双试剂直接分光光度法测定血清总铁结合力

作者单位: 637000 四川南充,川北医学院附属医院检验科 # 论著# 双试剂直接分光光度法测定血清总铁 结合力 蒋兴亮 唐中 【摘要】 目的 建立一种灵敏度高、选择性好的铬天青 B 血清总铁结合力的直接测定法。方法 在 pH4. 5 的条件下,结合铁从转铁蛋白释放,铬天青 B 与血清中的铁和过量的铁标准液发生显色反 应,再加入碱性缓冲液, 在 pH 7. 8 的条件下,转铁蛋白从铁和铬天青 B 复合物中吸引铁与其结合, 溶 液的吸光度值下降与血清总铁结合力浓度呈正比。对反应条件和方法性能进行系统研究。结果 显 色络合物的最大吸收波长为 630nm, 线性可达 130. 0Lmo l/ L, 回收率为 98. 3% ~ 99. 2% , 批内变异系 数为 2. 7% , 批间变异系数为 3. 8% , 与碳酸镁作吸附剂的手工比色法比较有良好相关性, 回归方程为 Y = 0. 994 X+ 0. 40, r = 0. 993。70例健康成人血清总铁结合力含量为 51. 3~ 76. 3Lmo l/ L。结论 该法试剂稳定,具有操作快速、灵敏、简便和结果准确等优点,适宜于血清总铁结合力的手工测定和自 动化。 【关键词】 铁; 分光光度法; 指示剂和试剂 Double-reagent direct spectrophotometric method for determination of total iron-binding capacity in serum J IA NG X ing-liang, T AN G Zhong. Depar tment of Clinical L aborator y , A f f iliated H osp ital of Nor th Sichuan Medical College, N anchong 637000, China 【Abstract】 Objective To establish a high- sensitivy and good- selectiv ity method f or the dir ect determinat ion of total ir on-binding capacit y in serum by spect rophotometry w ith chrome azuro l B. Methods T he serum iron w as released f rom t ransfer rin at pH4. 5. Both the serum ir on and an excess amount of iron of calibr ation reacted with chromae zur ol B. T hen buffer solution w as added, t he affin-i t y of t ransfer rin fo r ir on incr eased dramatically, and transferr in ex tr act the ir on f rom the ir on- chrome azuro l B complex, decr easing the absorbance. The decrease in abso rbance w as dir ectly propo rtional to total ir on-binding capacity. The sy stematic studies of r eaction conditions and properties of the method were made. Results T he max imum absorption w ave of the complex compound w as at 630nm. The lin- ear ity of assa y w as up to 130. 0Lmol/ L . The rate of r ecovery ranged f rom 98. 3% to 99. 2% . The within- run and run to run imprecision ( CV ) o f the assay w as 2. 7% and 3. 8% , respectively. Com pa- r ing this method ( Y ) wit h manual method using magnesium carbonate as absorbent( X) , show ed t hat, Y = 0. 