Ⅱ型糖尿病与非糖尿病大鼠骨质疏松中TGF-β1蛋白表达变化研究_关和宇

收稿日期:2012 － 03 － 21 基金项目:国家自然科学基金面上项目(30973021) 作者简介:关和宇(1974 －)，男，辽宁沈阳人，副主任医师，研究方 向:糖尿病与骨质疏松相关研究。 通讯作者:李旭(1972 －)，男，辽宁沈阳人，副教授，硕士研究生导 师，研究方向:骨关节外科，骨肿瘤，骨质疏松。 和 39． 66%，呈逐渐增高之势，可见随着有手术、化疗等创 治疗手段的增加，其脾虚证的发病率逐渐增高，与肝胃不和 证相反，与气血两虚证不同，应当引起我们的注意。 表 2 ～ 4 按 P≤0． 05，以 OR值大小排序来看，术前呈正 相关的是卡氏评分;术后化疗前呈正相关者分别为:术后化 疗间歇期服用中药、化疗次数、组织学分级。呈负相关:外 科切缘;术后化疗后呈正相关的依次是:淋巴结转移、卡氏 评分;呈负相关:化疗、病理类型。现分述如下。 (1)卡氏评分以正相关的形式分别入选于术前、术后 化疗后之中，此结果也见诸于气血两虚证中，与临床实际不 符，有待于进一步研究。术后化疗前或化疗间歇期服用中 药呈正相关，从其服用中药与否的命名及量化处理来看，1 =是，2 =否，故在术后化疗前或化疗间歇期服用中药，则脾 虚证减少，反之则增加;此种结果也被胃癌术后化疗前、后 气血两虚证和术后肝胃不和证所证实，可见在化疗间歇期 服用中药，是变被动恢复为主动干预的有力举措，应当加以 提倡，而随着化疗次数的增加，脾虚证也增加与临床实际相 符，其理易明，无需赘言。 (2)从组织学分级命名及量化处理来看:1 = 无法评 估、2 =高分化、3 =中分化、4 =中高分化、5 =低分化、6 =未 分化，因组织学分级与术后化疗前呈正相关，故高分化者脾 虚证少，低分化和未分化者脾虚证多，与肝胃不和证不同， 机理不明，有待于进一步研究。 (3)外科切缘有 3 种情况:1 =外科切缘干净;2 =外科 切缘镜下阳性;3 =外科切缘肉眼阳性。因外科切缘与术 后化疗前脾虚证呈负相关，故外科切缘干净者脾虚证多， 而切缘肉眼阳性者脾虚证少，其结果有待于进一步临床证 实。至于淋巴结转移、化疗方案和病理类型，其理详见胃 癌气血两虚证的前瞻性队列研究及相关因素的 logistic 回 归分析。 在 Logistic回归分析结果中，偏回归系数为正者，表示 其该变量与因变量呈正相关，若偏回归系数为负者则为负 相关，对于中医辨证而言，呈正相关者，对证候有诊断意义， 呈负相关者，对证候无诊断意义。可见，对于统计结果的分 析应当密切结合临床实际才可能得出正确的结论。 参考文献 ［1］ 马娟，王克穷，叶峥嵘．胃癌辨证调查表编制的客观控制［J］． 陕西中医，2010(1):67 － 68． ［2］ 朱文铎．证素辨证学［M］．北京:人民卫生出版社，2008:90． 第 30 卷 第 8 期 2 0 1 2 年 8 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 30 No． 8 Aug． 2 0 1 2 中 华 中 医 药 1727 学 刊 Ⅱ型糖尿病与非糖尿病大鼠 骨质疏松中 TGF － β1 蛋白表达变化研究 关和宇1，2，李旭1 (1．中国医科大学，辽宁 沈阳 110001;2．沈阳市骨科医院，辽宁 沈阳 110044) 摘 要:目的:观察链尿佐菌素(STZ)诱导糖尿病大鼠与非糖尿病大鼠骨组织中 TGF － 1 蛋白表达及骨密度 的变化。方法:将 60 只 Wistar大鼠随机分为对照组、非糖尿病组和链尿佐菌素(STZ)诱导Ⅱ型糖尿病组。取各 组大鼠股骨，用免疫组化的方法测定测定股骨中 TGF － β1 蛋白表达，用 XR －26 型双能 x线骨密度仪测大鼠离体 股骨上 1 /3 骨密度。结果:(1)与对照组比较，非糖尿病组和 II 型糖尿病组血中的 GLU、甘油三酯(TG)、低密度 载脂蛋白胆固醇(LDL)、总胆固醇(TC)含量明显升高(P ＜ 0． 05)，而 Ca2 +明显下降(P ＜ 0． 05);(2)与对照组比 较，非糖尿病组和Ⅱ型糖尿病组股骨骨组织中 TGF － β1 蛋白表达上调(P ＜ 0． 01)。结论:STZ 诱导的Ⅱ型糖尿 病模型股骨骨组织中 TGF － β1 蛋白表达上调，并伴有血脂代谢紊乱，表明Ⅱ型糖尿病可能通过 TGF － β1 蛋白表 达上调来促进股骨骨质疏松病情的发展。 关键词:转化生长因子 β1;总胆固醇;Ca2 +;骨质疏松;股骨骨组织 中图分类号:R781． 64 文献标识码:A 文章编号:1673 － 7717(2012)08 － 1727 － 03 Study on Changes of TGF － β1 Protein Expression in Osteoporosis of Type II Diabetes and Non －Diabetic Rats GUAN He-yu1，2，LI Xu1 (1． China Medial University，Shenyang 110001，Liaoning，China;2． Shenyang Orthopaedics Hospital，Shenyang 110044，Liaoning，China) Abstract:Objective:To observe TGF － β1 protein expression and the changes of bone mineral density in bone tissue 7271 第 30 卷 第 8 期 2 0 1 2 年 8 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 30 No． 