组织与细胞培养

一、名词解释： 1. 细胞杂交：在体外条件下，通过人工培养和诱导将不同种生物或同种生物不同类型的两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程。两个或多个不同的细胞融合导致形成合核体。 2. 细胞系：指原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体。也指可长期连续传代的培养细胞。 3. 细胞株：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养物称为细胞株，也就是说，细胞株是用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。 4. 克隆：细胞克隆技术又称单个细胞分离培养技术，即从细胞群体中分离出一个细胞并使其在体外繁殖成新的细胞群体。P249（这种纯化的细胞群体称为细胞株，它们当中的每一个细胞的遗传特征及生物学特性极为相似，有利于对不同亚群细胞的形态和功能进行比较和研究。） 5. 骨间中质干细胞（骨髓基质干细胞）：在哺乳动物的骨髓基质中，存在具有形成骨、软骨、神经和成肌细胞能力的多种分化潜能的细胞亚群，称之为骨髓基质干细胞。 6. 原代培养：也叫初代培养，是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。原代培养是建立各种细胞系的第一步，是从事组织培养工作人员应熟悉和掌握的最基本的技术。原代培养的细胞具有很多特点，首先组织和细胞刚刚离体，生物学特性未发生很大变化，仍具有二倍体遗传特性，最接近和反映体内生长特性，很适合做药物测试、细胞分化等实验研究。 7. 有限细胞系：又称生长细胞系，这种细胞系的寿命一般只能维持一定的时间期限，不能够连续培养。因此，在体外培养的细胞，其生命的期限并非无限的。 8. 无限细胞系：又称连续细胞系，指能够连续传代的细胞系。 9. 细胞传代：原代培养后由于细胞游出数量增加和细胞的增殖，单层培养细胞相互汇合整个瓶底逐渐被细胞覆盖。这时需要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞生长。细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程称之为传代；进行一次分离再培养称之为传一代。 一·人脐静脉细胞的原代培养及鉴定 在超净台上，将脐带浸泡在PBS中清洗干净脐带表面的血液。修剪平整脐带两端，将12号针头从一横截面插入脐静脉，注入PBS（37℃预先温育）冲洗3遍以上，直至流出液清亮无色，最后注入空气挤走脐带中的PBS。用止血钳夹住两端，吸取10ml预热的0．1％Ⅱ型胶原酶溶液，经针头缓缓注入脐静脉，使之充盈，再将脐带浸于装有PBS（37℃预先温育）的灭菌烧杯中，用灭菌的蜡纸盖上置于37℃水箱中消化30～45min。其间用镊子揉捏脐带2～3次，使内皮细胞与酶液的充分接触并促进内皮细胞脱落。消化完毕后，剪去脐带无针头端止血钳夹闭处，抬起另一端使酶液流入含血清培养基的烧杯中，终止消化。再用PBS溶液快速冲洗脐带2次。收集的液体1000r／min离心10min。吸弃上清和絮状物，加入3ml原代细胞生长液吹散细胞，转移到60mm培养皿中，置于37℃、含5％CO2的培养箱培养 鉴定：倒置显微镜下观察细胞的形态并摄片；培养皿中加入700μlTripleexpress消化液，放入培养箱中3min，收集消化液，1400r／min离心4min，弃上清，PBS磷酸盐缓冲液洗涤3次，加入10μl直标抗人CD34单克隆抗体，闭光室温孵育30min，上机读数。 经CD34流式细胞仪鉴定，与空白组相比，加入抗体的内皮细胞呈红色荧光。 第VIII因子抗原检查：因第VIII因子只存在于内皮细胞、巨核细胞和血小板中，故它可作为内皮细胞的鉴定。第VIII因了抗原检查包括：1.免疫荧光法。免疫荧光法可见内皮细胞的细胞质呈黄绿色荧光，核周尤其明显，包核清楚，细胞轮廓清晰。2.免疫组化法。免疫组化法结果可观察到内皮细胞的细胞质内呈棕黄色沉淀，以核周最为明显，胞核不着色，细胞界限清楚。 