用分光光度法绘制标准曲线时应注意的问题

1996 年第 9 卷第 4 期 甘肃环境研究与监测 总第 36 期 用分光光度法绘制标准曲线时应注意的问题 刘东梅 (兰州炭素厂环境监测站　　兰州海石湾　　730084) 摘 　要 　叙述了影响标准曲线质量的各种因素 ,并提出了提高标准曲线质量应注意的几 个问题。 关键词 　标准曲线 　影响因素 　问题 1 影响标准曲线质量的因素 1. 1 　单色光纯度不够〔1〕 光度法中要求在最大吸收峰处测定吸光 度 ,因此要求光度计的有效谱带宽度越窄越 好 ,有利于获得纯度高的单色光 ,当单色光纯 度不够 ,即有效谱带宽度不够窄时 ,测定的吸 光度偏低 ,浓度越高 ,测得的吸光度偏低越 多 ,致使标准曲线上端向下弯曲。 1. 2 溶质随溶液浓度变化而出现电离、解离 或聚合的程度 ,或与显色剂生成有色物的配 位数发生改变 ,会使光度法测定不符合比耳 定律〔1〕。 1. 3 比色皿的厚度或光学性能不一致〔1〕。 如果装试剂空白液的比色皿较其它比色 皿薄或对光的吸收和反射少一些 ,则曲线的 延线与纵坐标相交 ;反之 ,与横坐标相交。因 为各测点i : = Ai - A0 ,当装空白液的比色皿 较薄时 ,A0 值偏低 , Yi = Ai - A0 值偏高 ,反 之 , Yi 值偏低。 1. 4 显色反应和反应条件的问题〔1〕。 当显色反应的灵敏度不高时 ,被测物低 于某一浓度就不能显色 ,当浓度不同时 ,溶液 对光的吸收、散射的程度不同 ,低浓度段往往 弯曲 ,加上浓度高时部分胶体颗粒的聚沉 ,致 使测定的吸光度降低 ,曲线上端向下弯曲。 1. 5 操作上的原因。 例如褪色反应 ,显色溶液的颜色不稳定 , 易褪色 ,若比色时间超过了稳定时间 ,标准系 列中高浓度溶液颜色减褪 ,致使曲线上端向 下弯曲。因此应控制好显色剂的加入时间 , 可以每加 3 份 ,停 3～3min ,再加上 3 份 ,依 次进行 ,以使每支比色管的显色时间相近。 1. 6 干扰物质的影响。 2 　提高标准曲线质量还需解决的几个问题 2. 1 　经空白校正后所得的零坐标点是否应 参加回归计算 按书中要求 ,曲线应包括“经空白校正后 就得零坐标点”,因为标准曲线是由以原点开 始的 X0 及随后的 X1 X2 ⋯⋯Xn 的坐标点组 成 ,如果在相关分析和回归分析中包括了零 坐标点 (X0) ,则所得相关系数和回归方程是 代表 X0～Xn 这条完整线段的。而笔者通过 实践认为 :在绘制标准曲线时也应具体问题 具体分析 ,如果低浓度段未见明显弯曲 (无 “拐点”)时 ,零坐标点应按特定的零浓度点参 加回归计算 ,其一 ,可加大样本容量 ,增加曲 线的相关性 ,其二 ,对于空白溶液和接近空白 溶液浓度的样品 ,应用回归方程计算浓度时 , 显得更加合理。而如果有“拐点”时 ,零点不 参加回归计算效果更好。例如 :1993 年我们 做了一条氰化物曲线就是这种情况。见表 1。如果零点参加回归 , 相关系数 r = 0. 9993 , ;如果零点不参加回归 , r = 0. 9998 ,而 截距 a 相差不多 ,可见 ,零点不参加回归的相 关性更好 ,这种情况有时也会常碰到 ,需要指 出的是 :在进行痕量分析时 ,例如用原子吸收 84 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 测水中重金属含量时 ,零坐标点必须参加回 归计算 ,因为从 X0 - X1 这一段常是痕量分 析结果所在的线段 ,包括空白溶液在内的低 浓度段比高浓度更接近于“理想溶液”,不必 顾虑低浓度段在进行光度法测定时不符合比 耳定律。总之 ,如果曲线的线性好 , r 值大 , 下端无“拐点”,零点参加回归对斜率的影响 不大 ,截距的数值略有减小 ,相关系数略有增 加 ;如果曲线下端有“拐点”,零点参加回归 后 ,效果反而不好。 　　　　　表 1 氰化物曲线 ni 1 2 3 4 5 6 7 异烟酸 xi 0. 20 0. 50 1. 00 2. 00 3. 00 4. 00 5. 00 吡唑啉酮比 yi 0. 007 0. 024 0. 070 0. 160 0. 250 0. 340 0. 421 色法 2. 2 斜率 b 的范围 : 书中只对 SO2 和 NOx 的斜率 b 做了规 定 ,而对水质监测并没有做详细说明 ,通过多 次方法验证确定出酚标准曲线斜率 b 的范围 为 0. 018～0. 022 ,单位为吸光度/ ug。(4 — 氨基安替比林直接光度法) 2. 3 截距 a 为何不等于零 ? 当用扣除空白溶液吸光度的数值 ( Y) 进 行回归时 ,理论上 a 应为零 ,但实际上截距 a 等于零的情况是很罕见的。