血红蛋白2

nullnull实验操作:蛋白质提取和分离一般步骤：1、样品处理2、粗分离3、纯化4、纯度鉴定null一、样品处理：（一）基础知识：1、血液的组成：2、血红蛋白的结构： 血液由血浆和各种血细胞组成，其中红细胞最多。在红细胞的组成中约90%是血红蛋白。 血红蛋白由四个肽链组成，包括两个α-肽链和两个β-肽链。其中每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳。血红蛋白因含有血红素而成红色。null（二）样品处理步骤：1.红细胞洗涤：（1）洗涤红细胞的目的是什么？（2）如何分离红细胞？（3）如何洗涤红细胞？去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。离心→取红细胞→重复洗涤 将红细胞液体倒入烧杯，加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。null2.血红蛋白的释放：（1）如何释放血红蛋白？（2）使用蒸馏水、甲苯有何作用？（4）采集的血样为什么要及时并采用低速短时离心分离红细胞？（5）为何要用生理盐水重复洗涤三次？ 洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白；用0.9%生理盐水是为了保持红细胞内外正常的渗透压，防止细胞破裂。 离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。使红细胞破裂，释放出血红蛋白。null3.分离血红蛋白溶液：（1）如何分离血红蛋白？离心→分层→过滤→分液（2）离心后分几层？每层各是什么物质？分4层；自上而下，第一层是无色透明的甲苯层，第二层是白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第三层是红色透明液体，是血红蛋白水溶液，第四层是其他杂质的暗红色沉淀物。null4.透析：（1）如何透析？（2）透析袋用什么制成？作用是什么？（3）透析目的是什么？ 透析袋一般是用硝酸纤维素（又称玻璃纸）制成的。透析袋能使小分子自由出入，而将大分子保留在袋中。 透析可以去除样品中分子量较小的杂质，或用于更换样品中的缓冲液。血红蛋白溶液 透析袋 磷酸缓冲液null 二、凝胶色谱操作：1、凝胶色谱柱的制作：2、凝胶色谱柱的填装：3、样品的加入和洗脱：（1）为什么要根据色谱柱内的体积计算所需要的凝胶量？（2）本实验使用的什么凝胶？名称中“G”和75各表示什么意思？ 用凝胶色谱法进行洗脱的目的是将相对分子质量大的杂质除去。null 三、SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳： 判断纯化的蛋白质是否达到要求，进行蛋白质纯度的鉴定。null思考下列问题：1.蛋白质提取和分离的四个步骤分别体现在那些实验操作中？ 首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。null2. 血红蛋白有何特点？这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？3.如何判断血红蛋白分离是否成功？ 因含有血色素而呈红色，在样品洗脱时，可通过颜色来判断什么时候收集洗脱液。使操作变得直观、简化了操作步骤。 若血红蛋白红色区域均匀、狭窄、平整，则分离成功；若血红蛋白红色区域歪曲、散乱、变宽，则不成功。null 若填装不紧密、不均匀，有气泡，会形成无效空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，扰乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。4.填装凝胶色谱柱为什么要紧密不能有气泡？5.用什么方法加速干燥的凝胶颗粒膨胀？用这种方法有什么优点？ 将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，逐渐升温接近沸腾。 ①节约时间；②除去凝胶中可能带有的微生物；③排除胶粒内的空气。注意事项：注意事项：1.红细胞洗涤次数不能过少； 2.离心速度不能过高和时间不能过长； 3.填装凝胶色谱柱不能有气泡，要紧密； 4.不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。