白色念珠菌拮抗菌株的筛选

文章编号: 10052376X( 2004) 0620327202 =论 著> 白色念珠菌拮抗菌株的筛选 孙慎侠1,曲晓娟1, 伦永志1,付昌斌2 ( 1.大连大学医学院,辽宁 大连 116622; 2.辽宁出入境检验检疫局,辽宁 大连 116001) =摘要> 目的 筛选对白色念珠菌具有明显拮抗作用的菌株。方法 通过纸片琼脂扩散法( K2B法)观察各 菌株对白色念珠菌的拮抗作用;再利用试管法观察有拮抗作用菌株对白色念珠菌的抑菌效果。结果 K2B法明 大肠埃希菌、甲型链球菌和卡他球菌对白色念珠菌无抑菌作用,表皮葡萄球菌、微球菌有抑菌作用,但抑菌环小;枯 草杆菌有明显抑菌作用。试管法表明表皮葡萄球菌和枯草杆菌对白色念珠菌均有生物拮抗作用, 其抑菌率分别为 97%和 8917%。结论 枯草杆菌是白色念珠菌的理想拮抗菌株。 =关键词> 白色念珠菌;拮抗菌; K2B法;试管法 =中图分类号>R37914 =文献标识码>A Selection of the antagonistic bacteria on Candida albicans SUN Shen2xia, QU Xiao2juan, LUN Yong2zhi, et al1 ( Medical College of Dalian University , Dalian 116622, China ) =Abstra ct> Objective To Selecte the antagonistic bacteria on Candida a lbicans Methods The K2B method was used to observe t he antagonistic function of t he Eschier i coli、Staphylococcus epidermidis, Bacillu ssubtilis, Bacillus na t2 to, Proteus sp. Micrococcus sp. Moraxella catar rhalis, S tr eptococcus epidermidis on Candida a lbicans; The inhibitory effect on Candida albicans was observed t hough test2tube diluting way. Results T he results of the K2B method were Ei coli、S. sp. and Moraxellac a tar rhalis had no inhibitory effect on Candida albicans. Staphylococcus epidermids, P roteus sp. , Micrococcus sp . and Bacillu ssubtilis had t hat effect. The results of the test2tube methods were Staphylococcus epi2 dermids clearly inhibits Candida albicans from growing. and this effect was more evident than Bacillu ssubtilis and Mi2 crocoecus. T he suppress the germ rates were Staphylococcus epidermids 97% , Bacillu ssubtil 891 7%1Conclusions T he Candida albicans was t he strongest antagonistic bacteria among tested bacteria. =Key words> Candida albicans; Antagonistic bacteria; K2B method; T est2tube diluting 白色念珠菌是真菌中最常见的致病菌,据资料报 道 25% ~ 50%的健康人中, 其口腔、消化道及阴道内 都有白色念珠菌的存在, 通常情况下并不发病, 但当 宿主防御机能降低时成为致病性菌。体外研究表明, 人体内的正常菌群菌株对白色念珠菌有抑制作用,某 些专性厌氧菌可抑制白色念珠菌对黏膜的粘附和增 殖。其主要为微环境中营养竞争、对上皮细胞粘 附的竞争或产生拮抗物质抑制其生长。该研究通过 筛选对白色念珠菌有生物拮抗作用的正常菌群菌株, 为进一步研究阻断白色念珠菌粘附上皮细胞和生长, 以及治疗白色念珠菌感染开辟一条新途径。 1 材料与方法 111 菌种 白色念珠菌( Cabdyda akbucabs)、大肠 埃希菌( Eschieri coli )、表皮葡萄球菌( Staphylococcus epidermidis)、枯草杆菌( Bacil lu ssubt ilis)、纳豆杆菌 (Bacil lus na tto)、变形杆菌( Proteus sp . )、微球( Mi2 cr ococcus sp . )、卡他球菌(Moraxella catarr hal is)和甲 型链球菌( Str eptococcu ssp . ) , 均为大连大学医学院 实验室保存菌种。 112 培养基[ 1] 普通琼脂培养基、营养肉汤培养 =收稿日期>200207221 =基金项目>辽宁省教育厅高校科研课( No: 2023901016) =作者简介>孙慎侠( 19682) ,女, 硕士,从事医学微生物学;曲晓娟,通 讯作者, E2mail: qxj1028@1261 com 基、血平板、牛乳培养基和沙保罗( Sabouraud) (沙氏) 培养基,常规方法配制。 