试剂空白值 A0 , 如果只是一次测定值 ,可靠性就差一些 ,如进 行平行测定 ,取其平均值 ,可以减少误差 ,即 使是取平均值 ,它和标准系列中其它各试管 的试剂空白值也不会完全一致 ,在进行空白 校正即 Yi = Ai - A0 时 ,不能完全抵消 ,加上 各测点的测定 (包括试剂空白值) 都存在误 差 ,尤其是高浓度段测点误差影响较大 ,能改 变曲线的走向 ,使其偏离坐标原点 ,产生截 距。另外 ,在回归运算过程中 ,经数据取舍 , 也能引入误差。总之 ,截距是误差造成的。 系统误差减至可接受的程度后 ,随机误差总 是存在的 ,因此截距一般不为零 ,若存在显著 的系统误差或操作失误 ,测得的 a 值较大时 , 应找出原因后 ,重新绘制标准曲线。 2. 4 测定结果的估算 : 当采用回归方程式估算结果时 ,可以采 用以下 : Y = bx + a ,对于浓度低的样品 , 当截距略大时 ,用此公式算出来的结果偏低 , 甚至是负值 ,在实际工作中并不能说明问题。 例如 : 1995 年我们做了一条酚曲线 : Y = 0. 0166 + 0. 0204X , r = 0. 9999 ,用此曲线测定 考核样虽然合格 ,但在实际工作中测定我厂 煤气站洗涤水中酚含量时结果全是负值或未 检出 ,这个结果让我们无法接受 ,而书中也并 未对酚曲线中 a 值做出规定 ,同一吸光度采 用另一条曲线却可以监测出结果来 ,在实际 工作当中我们常碰到此种情况 ,同一曲线虽 然适用于考核样 ,但却不适宜实际工作中。 这就说明在实际工作中 ,待测物浓度低的情 况所占的比例较大 ,直接用回归方程式计算 低浓度样品的结果是不妥的。即然截距是误 差造成的 ,就应对这个误差的后果进行检验 , 看看回归线的截距 a 与坐标原点 (0 ,0) 之间 是否有显著性差异 ,如经检验并无显著性差 异 ,说明 a 和 0 之间的差异是随机误差造成 的 ,此时截距 a 对零点来说并无实际意义 ,可 以作零处理 ,公式 Y = bx + a 可以简化为 Y = bx ,用此公式计算测定结果不会出现负值。 2. 5 回归直线的精密度 为了进行 a = 0 的假设检验 ,需计算出回 归线的剩余标准差 Sf ,在一元线性回归分析 中 ,可以用 Sf 来描述回归直线的精密度 ,进 而对 Y 值作近似的区间估计。Sf 是试验的 实测点围绕回归线离散程度的量度。计算公 式如下 : Sf = 1 (n - 2)Σ n i = 1 ( Yi - Yi) 2 = (1 - r2) S(yy) n - 2 94 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net = (1 - r2)〔ΣY2 - (ΣY) 2/ n n - 2 式中 : ( Yi - Yi)是实测值 Yi 与最佳值 Yi 之差 , S ( rr) 是因变量 Yi 的差方程。线性好 时 ,相关系数大 ,Sf 小 ,精密度好。 2. 6 回归直线的统计检验 : 此处仅提及 a = 0 假设检验 ,先计算出统 计量 t ,t = | a - a0| Sf 1/ n + (x2/ S(xx) 然后确定显著性水平α,查 t 分布表 ,从 而得出结论 ,截距 a 与 0 之间有无显著性差 异。在实际工作中 ,存在着 Sf 的代表性问 题 ,对于指定的监测项目 ,当采用指定的方法 时 ,计算统计量 t 的公式中 , n、x、s (测点数、 自变量平均值、自变量差方和) 都是常数 ,统 计量 t 值与 a 的绝对值成正比 ,与 Sf 成反比。 例如表 2 是两条标准曲线的统计量。 表 2 　两条标准曲线的统计量 曲线一 ,精密度差 曲线二 ,精密度好 n 8 8 Sf 0. 00336 0. 00151 a 0. 00347 0. 00252 t 1. 609 2. 66 结论 t < t0. 05 (6) , α1 与 O 无显著差异 , 可以作零处理 t > t0. 05 (6) α2 与 O 的差异显著 , 不可以作零处理 t (0. 05 (6) = 2. 447 　　显然 ,这样的结论是不能接 受的 ,它不合理。众所周知 ,在 t 检验中 ,当 Sf 很大时 ,无显著性差异的结论是不一定可 靠的 ;同理 ,当 Sf 很小时 ,有显著性差异的结 论也不一定可靠。根据经验 ,一般说来 ,水质 监测标准曲线的回归方程中 ,截距 | a | < 0. 009 为宜。这样 ,原标准曲线中所含的误差 不大 ,计算所得回归方程将 a 作零处理后 ,即 可用于计算未知样的测定结果。 对于成熟的分光光度法 ,在实践中 ,确实 截距 a 的数值较小 ,但如果没有对 a 给出控 制限 ,当 a 较大时 ,也都采用简化公式或回归 方程式计算 ,则会导致显著误差或得到负值 结果 ,会使分析人员难于解释。