猪传染性胃肠炎病毒_猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒三重PCR检测方法的建立(1)

猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒 三重 PCR检测的建立 郑新添，杨小燕，戴爱玲，李晓华，陈星星 （1. 龙岩学院生命科学学院； 2. 福建省人畜寄生与病毒性疫病防控工程技术研究中心 福建龙岩 364012） 摘要：通过三对引物分别扩增猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）及 猪轮状病毒（RV）的特异性基因，建立了一个能对 TGEV、PEDV 及 RV 感染鉴别诊断的三重 PCR 方 法。 该方法能同时检测 TGEV 的 M 基因 252bp 片段、PEDV 的 N 基因 540bp 片段及 RV 的 VP7 基因 412bp 片段，而对 CSFV、PCV2、PRRSV、PRV 等无扩增，其检测 TGEV、PEDV 及 RV 的极限为 100pg 核酸/μL；用该方法对临床收集的 26 份粪便样品进行检测，结果明：建立的多重 PCR 方法具有特 异性强，强灵敏度高等特点，能用于临床诊断及流行病学调查。 关键词：猪传染性胃肠炎；猪流行性腹泻；猪轮状病毒；多重 PCR；诊断 中图分类号：S858.28 文献标识码：A 文章编号：1673－4629(2011)05－0055－04 收稿日期：2011-04-23 作者简介：郑新添，男，福建上杭人，讲师，主要从事动物疫病诊断、动物传染病病原学研究。 基金项目：福建省科技厅区域科技重大项目（2009N3013）。 龙 岩 学 院 学 报 JOURNAL OF LONGYAN UNIVERSITY2011年 10 月 第 29 卷 第 5 期 October 2011 Vol．29 No．5 猪传染性胃肠炎 （Transmissible Gastroenteritis, TGE）， 猪流行性腹泻 （Porcine Epidemic Diarrhea, PED）及猪轮状病毒（Porcine rotavirus，RV）感染，是 猪场常见的病毒性腹泻， 此三种病毒性腹泻造成 了猪场饲料报酬降低、 药物和人力增加等重大损 失，是危害猪场最严重的疾病之一 [1-2]。 三者均为高 度接触性肠道疾病， 分别由猪传染性胃肠炎病毒 （Transmissible Gastroenteritis virus, TGEV）、猪流行 性 腹 泻 病 毒 （Porcine Epidemic Diarrhea virus, PEDV）及猪轮状病毒 （Porcine rotavirus，RV）引起 。 由于 TGE、PED 及 RV 有相似的临床表现及传染途 径，其鉴别诊断通常需借助实验室诊断技术 [3]，如病 毒分离、免疫荧光试验、PCR 技术等；传统的诊断技 术如病毒分离、免疫荧光试验等费时费力，不适于 临床快速诊断， 也不适于大规模的流行病学调查； 而 PCR 技术具有特异性强，敏感度高，可进行活体 诊断等特点，在实验室诊断中具有较突出的优势 [4]。 与传统 PCR 逐一扩增单一病原体不同， 本研究通 过设计三对引物， 分别扩增 TGEV、PEDV 及 RV 的 特异性序列，以 TGEV-PEDV-RV 三联灭活疫苗为 扩增模板，建立了对猪传染性胃肠炎、猪流行性腹 泻及猪轮状病毒感染鉴别诊断的三重 PCR 体系 ， 并将其应用于临床检测。 1 材料与试剂 1.1 病毒、 病料及粪样：TGEV-PEDV-RV 三联灭 活疫苗 （批号 0905001，山东农科院畜牧兽医研究 所 ）；猪瘟病毒（CSFV）、猪呼吸与繁殖综合征病毒 (PRRSV)、猪圆环病毒 2 型（PCV-2）和猪伪狂犬病 毒（PRV）阳性病料由本实验室保存；26 份疑似病毒 性腹泻粪样采自龙岩学院动物医学研究所接诊病 例。 猪肾细胞 PK-15 由本实验室保存。 1.2 主 要 试 剂 M -MuLV Reverse Transcriptase、 pMD-18T Vector、DNA 分子质量标准 DL2000、Taq 酶等购自大连 Takara 宝生物工程有限公司 ，Trizol reagent 购自天根生物工程有限公司， 其他试剂均 为国产分析纯。 1.3 引物 根据 Genbank 登录的 TGEV、PEDV 及 RV 序列，设计 3 对特异性扩增引物（表 1），其中引 物对 t（TGEV-MP-UP/DN）扩增 TGEV MP 基因，引 物对 p(PEDV-NP1/2)扩增 PEDV NP 基因，引物对 r (RV-f/r)扩增 RV VP7 基因。 引物由上海捷瑞生物 工程有限公司合成。 55 2 方法 2.1 RNA 提取 本试验所用 RNA 均用 Trizol 法提取，方法参照 试剂盒#说明#。