化剂。分离胶8％30％ Arc 2.16 ml 0.67 ml (29 g 单丙＋1 g双丙 100 ml) 1M Tris.cl pH=8.8 3 ml 0.5 ml (pH6.8) 10% SDS 80 ul 40 ul 10% AP 80 ul 40 ul TEMED 5 ul 4 ul H2O 2.67 ml 2.7 ml 8 ml 4 ml浓缩胶5％催化剂120 v 1-2 hnull4、转膜电转移，PVDF膜10Ⅹ转膜缓冲液Gly 14.5 g Tris 29 g SDS 1.85 g500 ml使用时：100 ml 10Ⅹ转膜bf用水稀释成800 ml，再加200 ml甲醇（浓度为20％，起固定蛋白的作用，边转膜边固定）90 V，2－3h（90 kDa)，根据所测蛋白的分子量决定。null5、封闭封闭液5％ 脱脂奶粉 1％ BSA方法室温振荡4－5 h 37℃ 2 h 4 ℃ 过夜6、加一抗可用封闭液或TTBS稀释一抗到合适的浓度 例如：检测大鼠actin蛋白，使用兔抗大鼠的actin抗体（1：1000） TTBS 5 ml + 5 ul 抗体室温振荡4－5 h 37℃ 2 h 4 ℃ 过夜方法null7、洗膜TBSTris 1.21 g NaCl 9 g 1 LTTB：TBS中加入0.05－0.1％的Tween 20室温洗3遍，每次10 min。8、加二抗标记有辣根过氧化物酶的抗一抗的抗体： 抗兔IgG（actin），室温2 h。9、洗膜TTBS洗3遍后，再用TBS洗5 min。null10、显色4－氯－1－萘酚显色TBS 8 ml 4－氯－1－萘酚 1.6 ml (甲醇配制的3 mg/ml溶液） 30% H2O2 4 ul 避光显色5－10 min发光显影发光试剂A和B，等体积混合后，可与辣根过氧化物酶反应，发出绿色荧光，使X光片显影。DAB显色二氨基联苯胺与辣根过氧化物酶反应，生成有色产物。null提取蛋白溶液 蛋白定量 SDS－PAGE转膜封闭一抗洗膜二抗洗膜显色正常人癌症病人C-fosnull生 物 芯 片null概 念 生物芯片是指包被在硅片、尼龙膜等固相支 持物上的高密度的组织、细胞、蛋白质、核 酸、糖类以及其它生物组分的微点阵。 芯片与标记的样品进行杂交，通过检测杂交 信号即可实现对生物样品的分析。 分类：基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片 元件型微阵列、通道型微阵列、生物传感芯片 null分 类 基因芯片：reverse northern - dot blots 基因芯片：检测基因突变 基因表达谱芯片：检测基因表达水平 蛋白质芯片：蛋白质在载体上的有序排列，依 据蛋白质分子、蛋白质与核酸相互作用的原理 进行杂交、检测和分析。 组织芯片：从不同的组织内进行活体解剖后取 出圆柱状的组织，然后包埋在受体区组内null基因芯片（DNA微阵列） 寡核苷酸芯片、cDNA芯片、Genomic芯片 模式一：是将靶DNA固定于支持物上，适 合于大量不同靶DNA的分析， 模式二：将大量探针分子固定于支持物上， 适合对同一靶DNA进行不同探针序列的分 析。 null 将大量探针分子固定于支持物(substrate)上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。 基 因 芯 片 原 理null基 因 芯 片 流 程样品制备芯片制备杂交杂交信号检测数据分析nullnull芯 片 样 品 制 备 一般以一张芯片需要3ug mRNA的量来计算 因个体差异、匀浆、研磨损耗等原因，送检样 品应多1-2倍 注意：样品保存时应保证避免RNA酶的分解作用null基 因 芯 片 的 应 用 基因表达分析： 分析基因表达时空特征 检测基因差异表达 发现新基因 大规模测序 基因型、基因突变和多态性分析 分析基因组中不同基因与性状或疾病的关系 null基 因 芯 片 的 应 用 疾病的诊断与治疗 遗传病相关基因的定位:产前筛查与诊断 肿瘤诊断 感染性疾病的诊断 药物研究中的应用 新药开发 发现药物的新功能 调查药物处理细胞后基因的表达情况 对药物进行毒性 null基 因 芯 片 的 应 用 基因芯片在中医学领域中的应用 药物筛选 中医“证”本质的研究 针灸原理研究 其它应用 环境化学毒物的筛选 体质医学的研究 null蛋 白 质 与 抗 体 芯 片原理： 芯片上固定的分子是蛋白质如抗原或抗体等； 蛋白分子、蛋白与核酸、蛋白与其它分子的相互作用 应用： 蛋白质的结构功能研究；医学诊断和医疗； 新药开发；生物工业等 难点： 蛋白质的纯度；蛋白质的固定 null发 展 趋 势 降低所需费用 进一步提高自动化 扫描、数据分析等方面：软件开发