实时多聚酶链式反应验证人类原发性膝关节骨性关节炎病变软骨基因表达的变化_董宪传

第 30 卷 第 12 期 2 0 1 2年 1 2 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 30 No． 12 Dec． 2 0 1 2 中 华 中 医 药 2689 学 刊 实时多聚酶链式反应验证人类原发性膝关节 骨性关节炎病变软骨基因表达的变化 董宪传，杨永菊，候德才，关雪峰 (辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032) 摘 要:目的:以关节软骨为研究对象，通过全基因组基因谱的表达，从上调 3 倍以上和下调 3 倍以上差异表 达基因中任意选定 10 个基因进行复孔的 PCR实时定量，验证所获得的差异基因在原发性 KOA病理过程中 的意义。:对 12 例原发性膝关节骨性关节炎病变软骨与 4 例正常膝关节软骨分别进行实时多聚酶链式 反应。结论:通过 3 次重复试验，差异表达基因中任意选定的 10 个基因，经统计学处理，t 检验，P ＜ 0． 001。有显 著性差异，证明膝关节软骨中的差异表达基因在原发性膝关节骨性关节炎发生过程中的关键作用。 关键词:原发性膝关节骨性关节炎;PCR;关节软骨;基因表达 中图分类号:R681． 8 文献标识码:B 文章编号:1673 － 7717(2012)12 － 2689 － 02 Real － Time Polymerase Chain Reaction Proving the Gene Expressions of Cartilage Lesions of Human Primary Knee Osteoarthritis DONG Xian-chuan，YANG Yong-ju，HOU De-cai，DENG Xiao-lei，GUAN Xue-feng (Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，Liaoning，China) Abstract:Objective:In this study，the articular cartilage was as the research object，through the expressions of whole genome genetic spectrum，among up － regulating more than 3 times and down － regulating more than 3 times arbitrary dif- ferentially expressed genes，there were 10 genes selected to get real － time quantitative detection of PCR hole，and the differences in the genes obtained in the process of primary KOA were used to prove the pathological significance． Meth- ods:12 cases of primary knee osteoarthritis cartilage and four normal knee cartilage samples，were given real － time poly- merase chain reaction respectively． Conclusion:Through the three times repeated experiments，differences in the selected 10 genes had significant difference，P ＜ 0． 001． It is proved that the knee joint cartilage differentially expressed genes are the key in primary knee osteoarthritis process． Key words:primary knee osteoarthritis;PCR;articular cartilage;gene expression 收稿日期:2012 － 07 － 21 基金项目:辽宁省博士科研启动基金资助项目(20102066) 作者简介:董宪传(1962 －) ，男，吉林白城人，副主任医师，研究方 向:中西医结合骨伤。 通讯作者:关雪峰(1972 －) ，男，辽宁辽阳人，副主任医师，硕士研 究生导师，博士研究生，研究方向:中西医结合骨伤治疗 骨性关节炎等疾病。E-mail:lnzygxf@ 163． com。 骨性关节炎已成为世界性的疾病，是一种随年龄增长 而发病率逐渐增高的一种退行性关节疾病，是老年人关节 疼痛和致残的主要原因。人类原发性膝关节骨性关节炎 (KOA)是指用目前所有的检查方法查不出病因的骨关节 炎，主要侵害关节软骨和滑膜组织，导致关节疼痛、畸形和功 能障碍，从而影响患者的活动能力。造成骨关节炎的最可能 原因是合成软骨成分的异常，如胶原和粘蛋白的异常。