称取样品（阳性对照：TGEV-PEDV- RV 三联灭活疫苗冻干粉 0.1g； 阴性对照：PK15 细 胞 106 cells，CSFV、PCV2、PRRSV、PRV 等 病 料 各 0.1g；临床检测样品 ：新鲜粪便样品 0.2g），分别加 入 Trizol Reagent 800μL，室温作用 5min 后加入 200 μL 氯仿，颠倒混匀。 4℃，12000r/min 离心 10min，取 上清至新的 1.5mL 离心管中， 加等体积异丙醇，颠 倒混匀。 4℃，12000r/min 离心 10min， 弃上清，1mL 75％乙醇洗涤。 4℃，12000r/min 离心 10min，自然干 燥，加 20μL DEPC 水溶解。 2.2 cDNA 合成 在 1.5mL 离心管中加入：M-MuLV buffer 4μL， RNase Inhibitor（40 U/μL） 0.5μL，M-MuLV Reverse Transcriptase （5 U/μL） 1μL，random primer 1μL， dNTPs(2.5 m mol/L)1μL，疫苗株 RNA 模板 1μL，补 充 ddH2O 至 20μL 室温下混匀后 ，42℃水浴 1h，冰 浴 2min，10000r/min 离心 30s，即得 cDNA。 2.3 单一病原体基因 PCR 扩增及测序 以阳性对照疫苗株 RNA 转录获得的 cDNA 为 模板，分别以表 1中的 3对引物，作单对引物扩增。 扩 增体系为 10×PCR buffer 2.5μL，dNTPs（2.5m mol/L） 1μL， 上、 下游引物各 1μL，rTaq (5 U/μL)0.5μL， ddH20 16.5μL，cDNA 模板 2μL。 95℃ 预变性 5 min 后，进入 95℃ 60 s，退火温度分别为（TGEV 51℃， PEDV 53℃ ，RV 51℃）和 72℃ 60s 的循环，共循环 30 次，最后 72℃延伸 5min。4℃保存 PCR 产物。PCR 结束后，取 5μL 产物作琼脂糖凝胶电泳分析。 将电 泳分析正确的目的片段， 连接 pMD-18T Vector，转 化大肠杆菌 JM109，进行 PCR 克隆与测序。 2.4 多重 PCR 的建立 在单对引物扩增成功的基础上，将表 1 中 3 对 引物同时加入扩增体系， 建立三重 PCR 扩增反应 体系 。 PCR 反应体系如下 ：10 ×PCR buffer 5μL， dNTPs（2.5m mol/L）1μL，3 对引物（各单条引物终浓 度均为 50nM），rTaq （5 U/μL）1μL，cDNA 模板 2 μL, ddH20 补充至 50 μL。 PCR 反应程序如下：95℃ 预变性 5min 后， 进入 95℃ 40s，51℃ 1min 和 72℃ 1min 的循环， 共循环 35 次， 最后 72℃延伸 5min， 4℃保存 PCR 产物。 同时，对多重 PCR 反应体系的 引物浓度，退火温度等进行优化。 2.5 特异性试验 以 PRRSV、PCV2、CSFV、PRV 等病原体的核酸 为模板，同时以 TGEV-PEDV-RV 疫苗毒株核酸为 阳性对照， 进行同等条件下 PCR 扩增， 反应结束 后，取 5μL 反应液在 1.5%琼脂糖凝胶上电泳分析。 2.6 敏感性试验 将疫苗株阳性对照 cDNA 用 ddH2O 稀释，用紫 外分光光度计测量核酸浓度， 按 10 倍浓度梯度稀 释，将核酸浓度调整至 1 μg/μL-1 pg/μL，分别以它 们为模板， 按优化的多重 PCR 反应体系进行 PCR 扩增。反应结束后，取 5μL 反应液在 1.5%琼脂糖凝 胶上电泳观察。 2.7 多重 PCR 方法的临床应用 取动物医学研究所采集的疑似病毒性腹泻粪 便为样品，按照上述方法建立的多重 PCR 技术，检 测 TGEV、PEDV 及 RV。 3 结果 3.1 单对引物特异性扩增 按表 1 中 PEDV、TGEV、RV 三对引物进行 PCR 反应，结果均能扩增出单一的特异性条带（图 1）， 对 PCR 产物克隆， 测序表明， 所得的基因序列与 表 1 多重 PCR 扩增引物 引物名称 序列 扩增长度 Genbank登录号 TGEV-MP-UP TGEV-MP-DN PEDV- NP1 PEDV-NP2 RV-f RV-r 5’-CAACCCTGAAACTAACGCAATTCT-3’ 5’-GCCCATCCAGTCGCACTACTT-3’ 5’-AGGAACGTGACCTYAAAGACATCCC-3’ 5’-CCAGGATAAGCCGGTCTAACATTG-3’ 5’- AAATCCGCAACTATACTGTGACTA-3’ 5’-TGGCCAACTGGTTCTGTCTA-3’ 252bp 540bp 412bp FJ755618 AF353511 FJ807867 56 Genbank登录的相应目的基因核苷酸序列同源性均 在 90%以上。 