应用δ氨基-γ-酮戊酸脱氢酶基因型筛查儿童铅毒性易感人群的研究

基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (39970645) 作者单位 :200092 上海第二医科大学新华医院儿科 　上海市 儿科医学研究所 ·论著· 应用δ氨基2γ2酮戊酸脱氢酶基因型 筛查儿童铅毒性易感人群的研究 吴胜虎 　沈晓明 　颜崇淮 　殷洁敏 　章依文 　周建德 【摘要】　目的 　通过对浙江者兰溪市某污染区儿童δ氨基2γ2酮戊酸脱氢酶 (ALAD) 基因的遗传 多态性 ,探讨遗传因素对儿童血铅水平的影响。 　整群抽取对铅毒性较为敏感的 6～10 岁 儿童 229 名。研究两种 ALAD 等位基因 (ALAD1 和 ALAD2)的频率并测定血铅水平 ,同时问卷调查每位 研究对象血铅水平的相关因素 , 分析两种 ALAD 等位基因对儿童血铅水平的影响。结果 　(1) 所研究 儿童ALAD121 型有 211 例 ,占 9211 % ;ALAD122 型有 18 例 ,占 7. 9 % ; (2)携有等位基因ALAD2 的儿童血 铅水平几何均数为 117μg/ L ,携有等位基因 ALAD1 的儿童血铅水平几何均数为 97μg/ L ; (3) 儿童血铅 水平相关因素分析发现 ,儿童 ALAD 基因型、性别、父亲职业等 9 个因素与血铅显著相关。采用多元 逐步回归分析 ,发现 ALAD 基因型对血铅水平的影响在排除协变量影响后仍有极显著的统计学意义。 结论 　本组儿童 ALAD 基因存在遗传多态性 ;携有含 ALAD2 等位基因的人群可能为铅毒性作用的高 危人群。 【关键词】　铅中毒 ; 儿童 ; 氨基酮戊酸脱水酶 ; 基因型 ; 等位基因 Screening of high risk children for lead poisoning by analysingδ2aminolevulinate dehydratase ( ALAD) genotype 　 WU Shenghu , SHEN Xiaoming , YAN Chonghuai , et al . Department of Pediatrics , Xinhua Hospital , Shanghai Second Medical University , Shanghai Institute of Pediatric Medical Research , Shanghai 200092 , China 【Abstract】　Objective 　To explore the relationship between blood lead levels and the genetic polymorphism of theδ2aminolevulinate dehydratase (ALAD) gene. Methods 　The erythrocyte ALAD isozyme phenotypes and the blood lead levels were determined in a population of 229 pre2school children and primary school students aged 6210 years. Both the school and their homes were within one community where a large smelter is located. An environmental questionnaire was filled for each subject. Results 　(1) The gene distribution of the ALAD isozyme phenotypes in these children was ALAD 121 , 92. 1 % ; ALAD 122 , 7. 