另 外，软骨虽然生长旺盛，但是很薄，其表面很容易发生破裂。 在 KOA的早期并不能通过放射线检查发现关节软骨 的变化，因为在放射线检查能够发现软骨有改变之前，软骨 已经在分子代谢和超微结构上发生了非常显著的变化。 实时定量 PCR 检测技术融合了 PCR 高灵敏度，DNA 杂交高特异性和光谱技术的高精确定量等优点，直接检测 PCR过程中荧光信号的变化以获得定量的结果，不需要 PCR后处理或电泳检测，完全闭合操作，克服了常规 PCR 技术的诸多弊端，方法准确、快速，有很好的应用前景和技 术优势。目前在检测骨关节炎相关蛋白的基因变化中得到 了广泛的应用［1 － 2］。本项研究以关节软骨为研究对象，目 的在于通过全基因组基因谱的表达，研究与本病相关的全 部差异表达基因，对部分差异基因进行复孔的实时定量 PCR检测，进一步验证所获得的差异基因在原发性 KOA病 理过程中的意义。 1 材料和方法 1． 1 设计 随机对照实验。 1． 2 时间及地点 于 2011 年 7 月 － 2012 年 6 月在辽宁中医大学药附属 医院骨科完成。 1． 3 材料 1． 3． 1 膝关节骨性关节炎病变软骨采集与分组 12 例原 发性膝关节骨性关节炎病变软骨，分别取材于原发性膝关 节骨性关节炎关节镜手术 8 例，膝关节置换术 4 例。男 4 例，女 8 例，年龄:62 ～ 78 岁。根据 Kellgren 和 Laurence 放 射学分级(0 ～ 4 级)对原发性 KOA患者进行分组:0 ～ 2级为轻度疾病组(4 人，R2 组，即 R2 － 1;R2 － 2;R2 － 3; R2 － 4) ;3 级为中度疾病组(4 人，R3 组，即 R3 － 1;R3 － 2; 9862 第 30 卷 第 12 期 2 0 1 2年 1 2 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 30 No． 12 Dec． 2 0 1 2 中 华 中 医 药 2690 学 刊 R3 － 3;R3 － 4) ;4 级为重度疾病组(4 人，R4 组，即 R4 － 1; R4 － 2;R4 － 3;R4 － 4)。软骨组织 50mg，迅速装入冷冻管， 并将其立即(30s 内)放入干冰中(－ 80℃) ，快速运抵 － 80℃恒温冰箱内保存备用。 1． 3． 2 正常膝关节软骨采集 正常膝关节软骨标本 4 例， 男 3 例，女 1 例，年龄 18 ～ 28 岁。均取材于膝关节严重开 放伤清创术中。其中胫骨髁间嵴粉碎性骨折 1 例;开放性 粉碎性骨折 1 例，膝关节开放性粉碎性骨折 2 例。每例同 样切取 50 mg，迅速装入冷冻管，并将其立即(30s 内)放入 干冰中(－ 80℃) ，快速运抵 － 80℃恒温冰箱内保存备用， 做为健康组(RB1) ，即 RB1 － 1;RB1 － 2;RB1 － 3;RB1 － 4。 1． 3． 3 主要试剂与仪器 TRIzol 试剂(Invitrogen 公司生 命技术) ，RNasey微量试剂盒(Qiagen 公司 p /n74104) ，快速 安培标记试剂盒，无 RNA 酶的糖原(Invitrogen life technolo- gies)、Gold View 染料(上海赛百胜基因技术有限公司) ， RNA酶抑制剂(Epicentre) ，10 × PCR缓冲液(Promega)。 1． 4 实验方法 1． 4． 1 实时多聚酶链式反应 对上述 16 例软骨样本分别 进行实时多聚酶链式反应。具体实验步骤包括: (1)样品 的 RNA抽提:①匀浆、②两相分离、③RNA沉淀、④RNA清 洗、⑤重新溶解 RNA 沉淀、⑥小量 RNA 的抽提; (2)RNA 质量检测:①紫外吸收测定法、②变性琼脂糖凝胶电泳; (3)使用样品的 RNA进行 cDNA合成:①配制退火混合物、 ②短暂离心后，③在离心管中依次加入 RT 反应液、④移液 枪轻轻吸打几次混合均匀;(4)合成的 cDNA用于实时定量 PCR:①制备用于绘制标准曲线的梯度稀释 DNA 模板、② 进行 Realtime PCR反应;(5)实时定量 PCR 使用引物的列 表;(6)梯度稀释的标准品及待测样品的待测基因实时定 量 PCR结果;(7)梯度稀释的标准品及待测样品的管家基 因(内参)实时定量 PCR结果;(8)各样品目的基因量以内 参校正的计算结果。 1． 4． 2 主要观察指标 10 个上调 3 倍以上和下调 3 倍以 上差异表达基因进行复孔的 PCR 实时定量检测，并通过 3 次重复试验，验证实验结果的一致性。 1． 4． 3 设计、实施、评估者 实验设计、干预实施及结果评 估为全部作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。 1． 4． 4 统计学分析 数据以 珋x ± s 表示，多个样本均数间 的比较采用单因素方差分析，P ＜ 0． 05 为有统计学意义。 全部数据均输入 Excel工作表中，用 SPSS 15． 0 统计软件分 析处理。 