图 1 TGEV、PEDV 及 RV 单重 PCR 扩增结果 1，阴性对照；2，RV；3、PEDV；4，TGEV；M，DNA 分子量标准 3.2 PEDV- TGEV-RV 三重 PCR 检测体系的建立 与优化 以 TGEV-PEDV-RV 三联灭活疫苗为核酸模 板，设计 TGEV 及 PEDV 特异性扩增引物，进行了 PCR 扩展，电泳结果表明，扩增产物符合预期目的 片段，对其优化结果表明，最佳退火温度为 51℃（图 2）。 引物对 t、p、r 最佳浓度分别为 0.2 μmol/L、0.2 μmol/L、0.3 μmol/L（图 3）。 图 2 多重 PCR 不同退火温度扩增结果 1，47℃； 2，49℃； 3，51℃；4，53℃； 5，55℃ M，DNA 分子量标准 图 3 多重 PCR 不同引物浓度扩增结果 引物对 t、p、r 浓度分别为：1、（0.2、0.2、0.2）μmol/L 2、 （0.2、0.3、0.2）μmol/L，3、（0.2、0.2、0.3）μmol/L 4、（0.3、0.2、0.2）μmol/L M，DNA 分子量标准 3.3 特异性试验结果 特异性试验结果表明，该 PCR 体系对 PRRSV、 CSFV、PCV2、PRV 等均无扩增， 仅对含有疫苗核酸 的阳性对照有特异性扩增 （图 4），说明所建立的 PCR 体系特异性强。 图 4 多重 PCR 特异性试验 1, PRRSV； 2, CSFV；3, PCV2； 4, PRV； 5, 疫苗阳性株； M, DNA marker DL2000 3.4 敏感性试验结果 将提取的阳性核酸倍比稀释，使其浓度分别为 1μg/μL -1pg/μL，并以此作为扩增模板，结果表明， 核酸浓度为 1μg/μL-100pg/μL 能扩增出特异性条 带，而核酸浓度为 1pg/μL 、10pg/μL 均无扩增；因此 该 PCR 体系的扩增下限为 100pg 核酸/μL（图 5）。 图 5 多重 PCR 敏感性试验 1，1 pg/μL；2，10pg/μL；3，100pg/μL；4，1ng/μL；5，10ng/ μL；6，100ng/μL，7，1μg/μL M, DNA 分子量标准 3.5 多重 PCR 临床检测初步应用 以建立的 PCR 方法检测临床采集的粪便样 品，以鉴别诊断 PED、TGE 及 RV。对 2009 年 6 月至 2011 年 3 月采集的 26 份疑似病毒性腹泻病例的粪 样进行了检测， 结果表明 7 份为 PEDV 阳性，17 份 为 TGEV 阳性，2 份为 RV 阳性病例 ，2 份为 PEDV 和 TGEV 共感染。 4 讨论 猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻及猪轮状病毒 感染，这三种病毒性腹泻是仔猪的常见疾病 ，发病 率高，目前均无有效的药物，且三者在临床症状、流 行病学和病理变化上无明显差异 [5]。 传统的检测方 法，如细胞培养、免疫学和动物实验等虽然能对三 者鉴别诊断，但其最大的缺点是检测周期长、灵敏 度低 [6]。 PCR 技术是目前鉴别诊断上述三种病毒的 最敏感、特异的方法 [7]。 相对于传统 PCR 检测单一 病原体， 多重 PCR 能同时进行多种病原微生物的 鉴定，且具有灵敏、快捷等特点，适于大规模检测， 57 在动物疫病的流行病学的调查与预防中，具有不可 替代的作用。 多重 PCR 技术在同一体系中实现多个目标基 因的特异性扩增，但并非单一 PCR 简单混合。 引物 设计是其中一个关键因素，除了考虑每对引物的特 异性及扩增效率之外，还必须尽量减少不同引物对 之间形成二聚体的可能，此外，还须对各对引物浓 度配比、退火温度及其他 PCR 反应条件进行优化 [8]。 本文针对 TGEV、PEDV 及 RV 基因序列， 扩增了 3 个特异性片段，长度分别为 252bp，540bp 和 412bp， 目的片段之间具有明显的长度差异， 便于鉴别，且 单对引物的扩增特异性强， 扩增效率高。 对多重 PCR 引物浓度及退火温度进行了优化，获得了最佳 反应条件。 核酸的质量是影响 PCR 灵敏度的另一 重要因素。在临床检测中往往以粪便为样品，但粪便 中含有多种抑制 PCR 反应的因子，因此为获得较好 的核酸质量， 建议使用商品化的核酸提取试剂盒。 此外，为减少假阴性，采集新鲜粪样后应尽快处理。 有报道表明 PEDV 集中在断奶后仔猪及育肥 猪，而 TGEV 和 RV 发生在哺乳期仔猪 [9]，作者从龙 岩学院动物医学研究所收集的 2009-2011 年临床 病例的检测结果也表明，PEDV 及 TGEV 的感染以 断奶前后居多，RV 的感染率较低，而三者混合感染 的几率更低。有关闽西地区此三者病毒性腹泻流行 病学规律还需更进一步的试验阐明。 参考文献： [1]殷震，刘景华 . 动物疾病学：2 版 [M]. 