9 % ; no ALAD 222 was detected. (2) The mean blood lead levels of the environmentally exposed children who were homozygous for the ALAD1 allele was 97μg/ L while the mean levels for those who were heterozygous for the ALAD2 was 117μg/ L or 20μg/ L higher. (3) Many factors were found to affect the blood lead levels , such as gender , ALAD isozyme phenotype , educational level of fathers and so on. After controlling these possible confounding variables by multiple regression , the contribution of the ALAD isozyme phenotype to the blood lead levels was still statistically significant. Conclusion　These results indicate that individuals carrying the ALAD2 allele are more likely to have sustained increases in blood lead levels when exposed to a lead contaminated environment. The finding supports the hypothesis that individuals with the ALAD2 allele may be more susceptible to lead poisoning. 【Key words】　Lead poisoning ; Child ; Aminolevulinic acid dehydratase ; Genotype ; Alleles 　　在以往的流行病学研究中 ,人们发现 ,处于相似 铅暴露环境的儿童有的血铅水平很高 ,而有些血铅 水平并不增高 ;同样血铅水平的儿童有的表现出明 显的智能发育障碍 ,而有些表现则不明显。这说明 , 除了环境暴露因素外 ,机体的易感性也是铅毒性作 用的重要决定因素。国外研究发现 ,机体对铅毒性 作用的易感性与δ 氨基2γ2酮戊酸脱氢酶 (δ2 aminolevulinate dehydratase ,ALAD) 的遗传多态性有 关。中国儿童是否也存在类似现象 ? 本研究就此进 行了探讨。 对象和方法 　　一、对象 在浙江省兰溪市某铅作业工厂子弟小学及该小 ·534·中华儿科杂志 2000 年 7 月第 38 卷第 7 期　Chin J Pediatr , July 2000 , Vol 38 , No. 7 学邻近厂区整群抽取学前班和 1～3 年级儿童共计 229 名。 二、方法 11 标本留取和填写及赋值 :抽取肘静脉血 2 ml ,分置 2 管 ,每管各 1 ml ,采用 EDTA (7 % ,10μl) 抗凝 ,第 1 管留测定血红蛋白和血铅 ,第 2 管分离白 细胞、抽提 DNA ,供进一步做聚合酶链反应及酶切 分析。 同时在专职医生指导下由家长根据统一填 写一份本中心自行编制的儿童铅中毒调查专用的 “儿童家庭社会环境与健康问卷”。问卷内容涉及家 庭一般情况、儿童个人情况、家庭社会环境以及父母 情况等 27 个问。并对每个变量按统一标准进行 相应的赋值 (赋值方法 :根据文献报道可能为儿童铅 中毒危险因素的变量赋值高 ,如 : ALAD 基因型 , ALAD121 型赋值为 1、ALAD122 型赋值为 2 ;性别 ,女 赋值为 1、男赋值为 2 ;文化程度越低赋值越高 ;职业 层次越低赋值越高等) 。 21 白细胞分离、DNA 抽提 :常规苯酚、氯仿法抽 提基因组 DNA。 31ALAD 基因型分析 : (1) PCR 扩增 ALAD 基因 上一个长度为 916 bp 片段。PCR 引物 :上游引物 : 5′2AGACAGACATTAGCTCAGTA23′; 下 游 引 物 : 3′2 GGCAAAGACCACGTCCATTC25′。