2 结 果 根据科学实验结果可以重现的原则，我们从课题组通 过基因芯片技术，鉴定出的具有差异表达的基因中，在上调 3 倍以上和下调 3 倍以上差异表达基因中任意选定 10 个 基因进行复孔的 PCR 实时定量检测，通过 3 次重复试验， 验证了实验结果的一致性，经统计学处理，t 检验，P ＜ 0． 001，有显著性差异，上调 3 倍以上的差异基因包括:参加 软骨分解代谢的基因及具有免疫功能的基因。下调 3 倍以 上的差异基因包括:参与软骨合成代谢的基因及具有信息 传递功能的基因。进一步证明:膝关节软骨中的差异表达 基因在原发性膝关节骨性关节炎发生过程中的关键作用。 其次，病变组组间比较:R2 与 R3，R3 与 R4，R2 与 R4 比较发现，3 倍以上差异基因在骨性关节炎病变过程中，在 病变组间的表达无明显差异(P ＜ 0． 001) ，说明与疾病病变 程度无关，见表 1。 表 1 PCR t检验结果 项目 P值 R2 /RB1 R3 /RB1 R4 /RB1 AHSG(下调) 2． 59E － 5 5． 00E － 5 8． 57E － 9 ＜ 0． 001 ALB(下调) 4． 96E － 5 1． 02E － 4 2． 15E － 5 ＜ 0． 001 CD24(上调) 2． 18E － 3 1． 01E － 2 3． 71E － 4 ＜ 0． 001 CGKC(上调) 1． 01E － 4 6． 22E － 9 1． 11E － 6 ＜ 0． 001 IGSF11(上调) 1． 75E － 5 3． 84E － 4 5． 44E － 6 ＜ 0． 001 MMP9(上调) 6． 70E － 7 1． 04E － 5 1． 21E － 5 ＜ 0． 001 PLCB(下调) 1． 62E － 6 3． 90E － 6 1． 28E － 6 ＜ 0． 001 TNFSF11(上调) 3． 96E － 5 4． 94E － 6 2． 73E － 4 ＜ 0． 001 TSP5(上调) 8． 60E － 9 6． 18E － 7 1． 72E － 2 ＜ 0． 001 TTR(下调) 1． 34E － 4 6． 51E － 8 6． 15E － 8 ＜ 0． 001 GAPDH(管家) 1． 00E + 00 1． 00E + 00 1． 00E + 00 3 分析讨论 随着社会人口老龄化，骨性关节炎(OA)对人类健康的 影响以及医疗社会负担的增加，已引起人们的关注。WHO 将 2000 － 2010 年作为“骨与关节十年”以引起人们对骨关 节疾病的重视，我国卫生部也起草了相关的指南，以利于规 范治疗［3］。OA主要侵害关节软骨、骨和滑膜组织，导致关 节疼痛、畸形和功能障碍，从而影响患者的活动能力。流行 病学调查显示，国内该病的发病率为 5%，而 60 岁以上者更 是高达 15% ～20%。在原发性 KOA的临床研究和实验研究 中作出了很多努力，研究表明关节滑膜和关节软骨在原发性 OA发病中起主导作用，OA 时软骨细胞合成代谢和分解代 谢的失衡，导致了软骨细胞外基质成分的进行性丢失和软骨 细胞结构和功能的破坏，而这些反应主要是病变的滑膜和软 骨释放的一些炎性因子造成的［4 －5］。从细胞层次上讲，关节 软骨的退变可能是由于软骨细胞表型不稳定而形成的各种 细胞反应模式的结果，这些形式包括细胞去分化释放基质降 解酶、细胞肥大和细胞凋亡等［6］。但是其发病仍然不十 分明了，目前多采取手术和对症治疗为主。本项研究发现了 原发性膝关节骨性关节炎病变软骨中的上调和下降差异表 达基因的种类，为基因学治疗本病提供理论基础和数据。 参考文献 ［1］ Davidson RK，Waters JG． ExPression Profiling of metalloProtein- ases and their inhibitors in synovium and eartilage［J］． Arthritis- ResTher，2006，8(4) :R124． ［2］ 元建洪，赵庆华，刘延菊，等．白细胞介素 － lβ 对人软骨细胞 基质金属蛋白酶 － 13mRNA 表达的作用［J］． 中华风湿病学 杂志，2005，9(3) :138 － 141． ［3］ 中华医学会骨科分会．骨关节炎诊治指南(2007 年版) ［S］． 中华骨科杂志，2007，27(10) :793 － 796． ［4］ Goldring SR，Goldring MB． The role of eytokines in eartilage ma- trix degeneration in osteoarthritis［J］． Clin Orthop RelatRes， 2004，(427 Suppl) :527 － 536． ［5］ MassieotteF，FernandesJC，Martel － PelletierJ，et al． Modulation of insulin － like growth faetor 1 levels in human osteoarthritic Sube- hondral bone osteoblasts［J］． Bone，2006，38(3) :333 － 341． ［6］ 任志伟，俞永林，姜建元．骨关节炎相关性细胞因子研究进展 ［J］．国外医学·骨科学分册，2005，26(4) :234 － 237． 0962