8 Aug． 2 0 1 2 中 华 中 医 药 1728 学 刊 of diabetic rats induced by streptozocin(STZ)and non － diabetic rats． Methods:Sixty Wistar rats were randomly divided into control group，non － diabetic group and the streptozocin(STZ)－ induced diabetic group． The femur of the rats was taken and TGF － β1 protein expression of the femur was measured with the method of immunohistochemical determina- tion，and then the bone density of the one third of rat femur in vitro was measured with the XR － 26 dual energy x － ray absorptiometry． Results:Compared with control group，the GLU，triglycerides(TG)，low density lipoprotein(LDL)and total cholesterol(TC)of blood in non － diabetic group and type II diabetes had an evident increase(P ＜ 0． 05) ，while Ca2 + had an evident decrease(P ＜ 0． 05)． Compared with control group，TGF － β1 protein expression of femoral bone tissue had been significantly increased in non － diabetic group and type II diabetes group(P ＜ 0． 01)． Conclusion:There is an evi- dent increase in the TGF － β1 protein expression of femoral bone tissues in STZ － induced type II diabetes model，accom- panied by dyslipidemia，which indicates that type II diabetes may promote the femur osteoporosis through the increase of TGF － β1 protein expression． Key words:transforming growth factor β1;total cholesterol;Ca2 +;osteoporosis;femoral bone tissue 骨质疏松(osteoporosis)是以骨量减少、骨的微观结构 退化为特征的，致使骨的脆性增加以及易于发生骨折的一 种全身性骨疾病之一。Ⅱ型糖尿病是非胰岛素依赖型糖尿 病，Ⅱ型糖尿病是胰岛素的相对缺乏同时伴有胰岛素抵抗 等因素引起的，治疗上不完全依靠胰岛素的补充。但Ⅱ型 糖尿病常常伴有严重的骨质疏松症状。转化生长因子 － β (transforming growth factor － β，TGF － β)是属于一组新近发 现的调节细胞生长和分化的 TGF － β超家族。本实验就是 探讨 TGF － β1 蛋白表达对Ⅱ型糖尿病骨质疏松的机理实 验研究。 1 材料和方法 1． 1 实验动物与分组 选择 SPF级 Wistar 大鼠 60 只，雄性，18 个月龄，体重 (300 ± 50)g。由上海斯莱克实验动物有限公司提供，动物 合格证号:SCXK(沪)2011 － 0026。随机分为 3 组:对照组 20 只(基础饲料)、实验组 A20 只(饲喂高糖高脂;高糖高 脂组)、实验组 B20 只(饲喂高糖高脂 +链尿佐菌素、STZ; Ⅱ型糖尿病组)。各组喂养到 4 周时，实验组 B 大鼠 1 次 性腹腔注射 STZ 25 rag /(kg·Bw)(STZ溶于柠檬酸一柠檬 酸钠缓冲液，所配浓度为 10g /L);腹腔注射 STZ后的第 6、8 周时行采血，以血糖值≥16． 7mmol /L为达到造模。 1． 