(2) ALAD 基因型分 析 :用内切酶 Msp Ⅰ对 PCR 扩增的 ALAD 基因片段 (916 bp)进行酶解 ,并辅以内切酶 BsrF Ⅰ进行确认。 酶解产物用琼脂糖凝胶电泳 ,通过分析带型的变化 识别有无基因突变 ,以确定本组 ALAD 基因型。 41 统计方法 :首先对儿童血铅水平进行描述性 统计及正态性检验 ,然后以直线相关分析 ALAD 基 因型、性别、父亲文化、父亲职业等各变量对血铅水 平对数的影响 ,筛选出有统计学意义的变量。以血 铅水平对数为因变量进行多元逐步回归分析。统计 分析用 Statistica for Windows 5. 0 软件。 结 果 　　一、229 例儿童血铅水平描述性统计结果 229 例儿童血铅经正态性检验为非正态分布 , 故采用几何均数表示 , G = 99 μg/ L ( log€x ±slg€x 为 1. 993 9 ±0. 130 0) 。血铅水平范围 45 μg/ L ～ 264 μg/ L。 二、229 例儿童 ALAD 基因型分析结果 229 例儿童中 ALAD121 为 211 例 ,占 92. 1 % ; ALAD122为 18 例 ,占 7. 9 % ;未发现 ALAD222。 三、229 例儿童血铅水平与 ALAD 基因型关系分 析 从表 1 可以看出 ALAD 122 型血铅水平几何均 数平均比 ALAD 121 型高 20μg/ L ,两者之间的差异 有显著性 ( t = 2. 573 3 , P = 0. 010 7) ,表明 ALAD 122 型个体的血铅水平可能较 ALAD 121 型者高。 表 1 　ALAD 基因型与血铅水平之间的关系 基因型 例数 几何均数 G(μg/ L) log€x ±s lg€x ALAD 121 211 97 1. 987 5 ±0. 131 0 ALAD 122 18 117 2. 068 7 ±0. 089 6 　　注 :两组比较 t = 2. 573 3 , P = 0. 010 7 四、229 例儿童血铅水平相关因素单因素相关 分析 在该分析中 ,本组研究以调查问卷中 27 个变量 及血红蛋白、家庭社会经济状况 (父母文化、父母职 业之和)家庭、社会经济状况 (SES)共 29 个变量逐个 与儿童血铅水平对数进行相关分析 ,发现 ALAD 基 因型、性别、父亲职业层次、父亲文化、领养人文化程 度、居住路边距离、燃料类型、SES、母亲文化程度等 9 个变量与儿童血铅水平呈显著正相关。 五、多元逐步回归分析 对 29 个变量进行多元逐步回归分析 ,以排除掺 杂因 素 的 干 扰。结 果 见 表 2。回 归 方 程 为 : y (血铅) = 1. 587 9 + 0. 123 4 x2 + 0. 158 7 x5 + 0. 128 3 x23 + 0. 152 2 x28 + 0. 179 7 x29。所得回归方程为 : F(11 ,217) = 4. 685 4 , P < 0. 01。 表 2 　229 名儿童血铅水平影响因素 　多元逐步回归分析结果 入选变量 系数 标准误 t 值 P 值 截距 1. 587 9 0. 076 8 x29领养人文化 0. 179 7 0. 080 6 2. 23 0. 026 9 x5 ALAD 基因型 0. 158 7 0. 061 8 2. 57 0. 010 9 x28父亲文化程度 0. 152 2 0. 074 6 2104 0. 042 5 x23燃料类型 0. 128 3 0. 064 7 1. 98 0. 048 5 x2 性别 0. 123 4 0. 062 4 1. 98 0. 049 4 多元逐步回归分析表明 ,最终进入儿童血铅水 平对数回归方程共有 5 个变量 ,按其对因变量血铅 水平对数的影响由大到小分别为 ALAD 基因型、领 养人文化程度、父亲文化程度、厨房燃料类型、性别。 其中 ALAD 基因型对血铅水平的显著贡献在排除掺 ·634· 中华儿科杂志 2000 年 7 月第 38 卷第 7 期　Chin J Pediatr , July 2000 , Vol 38 , No. 7 杂因素的作用后依然存在 ,表明 ALAD 基因型对儿 童血铅水平确实有影响。 