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电针联合脂肪源性干细胞移植对脑缺血_再灌注大鼠BDNF及其受体TrkB表达的影响_王莹

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电针联合脂肪源性干细胞移植对脑缺血_再灌注大鼠BDNF及其受体TrkB表达的影响_王莹 收稿日期:2012 - 05 - 29 基金项目:黑龙江省普通高等学校青年学术骨干支持计划项目 (1152G050) ;黑龙江省卫生厅科研资助项目(2010243) 作者简介:王莹(1977 -) ,男,黑龙江哈尔滨人,讲师,博士,研究方 向:中枢神经再生。 通讯作者:李文媛(1980 -) ,女,黑龙江伊春人,讲师,博士,研究方 向:中枢神经再生。 的作用,从而使 AngⅡ与 AT1 受体结合的能力增加,引起心 室重构的发生。经过治疗,各用药组大鼠心肌组织 AT1 - mRNA和蛋白表达明显降低,其中益气活血组、益...
电针联合脂肪源性干细胞移植对脑缺血_再灌注大鼠BDNF及其受体TrkB表达的影响_王莹
收稿日期:2012 - 05 - 29 基金项目:黑龙江省普通高等学校青年学术骨干支持项目 (1152G050) ;黑龙江省卫生厅科研资助项目(2010243) 作者简介:王莹(1977 -) ,男,黑龙江哈尔滨人,讲师,博士,研究方 向:中枢神经再生。 通讯作者:李文媛(1980 -) ,女,黑龙江伊春人,讲师,博士,研究方 向:中枢神经再生。 的作用,从而使 AngⅡ与 AT1 受体结合的能力增加,引起心 室重构的发生。经过治疗,各用药组大鼠心肌组织 AT1 - mRNA和蛋白达明显降低,其中益气活血组、益气活血利 水组中药与西药组无显著性差异(P > 0. 05) ,且益气活血 利水组疗效明显优于益气活血组(P < 0. 01) ,说明益气、活 血、利水中药可通过降低实验大鼠心肌组织 AT1 - mRNA 和蛋白表达,抑制 RAAS系统的过度激活,从而抑制心室重 构,以达到治疗 CHF 的目的,这可能是益气、活血、利水中 药治疗心力衰竭的作用机制之一。 ERK是 20 世纪 80 年代末期发现的一类丝 /苏氨酸蛋 白激酶,是与细胞生长、分化密切相关的传递丝裂原信号的 信号转导蛋白,它正常定位于胞浆,当激活后转位于胞核, 调节转录因子活性,产生细胞效应。其中 ERK2 是丝裂原 活化蛋白激酶(MAPK)家族的一员,是许多胞外促细胞增 殖信号转导通路的核心环节。有研究显示,在血管平滑肌 细胞中,ERK2 活化后发生入核(也称核易位或核转位) , 进而参与细胞的增生和分化[4],参与激活 c - fos 等原癌基 因表达而导致心肌细胞肥大发生。它的信号传递途径是涉 及调剂细胞生长、发育和分裂的信号网络中心,其基本的信 号传递步骤是:Ras - Raf - MEK - ERK[5]。本次实验发 现,慢性心衰大鼠模型组,ERK2 基因和蛋白表达急剧增 强,与假手术组比较有统计学意义(P < 0. 01) ;应用中药和 血管转换酶抑制剂赖诺普利后能使血管 ERK2 基因和蛋白 表达明显减少,其中益气活血组、益气活血利水组中药与西 药组无显著性差异(P > 0. 05) ,且益气活血利水组疗效明 显优于益气活血组(P < 0. 01) ,提示 ERK2 可能参与了慢 性心衰后的全过程,且中药可能通过抑制 ERK2 活化入核, 进而抑制心肌细胞分化、增生,延缓心室重构的发生。 心力衰竭是各种心脏疾病的终末阶段,是危害人类健 康、致死的主要因素之一。中药在治疗慢性心衰有着得天 独厚的优势,随着中药制剂技术的发展,我们发现益 气、活血、利水中药复方对慢性心衰大鼠 AT1、ERK 通路有 调节作用,这为今后中药治疗慢性心衰提供了新的分子生 物学依据。 参考文献 [1] 张艳,杨硕,庞敏,等.益气活血复方对慢性心衰大鼠心肌组 织 AngⅡ及 PKC 的影响[J]. 中华中医药杂志,2008,23 (11) :999 - 1001. [2] Whaley - ConnellA,Habibi J,Cooper SA,et al. Effect of renin inhibition and AT1R blockade on myocardial remodeling in the transgenic Ren2 rat[J]. Am JPhysiol Endocrinol Metab,2008, 295(1) :E103 - 109. [3] 高山钟,张向阳.慢性心力衰竭病理生理和药物治疗研究进 展[J].心血管康复医学杂志,2009,18(3) :301 - 303. [4] 李爱萍,陈光辉,黄岚,等.血管紧张素Ⅱ作用心肌细胞后细 胞外信号调节激酶的入核机制[J].中华高血压杂志,2010, 18(10) :946 - 950. [5] Gary L. The protein kinase complement of the human genome [J]. Science,2002,296(6) :1911 - 1912. 