CD144为内皮细胞特异性标志，常用检测方法有免疫细胞化学法、反转录聚合酶链反应检测及Western blot检测法。CD​144免疫细胞化学阳性细胞染色表现为胞膜着棕黄色颗粒；反转录－聚合酶链反应检测人脐静脉内皮细胞目的基因CD144有较强表达；Western blot检测传代的人脐表脉内皮细胞，显示高表达CD144，表明内皮细胞的特性保存完好。 CD34免疫组织化学染色：CD34是一种细胞分化抗原和选择素的配体，自从发现血管内皮细胞有CD34的基因表达后，常被用来标记血管内皮细胞。由于CD34阳性表达强于第VIII因子，因此，它被认为是目前血管内皮细胞最可靠的标记。CD34免疫组织化学染色显示，原代及传代细胞的细胞质内均有阳性染色，细胞轮廓清楚，阴性对照无此反应，证实所培养的细胞为脐静脉内皮细胞。 倒置相差显微镜观察：人脐静脉内皮细胞在4h时可见部分细胞贴壁，伸出伪足。24h时，细胞完全贴壁，并呈单层排列，边界清楚，为圆形、短梭形或扁平多角形。4~5d融合成单层，如铺路石镶嵌排列，有些细胞则呈鱼贯状相连，间有旋涡状排列。传代细胞生长较旺盛，可见核分裂象。随传代次数增加，细胞生长缓慢，呈纤维化、老化改变。 透射电镜下观察：透射电镜下，内皮细胞核膜清晰，细胞质内多微丝、微管结构，在少数细胞核周的细胞质中可见内皮细胞所特有的杆状小体，即Wei-bil-Palade小体，其为质膜所包裹，横切面呈圆形或椭圆形，内有微管样结构。Weibel-Palade小体在细胞质中检出，对内皮细胞鉴定具有特异性，但并非每个细胞皆能检出，故意义不大。 二.细胞冻存复​苏的原理，过程，原则 ： 1.细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。P77 2.细胞深低温保存的基本原理是：当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。在－70℃以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。（为了保持细胞株（系）遗传的稳定性以及非连续使用细胞的长期保存）细胞低温保存的关键，在于通过0~20℃阶段的处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。 冻存细胞时要缓慢冷冻。因为细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻时，细胞内外的水分都会很快形成冰晶，然后会造成细胞脱水使局部电解质浓度增高，PH值改变，部分蛋白质变性，引起细胞内部空间结构紊乱；细胞内冰晶的形成和细胞膜系统上蛋白质、酶的变性，引起溶酶体膜的损伤使溶解酶释放造成细胞内结构成分的破坏，线粒体肿胀、功能丧失并造成细胞能量代谢的障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体在冷冻中易发生破坏引起胞膜通透性的改变、使细胞内溶物丧失。细胞核内DNA也是冷冻时细胞易受损伤部分。如细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成DNA的空间构型发生不可逆的损伤性变化，而引起细胞的死亡。 在细胞冻存时要尽可能的均匀地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成是减少细胞损伤的关键。目前多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂。这两种物质在深低温冷冻后对细胞无明显毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高胞膜对水的通透性；加上缓慢冷冻方法可使细胞内的水分渗出细胞外，在胞外形成冰晶，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成所造成的细胞损伤。P78 3.细胞复苏：复苏细胞与冻存的要求相反，应采用快速融化的手段。这要可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化。避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害。