北京：科学出 版社，1997. [2]Prabha, S., Verghese, S. Detection of porcine ro－ tavirus from tissue and faecal specimens [J]. Indian J Med Microbiol, 2009(2):149-152. [3]邓小红 , 吕立新 , 陶庆园 ，等 . 猪病毒性腹泻病的 实验室诊断[J]. 畜牧兽医师 , 2004（1）：49-50. [4]Kim, S. Y., Song, D. S., Park, B. K. Differential detection of transmissible gastroenteritis virus and porcine epidemic diarrhea virus by duplex RT-PCR[J]. J Vet Diagn Invest, 2001, 13(6):516-520. [5]陈少华 , 谢三星 . 猪三大病毒性腹泻区别诊断问 [J]. 中国动物检疫 , 1995（3）：22-23. [6]黄海龙 , 胡桂学 , 陶淑霞 . 猪传染性胃肠炎和猪流 行性腹泻诊断方法研究进展 [J]. 动物医学进展 , 2004 （3）：43-46. [7]Kim, O., Choi, C., Kim, B.et al. Detection and dif－ ferentiation of porcine epidemic diarrhoea virus and trans－ missible gastroenteritis virus in clinical samples by multiplex RT-PCR[J]. Veterinary Record, 2000（22）：637. [8]陈明洁，方倜，柯涛，等 . 多重 PCR-一种高效快速 的分子生物学技术 [J]. JOURNAL OF WUHAN UNIVER－ SITY OF TECHNOLOGY, 2005（10）：33-36. [9]张坤，何启盖 . 猪流行性腹泻病毒 , 猪传染性胃肠 炎病毒和猪 A 群轮状病毒多重 RT-PCR 检测方法的建 立及临床应用[J]. 畜牧兽医学报, 2010（8）：1001-1005. 〔责任编辑：黄素华〕 Development of a Method of Multiplex RT-PCR Detection of TGEV, PEDV and RV ZHENG Xin-tian, YANG Xiao-yan, DAI Ai-ling, LI Xiao-hua, CHEN Xing-xing Abstract： Three pairs of primers amplified genes of transmissible gastroenteritis virus (TGEV), porcine epi－ demic diarrhea virus (PEDV) and porcine rotavirus (RV) respectively were designed to develop a method of dif－ ferential diagnosis of TGEV, PEDV and RV. The established PCR can detect M gene with the length of 252bp of TGEV, N gene with the length of 540 bp of PEDV and VP7 gene with the length of 412 bp of RV. Negative re－ sults when using CSFV, PCV2, PRRSV and PRV as control were obtained. The detection limit of this method was 100-pg nucleotide per PCR reaction. Twenty six diarrheal fecal samples collected from viral diarrheal piglet were submitted to detect TGEV, PEDV and RV, and the result showed that this multiplex RT-PCR method with the characteristics of high sensitivity and high specificity can be widely used in clinical diagnosis and epidemiological investigation. Key words： TGEV; PEDV; RV; multiplex PCR; diagnosis 58