第 30 卷 第 10 期 2 0 1 2年 1 0月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol. 30 No. 10 Oct. 2 0 1 2 中 华 中 医 药 2273 学 刊 电针联合脂肪源性干细胞移植对脑缺血 /再灌注大鼠 BDNF及其受体 TrkB表达的影响 王莹1,李文媛1,李智刚2,丁利1,赵斯达1 (1.牡丹江医学院解剖教研室,黑龙江 牡丹江 157011;2.牡丹江医学院红旗医院普外科,黑龙江 牡丹江 157011) 摘 要:目的:探讨电针联合脂肪源性干细胞(ADSC)移植对大鼠缺血 /再灌注损伤后海马区 BDNF及其受体 TrkB表达的影响。方法:成年大鼠随机分为模型组、电针组、ADSC 移植组、电针 + ADSC 组。NSS 法行神经功能 损害评分,采用 Western bolt法及实时荧光定量 PCR检测海马区 BDNF和 TrkB表达。结果:电针 + ADSC组海马 区 PKH -26 标记的细胞个数高于 ADSC 组。与模型组比较,各治疗组 NSS 评分均显著降低,海马区 BDNF 和 TrkB表达上调。其中电针 + ADSC组 NSS评分低于电针组和 ADSC组,而 BDNF和 TrkB表达显著增加。结论:电 针联合脂肪源性干细胞移植促进脑缺血再灌注大鼠神经功能恢复作用优于单独治疗组,其机制可能与电针上调 海马区 BDNF和 TrkB的表达,改善干细胞生存内环境,促进移植的 ADSC迁移和存活有关。 关键词:电针;脂肪源性干细胞;缺血再灌注损伤;BDNF;TrkB 中图分类号:R322. 32 文献标识码:A 文章编号:1673 - 7717(2012)10 - 2273 - 03 Effect of Electroacupuncture Combined with Adipose - derived Stem Cell on BDNF and TrkB after Cerebral Ischemia -Reperfusion in Rats WANG Ying1,LI Wen-yuan1,LI Zhi-gang2,DING Li1,ZHAO Si-da1 (1. Department of Anatomy,Mudanjiang Medical College,Mudanjiang 157011,Heilongjiang,China; 2. Department of Surgery of Hongqi Hospital,Mudanjiang 157011,Heilongjiang,China) Abstract:Objective:To investigate the effect of electroacupuncture (EA)combined with adipose - derived stem cell 3722 第 30 卷 第 10 期 2 0 1 2年 1 0月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol. 30 No. 10 Oct. 2 0 1 2 中 华 中 医 药 2274 学 刊 (ADSC)transplanted on brain - derived neurotrophic factor (BDNF)and tyrosine kinase? (TrkB)in hippocampus after cerebral ischemia - reperfusion in rats. Methods:A total of 36 healthy SD rats were randomly divided into model group, EA group,ADSC group and EA + ADSC group. The rat model of middle cerebral artery occlusion was established in model,EA treatment was applied to“Dazhui”and“Neiguan”in EA group,ADSC suspension were marked with PKH - 26 and then infused into the caudal vein in ADSC group. EA + ADSC group was combined EA treatment with ADSC transplanted,7d after reperfusion,neurological function score were observed by neurological severity scores(NSS) ,The expression of BDNF and TrkB in hippocampus were observed by using Western bolt and quantitative real - time RT - PCR. Results:The number of PKH - 26 labeled ADSC in EA + ADSC group was higher than in ADSC group(P < 0. 