（目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。） 4.冻存与复苏的步骤：P77 冻存：⑴最好选择对数生长期细胞，已经长满的细胞冻存复苏后生存率低。在冻存前一天最好换1次培养液。⑵用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则不需处理。依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管并计数，离心1 000 r/min，5 min。 (3)去除胰蛋白酶及旧的培养液，加人配制好的冻存培养液(含io%DMSO或甘油)，冻存液中细胞的最终密度为(5一10) x 10^6个/mL。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管或安瓶中，每只安瓶或冻存管加液1一1. 5 mL (4)冻存管必须旋紧确保密封。冻存管上应写明细胞的名称、冻存时间等信息。装人支架同时做好。(5)封好的冻存管即可直接冻存。4℃过夜——-20℃（过夜或者是2h）——-70℃（最好，有条件的话）——液氮（—196C）。 复苏：(1)从保存冻存管或安瓶的小袋内或支架上取出的冻存管或安瓶直接投人37C温水中，并轻轻摇动令其内容尽快融化。(2)从37℃水浴中取出冻存管，用乙醇消毒后开启，用吸管吸出细胞悬液，注人离心管并滴加10倍以上培养液，混合后低速离心，除去上清液，再重复用培养液洗1次。(3)用培养液适当稀释后，接种培养瓶，放人CO2培养箱静置培养，次日更换1次培养液，继续培养。如果复苏时细胞密度较高要及时传代。细胞复苏时细胞数可以做10- 20倍稀释，接种细胞密度以5X10^5个/mL为宜。 三．传代培养的注意事项：P63 1.细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面以前（80%），不要急于传代。 2.原代培养时细胞多为混杂生长，上皮样细胞和成纤维细胞并存的情况很多见，传代时不同的细胞有不同的消化时间，因而要根据需要注意观察及时进行处理。并可根据不同细胞对胰蛋白酶的不同耐受时间而分离和纯化所需要的细胞。另外，早期传代的培养细胞较已经建系的培养消化时间相对较长。吹打细胞时动作要轻巧尽可能减少对细胞的损伤。 3．首次传代时细胞接种数量要多一些，使细胞能尽快适应新环境而利于细胞生存和增殖。随消化分离而脱落的组织块也可一并传入新的培养瓶。 四、光学显微镜的分辨率与哪些参数有关 1.数值孔径、分辨率、放大率、焦深、视场直径、覆盖差、工作距离(物距)等等 2.显微镜的分辨率: 也称为分辨力，它是指能把两个物点辨清的最小距离，分辨距离越大，则分辨率越低。所以，分辨率是以分辨距离来表示的。 3.显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨力有关，分辨力是指显微镜（或人的眼睛距目标25cm处）能分辨物体最小间隔的能力，分辨力的大小决定于光的波长和镜口率以及介质的折射率，用公式表示为：R=0.61 λ /N．A． N．A．＝ｎsinα/2 式中：n=介质折射率；α=镜口角（标本对物镜镜口的张角），N.A.=镜口率。镜口角总是要小于180˚，所以sina/2的最大值必然小于1。λ波长 4.提高分辨率可采取以下措施: （1）降低波长λ值，使用短波长光源。（2）增大介质n值以提高NA值（NA=nsinu/2）。（3）增大孔径角u值以提高NA值。（4）增加明暗反差。 5、 成骨细胞的原代培养P127 成骨细胞包绕在硬组织中，致使处理困难，用骨组织块法、酶消化法、骨膜组织块法、骨髓培养法以及薄层骨片经EDTA处理并经胶原酶消化均可分离培养成骨细胞。 (1)取手术获得的骨标本，室温下用无菌生理盐水冲洗数次.如不能 立即使用，可浸泡于含12%胎牛血清及青霉素、链霉素的Ham's F12培养 液中，放在4℃冰箱过夜。 (2)用平衡盐液(含100 U/mL青霉素和100 N.g/mL链霉素)冲洗标本。 (3) 在培养皿中切下标本上的骨小梁，将骨小梁放人第二个皿。 (4) 加入10mHanks液浸没骨小梁。