994 X+ 0. 40 , r= 0. 993, P> 0. 05. The reference r ange o f seum T IBC( ? 1. 96s) was 51. 3- 76. 3Lmo l/ L ( 70 cases) . Conclusion The method w as stable, simple, sensitive, rapid and accurate, and suitable for the r outine manul and aut omatic analy sis of to tal iron-binding capacity in serum. 【Key words】 Ir on; Spect rophotomet ry; Zndicato rs and reagents 血清总铁结合力的测定对临床多种疾病的辅助 诊断具有重要意义。测定血清总铁结合力( to tal iron- binding capacity, TIBC)的方法 [ 1]较多,但均需用不同 的吸附剂对与饱和血清转铁蛋白反应后的多余铁进 行吸附、离心预处理, 操作步骤烦琐, 灵敏度低, 标本 用量大,影响因素多, 耗时, 不适宜于自动化分析, 其 在临床上的推广使用受到限制。本研究参考文献 [ 2] , 根据转铁蛋白在不同的 pH 条件下对铁的结合 力完全不同, 采用改变反应体系中的 pH 值, 在酸性 条件下,铁与转铁蛋白的亲和力降低, 转铁蛋白释放 结合的铁,与显色剂铬天青 B显色使吸光度增加,而 在碱性条件下, 铁与转铁蛋白的亲和力增加, 转铁蛋 白从显色络合物中争夺铁, 转铁蛋白与铁结合达到饱 和,使反应体系吸光度下降。用本法测定血清总铁结 合力,不需吸附和离心去除多余的铁, 具有标本用量 少、结果准确、灵敏度高、准确度好、操作简便快速、试 剂简单等优点,适宜于手工和自动化分析。 材料与方法 1.原理:在 pH4. 5条件下, 血清铁从转铁蛋白中 释放,铬天青 B与血清中的铁和能够饱和大量转铁蛋 白的铁标准液中的铁络合, 显色络合物在波长 630nm #7#国际检验医学杂志 2006年 1月第 27卷第 1期 Int J Lab Med, January 2006,Vol. 27,No. 1 处有最大吸收峰, 于 630nm 处读取溶液的吸光度值。 再加入 pH8. 5的碱性缓冲液使溶液的 pH 为 7. 8,转 铁蛋白对铁的亲和力急剧增加,从铁和铬天青 B 复合 物中吸引铁与其结合,使溶液的吸光度值下降。在一 定范围内总铁结合力浓度与下降的吸光度呈正比。 2.仪器: 日立 7170S 自动生化分析仪、岛津 CL- 770型半自动生化分析仪、pH 测量计、721 型分光光 度计。 3.试剂: ( 1)试剂 1: pH4. 5; 0. 2mo l/ L 的醋酸盐 缓冲液中含 160Lmol/ L 铬天青 B; 1. 0mmo l/ L 溴化 十六烷基三甲胺; 5. 0mmol/ L 硫脲; 16Lmol/ L 三氯化 铁(六水 ) ; 5. 0g/ L Bri-j 35; 5. 0m l/ L Tr iton X-100。 ( 2)试剂 2: pH8. 5、0. 2mol/ L 的 T ris 缓冲液中含 300mmol/ L 碳酸氢钠。( 3)铁标准液: 17. 9Lmo l/ L, 按常规法配制[ 1] 。( 4)总铁结合力血清标准液: 64. 4 Lmol/ L。 4.操作方法: ( 1)手工分析法: 测定管、标准管、空 白管分别加入血清、T IBC 标准液、蒸馏水各 15Ll, 每 管加 200Ll试剂 1, 混匀后, 37 e 放置 5m in, 每管加 50Ll试剂 2, 立即在 630 nm 波长处用空白管调零,读 取各管吸光度 A1。5min时, 再以空白管调零,读取各 管吸光度为 A2。TIBC(Lmol/ L ) = [测定( A1- A2) / 标准( A1- A2) ] @ 64. 4。( 2)自动分析法参数:反应 类型为终点法, 波长 630nm / 700nm (主/副波长) , 反 应温度 37 e , 血清 15Ll,加 200Ll试剂 1, 混匀, 第 17 测光点时加入 50Ll 试剂 2, 混匀, 立即吸光度 A1,接着检测第 30 测光点吸光度 A2, vA = A1- A2,与标准比较,计算出血清中总铁结合力浓度。 结 果 1.吸收曲线: 按本法对标准管和测定管进行显 色,在紫外可见分光光度计上扫描。在 pH4. 5和 7. 8 的显色反应条件下, 以蒸馏水作参照, 试剂空白的最 大吸收波长为 550 nm (图 1) ; 以试剂空白作参照, 标 准管、测定管两者络合物最大吸收波长均为 630nm (图 2)。 