05). Compared with model group,the NSS were significantly decreased in EA group,ADSC group and EA + ADSC group,the protein and mRNA expressions of BDNF and TrkB in hippocampus were significantly increased(P < 0. 05). Compared with EA group and ADSC group,the expression of BDNF and TrkB were increased in EA + ADSC group,and the NSS were significantly decreased(P < 0. 05). Conclusion:The combined treatment promoted functional outcome significantly more than either of the single treatments in rats suffered ischemia reperfusion injury,which may be related to electroacu- puncture upregulating BDNF and TrkB expression in the ischemic brain,and promoting ADSC survival and migration. Key words:electroacupuncture;adipose - derived stem cell;cerebral ischemia reperfusion;BDNF;TrkB 干细胞移植治疗脑缺血性疾病是近年来医学领域研究 的一个热点,我们前期研究发现[1]将脂肪源性干细胞(adi- pose - derived stem cell,ADSC)经尾静脉注射治疗脑缺血 损伤,可减轻神经功能的缺损。但由于脑缺血区干细胞血 液循环障碍和炎症反应,严重影响干细胞生存内环境,导致 干细胞向缺血区迁移能力及存活率较低,其神经再生效果 并不理想[2],近年来有研究发现[3]电针可增强脊髓损伤中 移植的骨髓间充质干细胞存活的数量和迁移能力,两者联 合治疗能协同促进脊髓损伤后神经功能恢复。但联合治疗 是否同样协同促进脑缺血损伤的神经再生,尚未见相关报 道。为此,本研究观察电针联合脂肪源性干细胞移植对脑 缺血后海马区脑源性神经营养因子(brain - derived neuro- trophic factor,BDNF)及其受体酪氨酸激酶受体 B(tyrosine kinase B,TrkB)表达及神经功能恢复的影响,探讨电针与干 细胞联合治疗脑缺血损伤的作用机制。 1 材料与方法 1. 1 实验动物 雄性 SD 大鼠 36 只,清洁级,体质量 280 ~ 320g,购于 中国医科大学实验动物中心[许可证号:SYXK(辽) 20030013]。 1. 2 主要试剂及仪器 兔抗大鼠 BDNF抗体、兔抗大鼠 TrkB抗体购于北京中 杉金桥生物技术有限公司。抗 β - actin抗体购于美国 Santa Cruz公司。PKH - 26 试剂盒购于美国 Sigma 公司。TRIzol 试剂、SuperscriptII 反转录酶、dNTPs 购自 Invitrogen 公司, TaqDNA聚合酶、DL2000DNA 标志物购自日本 Takara 公司, BDNF、TrkB和 β - actin引物由宝生物工程(大连)有限公司 合成。实时定量 PCR 仪(Stratagene 3005,美国 Stratagene 公 司) ,图像系统(Meta Morph / DP10 / BX41,日本奥林巴 斯公司) ,电针仪(G -6805,上海华谊仪器制造厂)。 1. 3 实验方法 1. 3. 1 ADSC培养及 PKH26 标记 脂肪组织由中国医科 大学整形外科提供,来自于 25 ~ 35 岁要求去除腹部多余脂 肪的健康成人,供体无传染病及内分泌疾病,男女比例为2∶ 8。告知其脂肪抽吸物将用于科学研究并知情同意。脂肪 源性干细胞参照 Zuk等[1]的方法进行分离培养,并换液传 代,分离培养取第 3 ~ 5 代的 ADSC,制成单细胞悬液后,参 照 Tohill[1]的方法进行 PKH26 标记 ADSC。 1. 3. 2 模型制备及动物分组 大鼠按随机数字表法分为 4组:模型组(n = 9)、电针组(n = 9)、ADSC组(n = 9)、电针 + ADSC组(n = 9)。参照 Longa等[4]的线栓改良法复制大 鼠大脑中动脉缺血模型。