113 方法 11311 纸片扩散法观察拮抗作用 采用纸片扩散 法[2]观察大肠埃希菌、表皮葡萄球菌、枯草杆菌、纳 豆杆菌、变形杆菌、微球菌、卡他球菌和甲链球菌对白 色念珠菌抑制作用,每个处理重复 5次,置 37 e 恒温 箱中培养 24 h, 观察结果, 测量有拮抗作用的菌种的 抑菌环直径。 11312 试管法观察拮抗作用 选择拮抗效果较好的 菌种分别接种在肉汤管中, 取 24 h 培养物一环接种 于 2 ml的肉汤管中,再各取一环白色念珠菌 24 h 培 养物接种于上述培养基中, 以白色念珠菌为对照, 每 个处理重复3次,置37 e 恒温箱中培养24 h, 观察结 果。 11313 活菌计数 摇匀 11312 步中肉汤管, 用无菌 生理盐水按 10 倍稀释法, 分别将其稀释成 1024倍稀 释液, 各取 012 ml稀释液接种于平板培养基中(白色 念珠菌用沙氏培养基, 变形杆菌用石炭酸培养基, 其 他细菌用普通营养培养基)重复 2次, 置 37 e 恒温箱 中进行培养。24 h 后菌落计数,革兰染色确认。以 白色念珠菌单独培养为 CK, 以拮抗菌与白色念珠菌 共同培养为 T ,抑菌率计算公式如下: 抑菌率( % )= CK白- TCK白 @100% 327中国微生态学杂志 2004年 12月第 16卷第 6期 11314 统计学处理 数据统计采用秩和统计法进行 检验。 2 结果 表 1 不同拮抗菌对白色念珠菌 的拮抗作用表(抑菌环直径: cm) 拮抗菌 平均直径( x ? s) T白念/枯草 1170? 0110 T白念/微球 0171? 0111 T白念/表葡 0170? 0114 211 K2B法抑菌 大肠埃希菌、甲链球菌、卡他球菌 和纳豆杆菌对白色念球菌均无抑菌作用;表皮葡萄球 菌对白色念珠菌有抑菌作用, 但抑菌环小且不明显, 其周围白色念珠菌落非常小;微球菌有抑菌作用, 但 抑菌环不明显;变形杆菌无抑菌环, 但整个培养皿中, 变形杆菌呈扩散生长;枯草杆菌抑菌环非常明显。结 果见表 1。 212 试管法拮抗作用观察 菌落数= 每 011 ml稀 释液的菌落数@稀释倍数@10, 在 011 ml稀释液中 没有白色念珠菌生长的按其菌落数为 1 @104 计算。 将结果取 log后见表 2。 结果表明表皮葡萄球菌对白色念珠菌的抑制作 用非常显著,枯草杆菌有明显的抑制作用。 3 讨论 近年来,随着广谱抗生素、激素与免疫抑制剂的 表 2 拮抗菌与白色念珠菌共同培养白色念珠菌与对照的菌落数及统计结果表 细菌 CK白色 T白色/枯草 T白色/微球 T白色/表葡 平均值( lgx ? s) 71 146? 01249 51697 ? 01 678 61 185? 01 122 41 859? 11020 各组秩和 129 61* 79 31* 抑菌率(% ) - 891 7 - 97 注: * P > 0105, * * P> 0101 普遍应用,以及肿瘤病人的放疗、化疗和其他获得性免 疫功能低下的患者(如艾滋病等)逐渐增多,而使内脏、 皮肤和黏膜被真菌感染者日益增多。据美国疾病控制 和预防中心的, 在所有院内感染的常见病因中,念 珠菌感染已从 20世纪 80年代的第 7位, 上升为目前 的第 6位。目前念珠菌病的主要治疗方法是使用抗真 菌药物,但副作用大,易产生耐药性, 给念珠菌病的防 治工作带来很大困难。因此许多学者正在致力于通过 生物拮抗作用来抑制白色念珠菌感染[ 2, 6]。该实验体 外抑菌试验结果表明表皮葡萄球菌、微球菌、变球杆菌 和枯草杆菌对其有一定的抑制作用。 微生物之间的拮抗作用可通过营养竞争[ 3, 4] , 共 栖菌在一定的条件下大量繁殖, 从而与白色念珠菌争 夺营养,抑制其生长繁殖。该实验表明: 表皮葡萄球 菌、微球菌和变形杆菌可能主要是通过营养竞争来抑 制白色念珠菌的生长。另外乳酸杆菌[3]、枯草杆菌[5] 可能主要通过产生代谢产物抑制白色念珠菌的生长。 另外,变形杆菌在普通平板中呈扩散生长,在液体 培养基中,将培养物稀释至 1024倍后培养,无白色念珠 菌生长,而变形杆菌菌落数均大于 1 @108/ ml, 这可能 是与由于变形杆菌生物学特性有关。 该研究通过纸片法发现枯草杆菌对白色念珠菌有 明显的抑制作用, 而在试管法测定其抑菌作用时,抑菌 作用没有表皮葡萄球菌大, 这可能由于枯草杆菌是一 种需氧菌,在试管中生长时只能形成菌膜,从而降低了 产生抗菌物质的能力所致。 枯草杆菌属于芽胞杆菌属, 在日本可作为纳豆的 发酵菌生产纳豆。目前研究发现纳豆中有一种纳豆激 酶具有降血压、抗肿瘤、抗氧化性和溶血栓等作用, 因 此在日本纳豆已成为一种保健食品而备受欢迎[5]。 另外纳豆芽胞杆菌可产生一种抗菌蛋白[ 6] , 对多种致 病菌具有明显的抑菌作用。因此我们认为枯草杆菌是 一个具有开发前景的菌种。 =参考文献> [ 1]张卓然 1 医学微生物实验学[ M]1 北京:科学出版社, 19981 [ 2]孙慎侠,王海凤,齐珊珊 1 壳聚糖及其单体体外抑菌作用的实验研 究[ J]1 大连大学学报, 2004, 25( 2) : 972981 [ 3]伦永志,王昭妍,田延东,等 1 干酷样乳杆菌( 体外)对腹泻病原菌生 物拮抗作用[ J]1 大连大学学报, 2001, 22( 6) : 692711 [ 4]方鹤松 1 小儿腹泻病的微生态疗法[ J] 1 小儿急救学, 1998, 5 ( 2) : 622651 [ 5]邵伟,熊泽,黎姝华,等 1纳豆口味改进初探[ J]1 中国调味品, 1999, 9: 172181 [ 6]钟青萍,王斌 1 纳豆菌抗菌蛋白在食品防腐中的应用[ J] 1 中国食品 添加剂, 2003, ( 3) : 662691 328 Chinese Journal of Microecology, December 2004, Vol116 No16