转基因小鼠基因型鉴定

小鼠组织DNA的取材及抽提 1 蛋白酶K储存液的配制 用超纯水彻底溶解蛋白酶K粉剂，使终浓度为10mg/ml，每管1ml分装，-20度保存备用。 2 裂解液配制 尿素 4M（240.24g/1000ml） EDTA-2Na-2H2O 10mM ( 3.722g/1000ml) Sarkosyl 0.5% ( 5g/1000ml) Tris/HCl ( 1M, PH 8.0 ) 0.1M ( 100ml/1000ml ) NaCl 0.2M ( 11.688g/1000ml ) H2O 补足至1000ml 1000ml 3 小鼠组织取材 使用乙醇擦拭的手术剪刀剪少许鼠耳尖部组织，半个火柴头大小足够；或取小鼠尾部组织2-3mm即可。每次取材需用乙醇重新擦拭，如有条件可更换手术器械。 4 小鼠组织DNA抽提 将取材完毕的组织置于1.5ml 离心管中，加500ul 裂解液其中含有50ul蛋白酶K储存液，使用1ml移液器反复吹打后封管置于56℃水浴过夜，或期间反复拿出震荡。次日样本于室温12000rpm离心10min，转移上清于1.5ml 离心管中，加1ml无水乙醇，盖后振摇可见絮状沉淀。12000rpm 4℃离心20min。弃上清，加入预冷的70%乙醇洗涤，摇晃后12000rpm 4℃离心10min。重复洗涤步骤。 完全弃去上清，通风橱内待乙醇挥发，加500ul纯水吹打溶解（看DNA沉淀的量，300ul亦可。）取1- 2ul做PCR。 5 小鼠基因型的PCR鉴定 反应体系： 10×Taq buffer 1.0μl dNTP (10mM) 0.2μl MgCl2 (25mM) 1.0μl Primer 1（10nM） 0.5μl Primer 2（10nM） 0.5μl Primer 3（10nM） 0.5μl Tissue DNA 1.0μl Taq polymerase 0.3μl ddH2O 5.0μl 10.0μl 反应条件： Step 1： 94℃ 5min Step 2： 94℃ 1min 58℃ 30sec 72℃ 1min 重复Step 2 35个循环 Step 3： 72℃ 10min Step 4： 4℃ Hold