洗数次出去血污及脂肪 (5) 在25cm2培养瓶中加入2ml完全培养液，在CO2孵箱中培养20min使培养液匀化，必要时可用CO24.5%的NAHCO3或者HCL调PH值。 (6) 把骨小梁组织切成1~3mm3的碎块。 (7) 在与培养瓶中出去培养液，重新加入2.5ml新鲜Ham’s F12培养液移入25~40个骨小梁组织培养瓶竖放或瓶底向上，用组织接种环将骨小梁碎块均匀地铺散在培养瓶底壁上，培养2h后轻轻将瓶翻转向下，继续培养5~7d，观察细胞生长状况，酌情换液，以避免组织块从瓶底脱落，移动瓶是要缓慢。 (8) 细胞长满时可除去组织块，用胰蛋白酶消化离心收集细胞，传代培养。 六、单克隆抗体的制备过程，原理，制备的抗体有什么作用：8.4 杂交瘤技术主要是由免疫动物、细胞融合、筛选杂交瘤细胞、克隆化培养、单克隆抗体的制备与鉴定等一系列实验组成的实验系统，其核心部分是细胞融合。 (1) 免疫动物及细胞融合:为了获得单克隆抗体，首先需要用特定抗原免疫纯系动物以获得分泌预定抗体的B淋巴细胞。然而这种B淋巴细胞不能在体外长期培养。利用细胞融合技术可使短寿命的抗体形成细胞与能永久生长的同种骨髓瘤细胞系融合获得永生。 细胞融合过程，先是细胞质融合，然后通过有丝分裂细胞核合二为一，形成新的杂交细胞。在通常情况下，两个细胞接触并不发生融合现象，因为各自有完整的细胞膜。但是，在某些诱导物如聚乙二醇(PEG)的作用下，细胞膜可发生溶解，促使两个或多个细胞融合成巨细胞。 杂交瘤细胞就是在聚乙二醇的促融作用下，将分泌预定抗体的B淋巴细胞同具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合成为杂交瘤细胞。这种杂瘤细胞获得了双亲本细胞的特性，既有分泌预定抗体的能力，又有无限繁殖的能力。然而，在细胞融合过程中，除了形成杂交瘤细胞外，还可能存在B淋巴细胞与B淋巴细胞、骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞形成的融合细胞以及未融合的亲代细胞。在这些细胞中，脾脏细胞体外培养lOd左右会自行衰亡，对杂交瘤细胞生长无影响。而未融合的骨髓瘤细胞或其自身融合物，由于生长速度快，往往会抑制已融合的杂交瘤细胞生长。因此，必须进行选择培养，通常采用的是HAT培养系统。 (3)克隆化培养:生长繁殖的杂交瘤细胞并非每个都能分泌预定的抗体。因此，必须利用免疫荧光检测技术、免疫酶测定技术等手段，筛选出稳定分泌预定抗体的杂交瘤细胞。为了保证分泌抗体单一性，还必须通过有限稀释法或琼脂培养法进行多次克隆化培养，这样就可以用来大量制备单一、特异的单克隆抗体，供鉴定和试验使用。 (4)单克隆抗体的大量制备与鉴定:获得稳定分泌预定抗体的杂交瘤细胞株后，即可根据需要大量制备单克隆抗体。制备单克隆抗体的方法有两类:一类是动物体内诱生法，即将杂交瘤细胞接种于同系小鼠或裸鼠腹腔内，经一定时间，动物腹腔内产生含单克隆抗体的腹水;另一类是体外培养法，如悬浮培养系统，即采用转瓶或发酵罐式的生物反应器以及中空纤维细胞培养系统和微囊化细胞培养系统。 最后，进一步分离和纯化单克隆抗体，鉴定单克隆抗体类型及亚类，测定抗体亲和力以及相应抗原的分子量等。 应用：1．检验医学诊断试剂：作为检验医学实验室的诊断试剂，单克隆抗体以其特异性强、纯度高、均一性好等优点，广泛应用于酶联免疫吸附试验、放射免疫、免疫组化和流式细胞仪等技术。并且单克隆抗体的应用，很大程度上促进了商品化试剂盒的发展。目前，应用单克隆抗体制作的商品化试剂盒广泛应用于：①病原微生物抗原、抗体的检测；②肿瘤抗原的检测；③免疫细胞及其亚群的的检测；④激素测定；⑤细胞因子的测定。 2．蛋白质的提纯：单克隆抗体是亲和层析中重要的配体。将单克隆抗体吸附在一个惰性的固相基质（如Speharose 2B、4B、6B等）上，并制备成层析柱。当样品流经层析柱时，待分离的抗原可与固相的单克隆抗体发生特异性结合，其余成分不能与之结合。将层析柱充分洗脱后，改变洗脱液的离子强度或pH，欲分离的抗原与抗体解离，收集洗脱液便可得到欲纯化的抗原。 