因此笔者建 议对水质的常规监测方法 ,通过调查及检验 , 也应该确定统一的对截距的控制指标 ,这样 做无疑是有益的。 2. 7 　标准曲线上可疑值的检验。 标准曲线上可疑值的检验共有以下五种 方法 : (在此本文不详细作一一说明) 1. 标准 化残差法〔2〕规定残差 di 即 ( Yi - Yi) 的控制 限 ;3. 将残差从吸光度换算为待测物的含量 △Xi ,规定 △Xi 的最大允许值作为控制限 ;4. 规定相关系数应大于 0. 999 ;5. 残差循环检 验法。(此法有利于提高标准曲线的精确 性。) 2. 8 　分区加权回归方法 现行标准曲线回归方法中存在着影响回 归直线精确度的问题 ,主要表现在各测点对 于统计量的相对偏差分布不均匀 (相对偏差| ( Yi - Yi) / Yi | ×100 %的标准差偏大) ,低浓 度区远大于高浓度区 ,回归得到的标准曲线 用于样品 (特别是低浓度样品) 的测定 ,会仅 因使用此曲线而造成误差。针对这一问题产 生的原因 ,可以采用分区加权回归方法确定 标准曲线方程 ,加重了低浓度区对标准曲线 的影响 ,有利于各测点 (特别是易产生较大相 对偏差的低浓度测点) 对于统计量的相对偏 差均匀分布 ,且使总体相对偏差Σ〔( Yi - Yij22/ Yi〕)减少 ,可提高测定的准确度 ;由于 采用了分区加权和浓度与权相联系的方法 , 使权的分配更趋合理 ,避免了过分加大低浓 度区测点的权数而导致高浓度区测点对于统 计量的相对偏差过大的现象 ,较好地解决了 上述问题。 2. 9 　多条标准曲线的精密度检查 我站 6 人在做考核样时共做 6 条标准曲 线 (每人一条)这就要求考查标准曲线的精密 度 ,因为多次测定的平均值的标准误差 Sx 与 标准差 Sx 成正比 ,与测定次数 n 的平方根成 反比。当测定次数 n 从 1 次增加到 5 次时 , Sx 的数值下降显著 ,以后 n 再增大时 , Sx 下 05 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 降缓慢 ,一般取 n = 6。《环境水质监测质量 保证手册》第 280 页介绍 ,经 S1 = S2 、b1 = b2 、 a1 = a2 的假设检验后 ,若无显著性差异 ,可将 两条标准曲线合并成一条共同的曲线。在多 条曲线中对两条差别最大的曲线进行 S、b、a 的检验后 ,若无显著性差异 ,可将多条标准曲 线合并成一条相同曲线。由于检验方法与结 论和剩余标准差的大小有关 ,常规监测中采 用此法时应注意剩余标准差的代表性。我们 可以用合并变异系数作为多条标准曲线精密 度的控制指标。若 6 条标准曲线各自的斜率 b、截距 a 及相关系数 r 皆符合要求 ,将各测 点吸光度分别取平均值 ,计算标准偏差及变 异系数 ,按下式计算合并变异系数 MCV %。 MCV % = (n1 - 1) (cv1) 2 + (n2 - 1) (cv2) 2 + ⋯⋯(nj - 1) (cvj) 2 (n1 + n2 + n3 + ⋯⋯nj) - j 式 中 :J 为测点数 ,n 为测定次数。 当 n1 = n2 = n3 ⋯⋯nj 时 , MCV % = (n - 1)Σ(CV) 2 j (n - 1) 一般较成熟的分析方法 ,可规定合并变 异系数大于 5 % ,有的方法重复性略差 ,可要 求小于 10 % ,如果多条曲线的合并变异系数 小于规定的数值 ,取各测点吸光度的平均值 与自变量 x 进行回归计算 ,可以得到一条共 同的回归线。 综上所述 ,要想绘制出合格的标准曲线 , 并非易事 ,必须把以上各个方面的条件都考 虑进去 ,即对标准曲线的绘制也实行质量控 制 ,只有这样 ,才能得出理想的标准曲线。这 也是做好监测质量保证工作的一个重要方 面 ,同时也是保证监测结果的一个重要环节。 随着环境监测工作的不断深入 ,对监测数据 的质量要求越来越高 ,使之越来越多的监测 工作者从事和研究分析质量保证的工作。另 外 ,国家也三令五申地指示抓好环境保护工 作 ,这就要求我们环境监测工作者在实际工 作中确实做到监测结果准确、可靠、严格把好 质量关。 参考文献 1、武汉大学分析化学教研室编《分析化学》下册 , P197 - 201 ,人民教育出版社 1997) 。 2、潘秀荣《分析化学准确度的保证和评价》P、191 ,计量出 版社 1985) 。 15 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. 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