讨 论 　　一、影响儿童血铅水平的相关因素 人体内的铅全部来自外界环境 ,外界环境中的 铅主要由消化道和呼吸道进入儿童体内。以往的调 查均发现 ,血铅水平受多个因素影响。寻找影响儿 童血铅水平的相关因素是进行儿童铅中毒预防的前 提。 国内的研究发现 ,儿童的血铅水平受父母文化、 父母职业、领养人文化和 SES 等因素影响[1 ] 。本研 究调查了 29 个可能影响儿童血铅水平的因素 ,经单 因素分析发现 ,ALAD122 型、父亲职业层次低、父母 亲文化程度低、领养人文化程度低、以煤为厨房燃 料、SES分值高、房屋距马路近、男孩等可能是儿童 铅中毒的危险因素。采用多元逐步回归分析以排除 各影响因素间的交互作用 ,结果发现 ,对儿童血铅水 平对数具有统计学意义的变量有 5 个 ,按影响大小 依次为 ALAD 基因型、领养人文化程度 (本组儿童领 养人多为母亲) 、父亲文化程度、燃料类型、性别。 研究已证实领养人及父亲文化程度与儿童的血 铅水平密切相关 ,领养人及父亲文化程度较低的家 庭 ,儿童的血铅水平往往较高。由于煤炭都含有一 定量的铅 ,燃烧过程中释放的铅会造成铅污染。上 海市的研究发现 ,以煤制品为燃料的家庭 ,其室内空 气中平均含铅量比室外空气高 18 倍 ,这些家庭儿童 血铅浓度也明显高于非燃煤家庭儿童的血铅浓 度[2 ] 。美国的研究已多次证实 ,除了 1～2 岁年龄组 男性血铅水平略高于女性外 ,其余各年龄组 ,男性的 血铅水平明显高于女性[3 ] 。与我们的研究结果一 致。男、女血铅水平之间的性别差异究竟是由于男 性暴露于铅污染环境的机会较多 ,还是铅代谢本身 存在着性别差异 ,尚无明确的结论。 二、ALAD 基因型对儿童血铅水平的影响 环境中的铅是造成儿童铅中毒的根本原因 ,也 是影响铅毒性的重要因素 ,但并不是唯一因素。除 了环境暴露因素外 ,机体的易感性也是铅毒性作用 的重要决定因素。国外研究发现 ,机体对铅毒性作 用的易感性和 ALAD 的遗传多态性有关[3 ] 。 本研究调查了 229 例儿童血铅水平并检测了这 些研究对象的 ALAD 基因型 ,经单因素分析表明 ,携 有等位基因 ALAD2 个体的血铅水平较携有等位基 因 ALAD1 个体的血铅水平有显著增高 , 平均高 20μg/ L ( P < 0. 05) 。在关于儿童血铅影响因素的 多元逐步回归方程中 ,ALAD 基因型变量被引入 ,且 回归方程有显著意义。这表明在排除了掺杂因素影 响后 ,ALAD 基因型对儿童血铅水平的影响依然存 在。此结果说明 ALAD 基因型对儿童血铅水平确有 影响。因此我们可推测本组儿童中携有 ALAD2 等 位基因个体可能对环境中的铅更易感。本组儿童 ALAD 基因的突变频率 (7. 9 %)低于美国 (11 %) 及德 国 (21 %) [4 ] 。由于本研究样本量较小 ,有关中国儿 童 ALAD 基因的突变频率及其对血铅水平的影响尚 需进一步研究。 三、ALAD 基因型对铅毒性影响的机制 11 遗传学基础 :有关铅毒性作用遗传学基础的 研究尚不多见 ,目前的研究主要集中在 ALAD[5 ] 。 ALAD 存在遗传多态现象 ,ALAD 由单个基因 ALAD 基因编码 , 位于染色体 9q34 , 有 2 个等位基因 (ALAD1 和 ALAD2) ,在欧洲人群中两者出现的频率 为 9∶1。这两种等位基因的不同表达组成了 3 种遗 传表现型。最近的研究表明 ,儿童表现为杂合子和 22 2型纯合子者对铅中毒的易感性增高[4 ,6 ,7 ] 。 Wetmur 等[4 ]进行一大样本的研究发现 ,等位基因 ALAD2 的出现和儿童血铅增高有关。出现等位基因 ALAD2 的人群中 ,血铅水平超过 300μg/ L 的比例明 显增高。Wetmur 等[4 ] 研究发现 , ALAD222 型和 ALAD122 型个体在受到铅暴露时更容易发生高血铅 和铅中毒 ,是铅毒性的易感和高危人群。同样环境 铅暴露水平携带 ALAD2 等位基因的纯合子个体的 血铅要比携带等位基因ALAD1 高 100μg/ L。Wetmur 等[4 ]估计等位基因 ALAD2 对血铅水平的贡献要占 血中总铅的 40 % ,因此 ,ALAD2 是人类铅毒性遗传 易感性的标志 ,该基因携带者是铅毒性的易感人群。 