氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物歧化酶(SOD)的活力

氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物歧化酶(SOD)的活力 一、 目的与要求 SOD在植物抗逆过程中发挥着重要的作用，通过本实验理解其抗逆机理，熟悉其操作步骤及其计算。 二、原理 SOD是普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2-，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2-，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。一个酶活力单位定义为将NBT的还原抑制到对照一半（50％）时所用的酶量。 三、材料、仪器设备及试剂   （一）材料：水稻或小麦叶片   （二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）；5.试管 （三）试剂：　 1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8: 0.2mol/L Na2HP04 91.5 ml; 0.2mol/L NaH2P04 8.5 ml）； 2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9397gMet用磷酸缓冲液定容至100ml； 3. 750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存； 4. 100μmol/L EDTA－Na2溶液：称取0.03721gEDTA－Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml； 5. 20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存。 四、实验步骤 1. 酶液提取：取叶片0.5g于预冷的研钵中，加2ml预冷的PH 7.8的磷酸缓冲液，在研钵上研磨成匀浆，加缓冲液使终体积为10ml，取5ml于4度下4000rpm离心15min，上清液即为SOD粗提液。 2. 显色反应：取25ml玻璃管4支，2支为对照管，按下加入各溶液： 试 剂 名 称 用 量（ml） 0.05mol/L PH 7.8 磷酸缓冲液 3 130mmol/L Met 溶液 0.6 750μmol/L NBT 溶液 0.6 100umol/L EDTA 溶液 0.6 20μmol/L 核黄素 0.6 酶液 0.2（对照以失活酶液代替） 蒸馏水 1.0 总体积 6.6 混匀后将1支对照管放置暗处，其他各管于4000Lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，反应温度控制在25～35℃之间，视酶活性高低适当调整反应时间）。 3. SOD活性测定与计算：至反应结束后，以不光照的对照管做空白，分别测定其他各管的吸光度，按下式计算SOD活性。 SOD活性＝ EMBED Equation.DSMT4 ――照光对照管的吸光值 ――样品管的吸光值 ――样液总体积（ml） ――测定时样品用量（ml） ――样品鲜重（g） _1234567893.unknown _1234567895.unknown _1234567897.unknown _1234567898.unknown _1234567896.unknown _1234567894.unknown _1234567891.unknown _1234567892.unknown _1234567890.unknown