图 1 空白试剂的吸收曲线 2. pH 和缓冲体系对显色反应的影响和选择: 固 定其他成分, 将试剂 1 配制成不同 pH、0. 2mol/ L 醋 酸盐缓冲溶液,当 pH 为 4. 5时,溶液的吸光度最大, 空白值较低,故选择试剂 1的 pH 为 4. 5。同样, 当试 剂 2的 pH 为8. 5时,可使反应体系的吸光度最低,故 选择试剂 2的 pH 为 8. 5。 图 2 铬天青B-铁的吸收光谱 以 0. 2mol/ L 柠檬酸盐、0. 2mol/ L 醋酸盐、0. 2 mo l/ L 二甲基谷氨酸盐、pH4. 5 作为试剂 1 的缓冲 液,分别配制试剂进行比较, 其显色反应灵敏度依次 为醋酸盐、柠檬酸盐、二甲基谷氨酸盐, 故选择醋酸盐 较适宜。同样, 以 0. 2mol/ L Tris、0. 2mo l/ L 巴比妥 盐、0. 2mol/ L 硼砂盐、0. 2mo l/ L AMP 缓冲系统、 pH8. 5作为试剂 2 的缓冲液, 分别配制试剂进行比 较,其显色反应灵敏度依次为 T ris、巴比妥盐、硼砂 盐、AMP,故选择醋酸盐较适宜。 3.铬天青 B浓度的选择:铬天青 B浓度与应用试 剂的吸光度呈正比,显色灵敏度随铬天青 B浓度的增 加而上升,浓度增至 160Lmol/ L 时,灵敏度不再增加, 试剂空白增加, 故选择应用试剂的铬天青 B 浓度为 160Lmol/ L。 4.回收试验:在已知总铁结合力为 50. 25Lmol/ L 的混合血清中加入 11. 10、22. 20、33. 30、44. 40L mo l/ L的铁标准液作回收试验, 所测定的回收率分别 为 98. 8%、99. 2%、98. 5%、98. 3% , 平均回收率为 98. 7%。 5.线性范围:将已测得总铁结合力 130. 0 Lmol/ L 的血清样本用生理盐水作梯度稀释, 使含血清 1/ 5、 2/ 5、3/ 5、4/ 5 及原血清。其理论浓度分别为 26. 0、 52. 0、78. 0、104. 0、130. 0Lmol/ L。用本法从低到高, 然后从高到低测定, 将测定值( Y)与理论值( X)进行 线性回归分析,回归方程为 Y = 0. 991X+ 0. 031, r = 0. 999 0,表明线性可达 130. 0Lmol/ L(图 3)。 6.精密度:取高、中、低值血清各 1 份, 用本法连 续测定 20次, 测得血清总铁结合力的平均值分别为 20. 56、77. 23和 122. 30Lmol/ L , 标准差分别为 0. 74、 2. 21、3. 06 Lmo l/ L , 批内 CV 分别为 3. 6%、3. 0%、 2. 5% ,平均 2. 7%。同样血清标本, 每天上下午各测 定 1次,共 10d, 测得血清总铁结合力的平均值分别为 20. 59、77. 38、122. 20Lmo l/ L, 标准差分别为 0. 84、 2. 83、4. 28Lmol/ L , 批间 CV 分别为 4. 1%、3. 8%、 #8# 国际检验医学杂志 2006年 1月第 27卷第 1期 Int J Lab Med, January 2006, Vol. 27, No. 1 3. 54%,平均 3. 8%。 图 3 本法的标准曲线 7.方法对比:选择总铁结合力含量不同的血清标 本52份(总铁结合力 9. 21~ 120. 32 Lmo l/ L ) ,用本法 ( Y)和碳酸镁作吸附剂的手工法( X)同时测定。本法 测定值为( 60. 31 ? 12. 46) Lmo l/ L , 手工法测定值为 ( 60. 49 ? 12. 64)Lmol/ L , 回归方程为 Y = 0. 994 X + 0. 40, r = 0. 993, 表明两法结果相关性良好。配对 t检验: t = 1. 223 < t 0. 05= 2. 000, P> 0. 05, 二者差 异无统计学意义(见图 4)。 图 4 本法与碳酸镁吸附法的比较 8.干扰试验: 1份样品中分别加入不同量的胆红 素、血红蛋白、脂肪乳剂( Int ralipid, 瑞典 Pharmacia 产品)、Mg2+ 、Zn2+ 、Cu2+ 、Ca2+ ,用本法测定, 结果表 明, 胆红素< 425 Lmo l/ L、血红蛋白< 10g / L、T G< 13. 5 mmol/ L、Mg2+ < 8. 0mmol/ L、Zn2+ < 50. 0 Lmol/ L、Cu2+ < 0. 5 mmol/ L、Ca2+ < 10. 0mmol/ L 时 对测定无明显影响。 9.