3． 肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术：将针对某一肿瘤抗原的单克隆抗体与化疗药物或放疗物质连接，利用单克隆抗体的导向作用，将药物或放疗物质携带至靶器官，直接杀伤靶细胞，称为肿瘤导向治疗。另外，将放射性标记物与单克隆抗体连接，注入患者体内可进行放射免疫显像，协助肿瘤的诊断。目前单克隆抗体主要为鼠源性抗体，异种动物血清可引起人体过敏反应。因此，制备人-人单克隆抗体或人源化抗体更为重要，但此方面仍未取得明显进展。 细胞传代： 贴壁生长的细胞用消化法传代；部分贴壁生长但贴附不牢固的细胞也可用直接吹打传代；悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心沉淀后再分离传代，或直接用自然沉降法吸除上清后，再吹打传代。 贴壁细胞的消化法传代步骤： ②以25 cm2培养瓶为例，向瓶内加人1 mL消化液(胰蛋白酶或与EDTA混合液)轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，然后吸掉或倒掉消化液后再加1 mL新的消化液，轻轻摇动后再倒掉大部分消化液，仅留少许消化液。也可不采用上述步骤，直接加1 -2 mL消化液进行消化，但要注意尽量减少消化液的剩余量，因为消化液过多对细胞有损伤， 同时也需较多的含血清培养液去中和。 ③消化最好在37℃或室温25℃以上环境下进行，消化2-5 min后把培养瓶放置显微镜下进行观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即终止消化。 ④如仅用胰蛋白酶可直接加含血清的培养液，终止消化。如用EDTA消化，需加Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶把残留EDTA消化液冲掉，然后再加培养液，这个操作过程要十分小心，如果细胞已经脱壁则消化液不能倒掉，以免细胞丢失。要加人Hanks液或培养液终止消化，吹打收集细胞悬液，离心漂洗去除EDTAo ⑤用弯头吸管，吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，吹打过程要顺序进行，从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有底部都被吹到。吹打时动作要轻柔不要用力过猛，同时尽可能不要出现泡沫，这些都对细胞有损伤。细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。 ⑥计数，分别接种在新的培养瓶内。 (2)悬浮细胞的传代:因悬浮生长细胞不贴壁，故传代时不必采用酶消化方法，而可直接传代或离心收集细胞后传代。直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清吸掉I/2 }2/3，然后用吸管吹打形成细胞悬液后，再传代。悬浮细胞多采用离心方法传代，即将细胞连同培养液一并转移到离心管内，离心800一1 000 r/ min , 5 min，然后去除上清，加新的培养液到离心管内，用吸管吹打使之形成细胞悬液，然后传代接种。部分贴壁生长细胞，不经消化处理直接吹打也可使细胞从壁上脱落下来，而进行传代。但这种方法仅限于部分贴壁不牢的细胞，如Hela细胞等。直接吹打对细胞损伤较大，导致较大数量的细胞丢失，因此绝大部分贴壁生长的细胞均需消化后，才能吹打传代。 六、单克隆抗体的制备的原理及详细过程，制备单抗体有什么作用 应用：作为诊断试剂：单克隆抗体在诊断的应用上，具有准确、高效、简易、快速的优点。 用于治疗疾病和运载药物疗效高、毒副作用小的新型药物――“生物导弹” 七、SC分类P137 1．干细胞：指具有无限制分裂能力，同时可分化成特定表型的细胞，在细胞生物发育阶段属于原始时期阶段的细胞。 2.分类：全能干细胞（胚胎干细胞）、多能干细胞（成体干细胞）、单能干细胞 3.全能干细胞：指具有完全能力的细胞，每个细胞均可发育成一个完整的生物个体。在生物发育学里，当精子和卵子结合成为受精卵后，一个受精卵分裂成为两个完全相同的细胞，两个细胞分裂成为四个细胞、八个细胞，在此时期，八个细胞中任何一个细胞单独放入成熟女性子宫中均可发育成为单独且完整的个体，这种细胞即称为全能性干细胞。 4．