21 分子机制 : 1991 年 Wetmur 等[4 ]发现 ALAD2 等位基因是由于基因序列上第 177 位核苷酸 (第 59 位氨基酸) 发生 G→C 突变。这个突变的结果是带 正电荷的赖氨酸被电中性的精氨酸代替 ( K59N 突 变) 。这是 ALAD1 和 ALAD2 多肽的主要区别[7 ] 。两 种不同类型的氨基酸替换可改变酶构象而使酶活性 发生改变。由于 ALAD 酶构象的改变 , 增加了 ALAD2 亚单位与铅的亲和力 ,使 ALAD2 亚单位与铅 的结合更为紧密 ,从而导致携有 ALAD2 亚单位的个 体 (ALAD222 型和 ALAD122 型)在受到铅暴露时更容 易发生高血铅和铅中毒。此外 ,ALAD 多态性影响 ·734·中华儿科杂志 2000 年 7 月第 38 卷第 7 期　Chin J Pediatr , July 2000 , Vol 38 , No. 7 铅的毒性代谢动力学 ,使铅的生物利用度降低 ,导致 铅在体内循环池中长期蓄积[8 ,9 ] 。 四、临床意义 由于携带等位基因 ALAD2 的人群可能是铅毒 性的易感人群 ,如果我们能通过建立某种快速、简便 的方法 ,将那些遗传特性上对铅毒性高度易感的人 群 (即高危人群)筛查出来 ,对他们进行重点预防 (如 进行小环境干预、针对性健康教育、个体化药物预防 等) ,可望在现有条件下明显减轻环境铅污染对儿童 健康的危害 ,提高儿童的健康水平。 参 考 文 献 1 颜崇淮 ,沈晓明 ,章依文 ,等. 上海市儿童血铅水平及其影响因素 的流行学研究. 中华儿科杂志 , 1998 , 36 :1422145. 2 沈晓明. 儿童铅中毒. 北京 :人民卫生出版社 ,1996. 42243. 3 Brody DJ , Pirkle JL , Kramer RA , et al . Blood lead levels in the US population. JAMA , 1994 , 272 :2772283. 4 Wetmur J G, Lehner G, Desnick RJ . Theδ2aminolevulinate dehydratasepolymorphism: high blood lead levels in lead workers andenvironmentally exposed children with the 122 and 222 isozymes. EnvironRes , 1991 , 56 :1092119.5 吴胜虎 ,颜崇淮 ,沈晓明. ALAD 基因型与儿童铅毒性易感性. 国外医学儿科学分册 , 1999 , 26 :85287.6 Wetmur J G. Influence of the common human δ2aminolevulinatedehydratase polymorphism on lead body burden. Environ HealthPerspect , 1994 ,102 :2152219.7 Wetmur J G, Kara AH , Pleminska M , et al . Molecular characterizationof the human δ2aminolevulinate dehydratase 2 (ALAD2) allele :implications for molecular screening of individuals for geneticsusceptibility to lead poisoning. Am J Hum Genet , 1991 ,49 :7572763.8 Fleming DE , Chettle DR , Wetmur J G, et al . Effect of the delta2aminolevulinate dehydratase polymorphism on the accumulation of lead inbone and blood in lead smelter workers. Environ Res , 1998 ,77 :49261.9 Alexander BH , Checkoway H , Mallen PC , et al . Interaction of bloodlead andδ2aminolevulinic acid dehydratase genotype on markers of hemesynthesis and sperm production in lead smelter workers. Environ HealthPerspect , 1998 , 106 :2132216. (收稿日期 :1999208219)(本文编辑 :钱越) 作者单位 :400038 重庆 ,第三军医大学第一附属医院儿科 ·病例报告· 慢性肉芽肿病一例 赵文利 　孔祥英 　吴嘉惠 　　患儿男 ,6 岁。因反复皮下肿块 3 年 ,复发 10 d 入院。 患儿于 3 岁起腿部出现疖肿 ,左腹股沟淋巴结如鸡蛋大 ,伴 发热 ,此后间隔数周反复出现腹股沟、　窝、颈淋巴结肿大 , 如蚕豆至鸡蛋大 ,或伴头皮疖肿、皮下肿块、口角和唇周面颊 小丘疹 ,每次均以抗感染和局部切开排脓后好转。于 1998 年 12 月首次入院 ,血培养阴性 ,脓液培养 :金黄色葡萄球菌 , 仍予以上治疗 ,病情好转出院。于 1999 年 6 月再次入院。 体检 :体温 39 ℃,体重 19 kg 。背部可见 3 个皮下肿块 ,直径 1. 5 cm～2. 0 cm ,左、右腋下淋巴结肿大 , 分别为 1. 5 cm ×1. 8 cm×1. 0 cm和 3. 0 cm ×1. 5 cm ×1. 5 cm 大 ,有压痛。左外耳 道有恶臭脓液。心、肺、腹无异常。Hb 115 g/ L ,WBC 21. 6 × 109/ L ,中性粒细胞 0. 737 ,嗜酸性粒细胞 (0. 94～1. 3) ×109/ L ,T 淋巴细胞亚群 : T3 44 % ,T4 27. 4 % , T8 21. 2 %。IgG 18. 5g/ L , IgA 720 mg/ L , IgM 2 530 mg/ L。X线胸片正常 ,骨髓象 :粒系 晚幼、杆状核比例偏高 44 % ,嗜酸性粒细胞易见。左耳及背 部肿块脓液培养均为粪肠球菌 ,多次血培养均阴性。入院后 给予复方磺胺甲恶唑、美佳林、利福平等抗感染 ,次日未再发 热 ,背部肿块及腋下肿大淋巴结渐软化 ,切开排脓后好转出 院 ,共住院 15d。住院期间查四唑氮兰 (NBT) 还原试验阳性 细胞 2 % ,感染控制后复查阳性细胞 1 % ,诊断为慢性肉芽肿 病 (chronic granulomatous disease ,CGD) 。 讨论 :CGD 系由于中性粒细胞、单核细胞及巨噬细胞内 还原型辅酶 Ⅱ氧酶活性低下 ,活性氧产生不足 ,致其杀菌功 能缺陷引起的疾病 ,其发病率低 ,约 1～2/ 100 万。查阅近 3 年中文期刊中虽有 27 篇相关报道 ,但仅有 1 例为 6 个月婴 儿病死后尸检确诊的病例。国外近 3 年文献中相关报道 180 余篇 ,其中 14 岁以下病例约 47 例。因该病早期极易与普通 感染相混淆 ,且无特征性表现 ,故不易确诊。诊断 CGD 最简 便价廉的方法是 NBT还原试验。结果用阳性细胞的百分率 表示。正常人外周血内中性粒细胞的 NBT还原试验阳性率 为 7 %～15 % ,平均为 10 %。CGD 患儿 NBT还原试验阳性率 显著降低 ,甚至为 0。随着诊断技术的发展 ,目前还可使用 化学发光试验或流式细胞仪检测到患者的中性粒细胞活性 氧产生低下 ,国外采用经皮取脐血检测胎儿中性粒细胞的 NBT还原反应 ,以及通过对绒毛及羊水细胞进行 DNA 分析 协助诊断。已证实存在 gP912Phox 缺失患者及 P67缺失的健康 基因携带者。 本病的治疗主要选用杀菌且敏感的抗生素抗感染 ,并发 脓肿则需及时切开引流。本病的预后不良 ,约 1/ 3 患者于 7 岁内死于全身感染。磺胺类药物可改善症状 ,使长期生存成 为可能。 (收稿日期 :1999212224) (本文编辑 :滕淑英) ·834· 中华儿科杂志 2000 年 7 月第 38 卷第 7 期　Chin J Pediatr , July 2000 , Vol 38 , No. 7