模型组:单纯造模,不予任何干 预;电针组和电针 + ADSC 组于建模成功后即刻,60min, 120min,180min进行电针干预,针刺大椎、双侧内关穴位 (参照华兴邦制定的《实验动物穴位图谱》)。采用疏密波, 频率 120 次 /min,强度 1mA,以局部肌肉轻微抖动为度,每 次持续刺激 30min。ADSC组和电针 + ADSC组于建模成功 后 180min分别经尾静脉注射已制备好的 PKH - 26 标记的 同种异体 ADSC悬液(4 × 106个 /100μL)[1],其余两组注射 等体积的磷酸盐缓冲液。 1. 3. 3 神经功能评估 采用 Chen 等[5]报道的神经功能 损害评分表(neurological severity scores,NSS) ,从运动、感 觉、反射、平衡 4 方面进行神经功能损害评估,22 分为最严 重的神经功能损害,即评分越高神经功能损害越严重。缺 血后 1 天,3 天,7 天各组大鼠分别进行 NSS评分。 1. 3. 4 Western blot检测 取各组 6 只大鼠海马组织加入 裂解液提取总蛋白,采用 BCA 定量试剂盒测定蛋白浓度。 SDS - PAGE凝胶电泳分离蛋白后转至硝酸纤维素膜;封闭 缓冲液封闭后,加入一抗(anti - BDNF 1 ∶ 150 稀释,anti - TrkB 1 ∶ 150 稀释)4℃孵育过夜,二抗(1 ∶ 2000 稀释)孵育 2h,TBS洗净后经显色液显示 15min,扫描后经 Image J图像 分析软件对印迹区进行灰度分析。 1. 3. 5 实时荧光定量 PCR检测 取各组 3 只大鼠海马组 织进行 RNA 提取,采用 Zacharek 等[1]报道方法进行 PCR 反转录、检测及荧光定量分析。引物设计及合成按照已报 道的序列设计并合成 BDNF、TrkB 以及内参照 β - actin 的 特异性引物。各引物的序列为:BDNF,上游 5' - GGGGT- TAGGAGAAGTCAAGC - 3',下游 5' - TGGACAGCCACTTT- GTTTCA - 3';TrkB,上游 5' - CGTAGG GACACGCACTCT- GA - 3',下游 5' - CCCAAGACCAGCAAGCATAA - 3';β - actin,上游 5' - TGGTGGGTATGGGTCAGAAGGACTC - 3', 下游 5' - CATGGCTGGGGTGTTGAAGGTCTCA - 3'。根据标 准曲线将各样品测得的 Ct值换算成拷贝数,分析各检测样 本中目的基因拷贝数相对于阳性定量参考样品的基因拷贝 数,分析方法利用 2 -△△CT方法。 1. 4 统计学处理 所得数据以采用 SPSS 13. 0软件进行统计学分析,数据以 均值 ±差(珋x ± s)表示,两组数据间比较使用 t 检验,多组 数据间比较使用 LSD检验。P <0. 05为差异有统计学意义。 2 结 果 2. 1 ADSC的培养 相差显微镜下观察,接种后 24h 细胞贴壁,呈成纤维细 胞样外观。培养 48h 后可见细胞已经充分伸展呈长梭形, 72h后开始聚集形成细胞集落,6天形成较密集的细胞群落。 4722 第 30 卷 第 10 期 2 0 1 2年 1 0月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol. 30 No. 10 Oct. 2 0 1 2 中 华 中 医 药 2275 学 刊 2. 2 NSS评分检测 缺血后 1 天和 3 天,各组间 NSS 评分无显著差异(P > 0. 05)。缺血后 7天,与模型组比较,电针组、ADSC组和电针 + ADSC组 NSS评分显著降低(P < 0. 05),其中电针 + ADSC组 NSS评分显著低于电针组和 ADSC组(P <0. 05)。见表 1。 表 1 各组 NSS评分(n = 9,珋x ± s) 组别 1 天 3 天 7 天 模型组 9. 69 ± 0. 75 15. 43 ± 1. 37 15. 56 ± 1. 05 电针组 8. 43 ± 1. 39 13. 96 ± 1. 36 11. 56 ± 0. 81* ADSC组 8. 35 ± 1. 97 14. 28 ± 1. 82 11. 47 ± 0. 66* 电针 + ADSC组 8. 95 ± 1. 57 13. 42 ± 0. 81 8. 62 ± 1. 61*△ 注:与模型组比较,* P < 0. 05;与电针组比较,△P < 0. 05。 2. 3 PKH - 26 标记观察 冰冻切片免疫荧光追踪 PKH - 26 标记的移植 ADSC, 可见电针 + ADSC组和 ADSC 组在海马区有红色荧光信号 表达,而模型组和电针组没有发现红色荧光信号。其中电 针 + ADSC组 PKH26 标记阳性细胞吸光度值为 70. 92 ± 5. 73,显著高于 ADSC组 44. 72 ± 10. 74(P < 0. 05)。 2. 4 Western bolt检测结果 与模型组比较,电针组、ADSC 组和电针 + ADSC 组海 马区 BDNF和 TrkB蛋白表达显著增加(P < 0. 