全能干细胞：胚胎干细胞继续进行分化，形成具有特定功能的干细胞，这些专门化的干细胞统称为多能干细胞。多能性不能像全能性一样，可发育成为完整的生物个体，因为有部分发育能力受到限制。在胎儿、儿童和成人组织中存在的多能干细胞统称“成体干细胞”。如血液干细胞可分化成白细胞、红细胞和血小板，皮肤干细胞可形成各种不同类型的皮肤细胞。 5．单能干细胞：也称专能、偏能干细胞，这种细胞是发育等级最低的干细胞。这类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的成肌细胞。 八、胚胎SC的分离 培养 鉴定 应用 原代培养 1.获取早期胚胎：不同动物获取早期胚胎的时间不同，主要考虑以下方面因素：①所取胚胎在条件允许的情况下，细胞尽可能地多。②在体外易于培养增殖并能保持多能性，小鼠一般取2.5－3.5d桑葚胚；猪取9－10d囊胚或孵化胚；牛取6－7d桑葚胚；水貂取6－7d桑葚或囊胚；人取7－8d囊胚。除从动物体内直接获取新鲜胚胎外，体外受精所得胚胎与核移植所得的重构胚变可作为ES细胞分离克隆的原。 分离：早期胚胎按分离ES细胞的传统方法是将胚胎从子宫中取出后在饲养层上培养至附植阶段，此时将透明带脱去胚胎贴于滋养层细胞之上，待早期胚胎内细胞团(inner cell mass, ICM)增.殖到一定程度在解剖显微镜下用玻璃针剥离挑取ICM，然后用消化液把ICM离散成小细胞团，中和后，接种于新鲜饲养层上，以后根据情况进行克隆传代或冷冻保存或其他细胞操作。 步骤：1.获取胎鼠成纤维细胞：将雌鼠与雄鼠合笼，次日见阴栓者记为0. 5 d，取10}14d的胎鼠，去除胚胎头和内脏，无菌PBS漂洗2遍，用眼科剪充分剪碎，转移到50 mL的离心管中，加入20一30 mL细胞消化液(PBS液，含o. 25胰蛋白酶，0. 04%EDTA)37℃轻轻震荡消化约30 min，过200目细胞筛,PBS离心漂洗2次，重悬细胞并接种，按普通方法传代，冻存，备用。换液时收集细胞上清液，4 000 r/min离心15 min，过滤后使用。 (2) MEF滋养层的制备:取80%融合的MEFs，加入10μg/mL丝裂霉素C，在CO2孵箱中孵育2h，加人细胞消化液，再用饲养层细胞培养液中和并吹打成单细胞悬液，调整细胞密度到4x10'个/mL，在六孔板中每孔加人3 mL，置CO2孵箱中待用。 (3)获取胚胎生殖细胞:取10d的胎鼠，在解剖显微镜下借助显微外科器械，于其腰能部寻找并分离生殖峪，再转移到胰酶中，用细口径吸管吹打，把生殖峪消化成单细胞悬液，以o. s个胚胎/孔转移到饲养层细胞上，加入胚胎干细胞培养液(a一MEM, 10%胎牛血清，5%小牛血清，1 mmol/L丙酮酸钠，2 mmol/L非必需氨基酸，2 mmol/L左旋谷氨酞胺，100 U/mL, bFGF)置于CO2孵箱中。 (4)胚胎生殖细胞的常规培养:每日更换培养液，接种lOd左右，选择鸟巢状并分化明显的细胞集落，按照常规手工挑克隆的方法选择并传代，或者使用Fercoll液配制成细胞分离液，常规消化后进行梯度离心，选择含原生殖细胞最多的部分再进行分离，最后接种在新的饲养层细胞上。 [胚胎生殖细胞的鉴定] W形态观察:胚胎生殖细胞的胞体较大，呈圆形，直径约15一18 dam, 胞核大，胞核内的物质折光性强，胞体可见伪足伸出;集落表现出胚胎干 细胞集落的特有形态，呈鸟巢状突起在饲养层细胞上‘，集落内细胞边界 不清，但集落和饲养层细胞的界限却清晰可辨。选择典型的集落进行追 踪观察。 (2)AKP染色:4%甲醛溶液固定后，把新配制的染色液(NBT; BCIP 稀释液)按照说明书的方法加人，常温下染色5 min后镜下检查，阳性细 胞为蓝紫色细胞。 (3)诱导分化:采用无血清培养液按照常规方法培养，或延长细胞换 液间隔，由每日换液改成每2日换液，诱导干细胞的分化，可观察到多种 细胞形态。 培养：离散后的ICM在饲养层上有足够满足其生长增殖需要的培养基存在情况下，小鼠一般23 d就会形成一个ES细胞集落，这就要求宇时传代否则ES细胞就会分化和变异。传代时应挑取充分增殖而又未分化的集落，用消化液同时辅以玻璃针剥离，使其又一次离散接种于新鲜饲养层上。ES细胞具有无限增殖传代的特性，但由于培养条件的不完善或其他 可能原因，目前除小鼠外其他动物的ES细胞都较难无限传代下去。 