试剂及呈色稳定性:试剂 1密封放置于室温可 稳定 3个月,而未密封的试剂 1放置 2周后吸光度开 始下降, 测定结果偏低。络合显色反应 3 min 内完 成,呈色稳定不变达 10h以上。 10.参考范围:测定 70例健康成人血清总铁结合 力(男 38例, 女 32 例, 年龄 18~ 59岁)含量, 结果为 ( 61. 2 ? 7. 22)Lmol/ L ,参考范围 51. 3~ 76. 3 Lmo l/ L ( ? 1. 96s)。 讨 论 目前采用的测定血清总铁结合力的方法中需用 碳酸镁粉末、铁交换树脂、氧化铝柱或磁珠等吸附剂 吸附多余未结合的铁, 离心去除吸附剂后再显色测 定。近几年来,先后有几类血清总铁结合力的直接测 定法 [ 3, 4] ,但多数需要两种以上的试剂, 只适宜于特定 的自动生化分析仪, 不能在一般生化分析仪上应用, 因而其应用受到限制。本研究参考文献[ 2] , 根据转 铁蛋白在不同的 pH 条件下对铁的结合能力完全不 同的特点, 采用改变反应体系中的 pH 值, 在酸性条 件下,铁与转铁蛋白的亲和力降低, 转铁蛋白释放结 合铁,与显色剂显色使吸光度增加, 而在碱性条件下, 铁与转铁蛋白的亲和力增加, 转铁蛋白从显色络合物 中争夺铁,铁蛋白与铁结合达到饱和, 使反应体系吸 光度下降。本组系统研究了转铁蛋白对铁的解离与 结合体系和显色体系,研制开发了双试剂两点终点法 测定血清总铁结合力的自动化检测试剂。对测定的 条件进行了优化组合, 并系统地评价了方法的性能。 应用此试剂测定血清总铁结合力, 不需事前处理步 骤,适宜于手工和全自动分析。 用铬天青 B作总铁结合力测定的显色剂, 显色络 合物在 pH3. 0~ 9. 0范围内形成稳定的络合物, 吸光 度大,灵敏度高, 且铬天青 B 与 Fe2+ 和 Fe3+ 均能结 合,勿需将 Fe3+ 还原为 Fe2+ 后再显色测定。在本反 应体系中,涉及两种 pH。在酸性 pH 条件下, 铁从转 铁蛋白中释放的速度与反应体系的 pH 值有关, 测定 体系的 pH 越低,血清铁解离的速度越快,但 pH 太低 时,血清蛋白易发生沉淀使反应液混浊, 且铁与铬天 青 B的反应不完全, pH 过高时,铁离子离解不完全, 测定结果偏低,故本法选择试剂 1的 pH 为 4. 5, 既保 证铁的完全解离, 又保证蛋白不发生沉淀, 以及显色 完全。在碱性 pH 条件下, 转铁蛋白对铁的亲和力比 铬天青 B强, 因而转铁蛋白从显色络合物中争夺铁, 吸光度降到最低。试验表明, 反应体系的 pH7. 5~ 8. 3时, 吸光度降到最低, pH 再增加, 吸光度不再降 低。故选择试剂 2的 pH 为8. 5,加入一定量的试剂 2 后,反应体系的 pH 为 7. 8。同时对试剂 1 和试剂 2 的缓冲体系进行了优化选择。试验表明,试剂 1 分别 采用柠檬酸盐、醋酸盐、二甲基谷氨酸盐缓冲系统,发 现用醋酸缓冲体系时试剂空白值低, 测定灵敏度高, 试剂本身稳定性好, 故选择 pH4. 5的醋酸盐缓冲体 系。同样,试剂 2 分别采用 Tris、巴比妥盐、硼砂盐、 AMP 缓冲系统, 结果试剂 2加入后吸光度下降较快, 且稳定,故试剂 2选择 pH8. 5的 T ris缓冲体系。 表面活性剂的选择:铁与铬天青 B 形成的络合物 水溶性较差,加入适当的表面活性剂为不去蛋白直接 进行血清总铁结合力的测定提供了条件。本组试验 了溴化十六烷基三甲胺、溴化十六烷基吡啶、聚乙二 醇辛基苯基醚、十二烷基磺酸钠、Bri-j 35、T w een-20、 Tw een-80等表面活性剂,发现在 pH4. 5(下转第 11 页) #9#国际检验医学杂志 2006年 1月第 27卷第 1期 Int J Lab Med, January 2006,Vol. 27,No. 1 性率对比无统计学意义( P> 0. 05)。 表 1 正常对照组与肝癌组(包括原发性肝癌和转移性 肝癌)血清 CEA 含量( x ? s)阳性率比较 组别 n CEA 含量( Lg/ L) CEA 阳性数 阳性率( % ) 正常对照组 33 0. 99 ? 0. 79 2 6. 06 肝癌组 365 7. 52 ? 18. 04* 109 29. 86* 原发性肝癌 273 3. 87 ? 13. 44 49 17. 95 转移性肝癌 92 18. 36 ? 24. 55* * 60 65. 22* * 注:与正常对照组比较, * P < 0. 01;与原发性肝癌组比较, * * P < 0. 01。 表 2 各组转移性肝癌患者血清 CEA 含量、阳性率比较 组别 n CEA 含量( Lg/ L) CEA 阳性数 阳性率( % ) 肠癌肝转移 34 17. 