05) ,其中电 针 + ADSC 组较电针组和 ADSC 组增加更为显著(P < 0. 05) ,而电针组与 ADSC 组 BDNF 和 TrkB 蛋白表达无显 著差异(P > 0. 05)。见表 2。 表 2 海马区 BDNF和 TrkB蛋白相对表达(n = 6,珋x ± s) 组别 BDNF TrkB 模型组 0. 40 ± 0. 05 0. 13 ± 0. 02 电针组 0. 58 ± 0. 08* 0. 29 ± 0. 03* ADSC组 0. 64 ± 0. 11* 0. 32 ± 0. 05* 电针 + ADSC组 0. 86 ± 0. 53*△ 0. 78 ± 0. 14*△ 注:与模型组比较,* P < 0. 05;与电针组比较,△P < 0. 05。 2. 5 实时荧光定量 PCR检测 与模型组比较,电针组、ADSC 组和电针 + ADSC 组海 马区 BDNF和 TrkB mRNA相对表达显著增加(P < 0. 05) , 其中电针 + ADSC组较电针组和 ADSC组增加更为显著(P < 0. 05)。见表 3。 表 3 海马区 BDNF和 TrkB mRNA 相对表达(n = 3,2 - ΔΔCt,珋x ± s) 组别 BDNF TrkB 模型组 0. 0144 ± 0. 0050 0. 0126 ± 0. 0056 电针组 0. 0346 ± 0. 0047* 0. 0329 ± 0. 0061* ADSC组 0. 0343 ± 0. 0073* 0. 0418 ± 0. 0059* 电针 + ADSC组 0. 0514 ± 0. 0029*△ 0. 0629 ± 0. 0068*△ 注:与模型组比较,* P < 0. 05;与电针组比较△P < 0. 05。 3 讨 论 电针是针刺疗法中的一种,是电刺激和针刺效应的结 合,因其具有低风险、操作方便、成本低等优点,是目前临床 治疗缺血性脑血管疾病的常用针刺方法。许多研究[4]证 实电针能有效促进脑缺血后神经功能恢复,但其作用机制 尚不明确。本实验中选取督脉大椎穴和心包经的内关穴进 行电针治疗脑缺血大鼠模型。内关为心包经络穴,心包为 心的护卫,心主血脉,可调理心气,促进气血的运行。针 刺内关穴可调节心、脉、血、神,达宁心调血安神之目的。大 椎为督脉之要穴,是阳气的集中点,针刺大椎可振奋六阳经 和督脉之阳气,使气血流畅,上行于脑,而发挥活血化瘀,健 脑补髓,醒脑开窍的作用[6]。实验结果表明电针组 NSS 评 分显著低于模型组,证实大椎穴和内关穴行电针治疗能够 促进脑缺血后神经功能恢复。 BDNF 是神经营养因子家族的主要成员之一,与其受 体 TrkB特异结合后启动细胞内一系列底物磷酸化[7],发挥 改善脑缺血后神经元细胞生存内环境,促进缺血后神经元 的存活和生长发育、抑制神经元细胞凋亡、促进神经元再生 的生物学效应。本研究发现与模型组比较,电针组海马区 BDNF和 TrkB表达显著增加,而且电针 + ADSC 组海马区 PKH26 标记 ADSC细胞个数多于 ADSC 组,因此我们推测 电针治疗可能通过上调 BDNF和 TrkB表达的表达,改善脑 缺血区干细胞生存内环境,促进移植的 ADSC 在脑缺血区 的存活和迁移。 近年来,ADSC由于其来源广、易于体外扩增纯化,已 成为干细胞治疗脑缺血损伤研究的热点。但有研究认为由 于脑缺血区血液循环障碍和炎症反应,影响移植干细胞生 存的内环境,导致干细胞向缺血区迁移能力及存活率降低, 分化能力减弱,神经再生效果并不理想[2]。近年来有研究 者[3]发现电针可增强脊髓损伤中移植的骨髓间充质干细 胞存活的数量和迁移能力,联合电针和骨髓间充质干细胞 能够协同促进脊髓损伤后神经再生,但联合治疗是否同样 协同促进脑缺血损伤神经再生则未见相关报道。为此,本 实验联合电针和 ADSC移植治疗脑缺血大鼠模型。研究结 果表明,与模型组比较,虽然电针组或 ADSC 组均能降低 NSS评分,但电针联合 ADSC 治疗效果明显优于单独治疗 组,BDNF和 TrkB表达也高于单独治疗组。联合治疗的协 同作用机制可能有很多种,一方面电针上调 BDNF 和 TrkB 的表达,改善干细胞生存内环境,促进了移植的 ADSC在脑 缺血区的存活和迁移。另一方面,增多的 ADSC 通过分化 成神经元细胞和分泌上调 BDNF 和 TrkB 等神经生长因子 表达来促进神经再生。 综上所述,本研究探讨联合应用 ADSC 和电针治疗大 鼠脑缺血损伤,并证实了联合治疗从功能上能够促进脑缺 血神经再生,其机制可能与电针上调 BDNF 和 TrkB 的表 达,改善干细胞生存内环境,促进了移植的 ADSC在脑缺血 区的存活和迁移有关。 参考文献 [1] 王莹,李文媛,李明秋,等.黄芪皂甙Ⅳ联合脂肪源性干细胞 对老龄大鼠脑缺血再灌注中神经营养因子表达的影响[J]. 中国老年学杂志,2011,31(20) :3963 - 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