一方面为了促进ES细胞的分裂增殖，另一方面又要抑制ES细胞的分化，为了解决这一矛盾人们除应用经过灭活的饲养层细胞外，还常在基础培养液中添加一些细胞因子(cytokines )。细胞因子是主要由免疫细胞受抗原或丝裂原刺激后分泌产生的激素样蛋白质，具有调节细胞功能的作用。在ES细胞培养传代过程中常用的细胞因子有:白细胞抑制因子、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、干细胞因子、胰岛素样生长因子一1、一种双萜类物质等等。 ES细胞像其他细胞一样可以在体外冻存，E5细胞冷冻保存方法与普通培养细胞冻存方法基本相同，但需要注意的是在ES细胞的冷冻过程中一般都要求与饲养层成纤维细胞一并冷冻，以便提高解冻后的存活率和再形成克隆集落的能力。 鉴定：P152 1、形态学及生长行为鉴定 胚胎干细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，细胞体积小，核大有一个或几个核仁。细胞中多为常染色质，胞质结构简单，散布着大量核糖体和少量线粒体，核型为正常整倍体。 ES细胞在体外分化抑制培养的过程中呈克隆状生长，有明显的聚集倾向，集落形似鸟巢细胞，界限不清，集落周围有时可见单个ES细胞和分化的扁平状上皮细胞。 2、碱性磷酸酶染色 碱性磷酸酶( alkaline phosphatase, AKP)的存在是细胞保持未分化状态的一个重要指标，ES细胞中含有丰富的AKP，而已分化的ES细胞AKP呈弱阳性或阴性。 3、胚胎特异性表面杭原的检测 在胚胎的原始外胚层细胞、ES细胞、EC细胞和原始生殖细胞的表面均有胚胎特异性表面抗原(SSEA一1)的表达。SSEA一1检测是一种间接荧光染色法。 4、Oct一4转录因子表达产物的检测 转录因子oct一4在多能胚胎干细胞和原始生殖细胞中表达，当全能细胞分化形成体细胞或胚外组织时，oct一4基因则不再表达，原始生殖细胞是原肠胚形成之后唯一表达Oct - 4基因的细胞。 5、核型分析 ES细胞与EC细胞不同的是其具有稳定正常的二倍体核型，这是ES细胞能够进行体外一系列操作的一个很重要的特征。因而具有稳定的二倍体核型是ES细胞的特征之一。核型分析采用标准的染色体核型分析方法。 6、体内体外分化实验 体内分化实验，吧尸就是把ES细胞一集落离散后按一定浓度(一般为10^6—10^7个/mL)注射到裸鼠(即免疫缺陷鼠)的皮下，观察有无组织瘤的出现。待瘤长到肉眼可见时(从注射ES细胞到组织瘤的取出大约需要3一6周)，处死小鼠取出组织瘤做切片，如果是E5细胞，则组织瘤所做切片应包含代表三个胚层的细胞。 7、嵌合体的制备 能否参与胚胎发育，并最终形成包括生殖系在内的嵌合体，是衡量ES细胞全能性的另一个指标。将ES细胞通过聚合法或注射法与受体胚胎相结合，在体外发育至一定阶段后移植到假孕母体内，如果该细胞具有全能性，则就会得到嵌合体动物。嵌合体动物可以通过皮毛颜色、蛋白质DNA指纹、同工.酶等进行检测。目前多种动物都已获得ES细胞参与形成的嵌合体，但真正能参与生殖系传递，即能产生功能性配子的嵌合体仅在小鼠实验中得到。 应用：生产克隆动物；生产转基因动物；用于器官组织移植 用于细胞治疗：胚胎干细胞最诱人的前景和用途是生产组织和细胞，用于“细胞疗法”，为细胞移植提供无免疫原性的材料。 [胚胎生殖细胞的鉴定] (1)形态观察:胚胎生殖细胞的胞体大，呈圆形，直么约为15－18μm，细胞核大，胞核内的物质折光性强，胞体可见伪足伸出；集落呈鸟巢状，集落内细胞与细胞间的分间不清楚，但集落与滋养细胞的界限却十分清晰。 (2)碱性磷酸酶（AKP）染色:先用4%的甲醛溶液固定后，把新配制的染色液（NBT:BCIP稀释液）按照说明书的方法加入，常温下梁色5min钟后，镜检，阳性细胞为蓝色细胞。 (3)诱导分化: 采用无血清培养液按照常规方法培养，或延长细胞换液间隔，由每日换液改为每2日换液，诱导干细胞的分化，可观察到多种细胞形态。 用于生物研究 试验用玻璃瓶泡碱 再泡酸 （WHY？） 提供细胞生长的玻璃表面不但要清洗干净，而且要带适当的电荷。苛性碱清洗剂会使玻璃表面带的电荷不适合于细胞附着，需以HCL或硫酸中和。 12