67 ? 21. 1 22 64. 71 胃癌肝转移 32 13. 71 ? 13. 76 18 56. 25 乳腺癌肝转移 18 28. 88 ? 41. 63 8 44. 44 肺癌肝转移 6 27. 98 ? 20. 03 6 100 食道癌肝转移 2 19. 85 ? 24. 40 2 100 注:各组间比较, P > 0. 05。 讨 论 肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,在恶性肿瘤的 死亡排位中仅次于胃癌, 我国每年因患肝癌死亡的人 数占全世界肝癌死亡人数的 40% ,是一种严重威胁生 命健康的疾病 [ 3]。治疗肝癌的关键是早期诊断、早期 治疗的/二早0原则 [ 3] , 但肝癌有转移性和原发性之 分,治疗的方法也大相径庭。原发性小肝癌一般以手 术切除为主,而转移性肝癌必须先找出原发部位再制 定周密的治疗,因此在临床诊断上区别肝癌是原 发性还是转移性显得十分重要,而血清 CEA 的检测 是一种既简便、快捷又十分经济的手段。本组对 365 例肝癌患者 CEA进行分析发现,转移性肝癌 CEA 阳 性率( 65. 22% )、含量( 18. 36 ? 24. 55)Lg/ L ,均显著高 于原发性肝癌的阳性率 ( 17. 95%) 及含量 ( 3. 87 ? 13. 44)Lg / L ( P< 0. 01)。而在转移性肝癌组中,各组 间相比无统计学意义( P> 0. 05) ,但因部分分组病例 太少,尚需进一步积累资料。因此, 临床上检测 CEA 含量,对鉴别肝癌的类型(原发性或转移性)具有一定 的指导意义,值得推广。 参 考 文 献 1 H amm ars tr om S, Sh ively JE, Paxton RJ, et al. Ant igenic sites in carcinoembryonic ant igen. Cancer Res, 1989, 49( 17) : 4852-4858. 2 郝立强, 万勇. CEA 检测及临床应用的新进展. 国外医学外科学 分册, 1999, 26( 4) : 197-199. 3 彭承宏, 李松岗, 刘颖斌, 等. 肝癌研究现状. 肝胆外科杂志, 2001, 9( 5) : 386-388. (收稿日期: 2005-07-29) (上接第 9 页) 和 pH7. 8的反应体系中阳离子型和阴离子型表面活 性剂使反应体系出现不同程度的混浊,而非离子表面 活性剂能使反应体系保持清晰,起到增溶、增敏和增 稳的作用。通过试验, 以 Bri-j 35 和 Triton X-100 混 合表面活性剂效果最佳, 在反应体系中可防止蛋白质 的干扰,降低空白吸光度,增加反应的灵敏度。 本法测定使用的试剂组成简单, 性能稳定, 灵敏 度高,准确度好,干扰少, 试剂容易获得。铁离子与铬 天青 B反应生成的络合物至少可稳定 10h 以上。试 剂 1可稳定 3 个月以上。本法性能指标符合临床要 求,适宜于手工和自动化分析。 参 考 文 献 1 叶应妩,王毓三,主编. 全国临床检验.第 2版.南京:东南 大学出版社, 1997. 2 Siek G, Lawlor J, Pelczar D, et al. Direct serum total iron- bin d- ing capacity as say suitab le for au tom ated analyzers. Clin Chem, 2002, 48( 1) : 161-166. 3 Yamanishi H, Kimura S , Iyama S, et al. Ful ly automated meas- urem ent of total iron- binding capacity in serum. Clin Ch em, 1997, 43( 12) : 2413-2417. 4 Yamanishi H , Iyama S, Yamaguchi Y, et al. Modif ication of ful ly au tom ated total ir on-bin ding capacity ( TIBC) as say in serum and comparison w ith dimension T IBC m ethod. Clin Ch em, 2002, 48 ( 9) : 1565-1570. (收稿日期: 2004-12-20) #11#国际检验医学杂志 2006年 1月第 27卷第 1期 Int J Lab Med, January 2006,Vol. 27,No. 1