2 主要试剂与仪器 生化分析仪(ROACH P800 罗氏)、STZ 由美国 Sigma 公司产品提供，DAB显色剂试剂盒由上海活乐生物技术有 限公司提供，大鼠低密度载脂蛋白胆固醇(LDL)、总胆固醇 (TC)、甘油三酯(TG)、GLU、Ca2 +由罗氏提供，10% EDTA 脱钙液、甲醛、苏木素、伊红、酒精，大鼠 TGF － β1 抗体 (Takara)，辣根过氧化物酶标记的羊抗大鼠抗体(Takara)， 硝酸纤维素膜(Takara)。 1． 3 标本采集及制备 麻醉状态下，取腹主静脉血，做生化检测;取左肢全股 骨，剔除肌肉保留骨膜，用生理盐水冲洗，锡纸包裹，置 － 80℃冰箱冻存，用来检测骨密度。取右后肢股骨头，剥离肌 肉及结缔组织，生理盐水冲洗，用研钵加入液氮下无菌老虎 钳夹碎研磨，研磨后放入 1mL Trizol 的 EP 管内，置 － 70% 冰箱冻存待做 Real － Time Quantitative RT － PCR。 1． 4 指标检测及其方法 1． 4． 1 用 Raoch P800 检测生化指标 腹腔注射 STZ 后的 第 8 周时，用戊巴比妥钠(Sodium pentobarbital)配制的浓度 3mg /mL，1mL /100g体重，即 30mg /kg 腹腔注射进行麻醉。 将大鼠放在大鼠的手术台上，用抗凝血生化采血管取大鼠 尾静脉的静脉血，Raoch P800 测量血糖，以血糖值≥ 16. 7mmol /L为达到造模标准。造模成功后饲养两周后禁 食 24 h，用戊巴比妥钠(Sodium pentobarbital 30mg /kg 腹腔 注射)麻醉，腹静脉采血，测定空腹载脂蛋白胆固醇(LDL)、 总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、GLU、Ca2 +。 1． 4． 2 股骨骨组织 TGF － β1 蛋白表达 放入 4%多聚甲 醛中，进行蛋白固定。放置 4 周，放入脱钙液中(EDTA 脱 钙液配制:EDTA 10g，PBS缓冲液(pH 7． 2)100mL，加 NaOH 搅拌溶解后，用 1mol /L HCL调 pH至 7． 2，再加甲醛 15mL) 放置 4 周。 (1)进行骨包埋切片:包埋:新配置 7 ∶ 3 比例的甲基丙 烯酸甲酯和甲基丙烯酸丁酯内加 0． 5%的过氧化苯甲酰， 放入适当的三角烧瓶中，混合后放入 70℃温箱预聚，置入 40℃烤箱中聚合 1 天以制备瓶底;将浸润好的标本按照切 片要求放在包埋盒，加入适量的新鲜预聚合溶液，室温下过 夜，次日置入 40℃烤箱，聚合 2 ～ 3 天，将包埋块与铝箔盒 分开，再进行修块、切片。 (2)脱钙骨片常规脱蜡至水:脱蜡、脱水程序:二甲苯 I 1h、二甲苯 II 1h、100%乙醇 15min、100%乙醇 15min、95% 乙醇 5min、85%乙醇 5min、75%乙醇 5min、70%乙醇 5min、 蒸馏水 3min。 (3)免疫组化:免疫组织化学染色检测骨组织 TGF － β1 蛋白表达，A 切片脱塑处理后 B 抗原修复 C 滴加 5% BSA 封闭液，室温 20min。甩去多余液体，不洗 D 滴加 1 ∶ 150 稀 释的一抗(抗大鼠 TGF － β1抗体)，37℃孵育 1h，PBS(pH7． 2 ～7． 6)冲洗，2min × 3 次;E 滴加生物素化羊抗大鼠的二抗 IgG，20 ～37℃孵育 20min，PBS(pH7． 2 ～ 7． 6)冲洗，2min × 3 次;F滴加试剂 SABC，20 ～ 37℃ 20min。PBS(pH7． 2 ～ 7． 6) 冲洗，5min ×4次;G滴加试剂 DAB显色剂显色。取 1mL蒸 馏水，加试剂合中 A、B、C试剂各 1 滴，混合后加至切片。蒸 馏水洗涤。H脱水透明 I封片:中性树胶封片。 每只大鼠选取 8 张连续的股骨切片，每张切片随机选 择 5 个视野，以 CMIAS多功能真彩色病理图像分析系统测 定各视野阳性细胞积分光密度值，染色越深、阳性细胞越多 则密度值越大，比较各组间的均值。 8271 第 30 卷 第 8 期 2 0 1 2 年 8 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 30 No． 8 Aug． 2 0 1 2 中 华 中 医 药 1729 学 刊 2 结 果 表 1，各组大鼠处死前空腹血生化检测统计结果显示: 与对照组比较，实验组 A 和实验组 B 血中的 GLU、甘油三 酯(TG)、低密度载脂蛋白胆固醇(LDL)、总胆固醇(TC)含 量明显升高(P ＜ 0． 05)，而 Ca2 +明显降低(P ＜ 0． 05);与 实验组 A相比，实验组 B血中甘油三酯(TG)、低密度载脂 蛋白胆固醇(LDL)、总胆固醇(TC)含量无明显变化(P ＞ 0． 05)，虽说有所改变，但是无统计学意义。 表 1 各组大鼠处死前空腹血生化检测指标(mmol /L)的变化(珋x ± s) 组别 n GLU Ca2 + 甘油三酯 (TG) 低密度载脂蛋白胆固醇 (LDL) 总胆固醇 (TC) 对照组 20 5． 35 ± 0． 58 2． 81 ± 0． 28 0． 52 ± 0． 14 0． 2 ± 0． 03 1． 28 ± 0． 13 实验组 A 20 8． 67 ± 3． 71* 2． 62 ± 0． 35* 0． 91 ± 0． 52* 0． 7 ± 0． 05* 2． 46 ± 0． 37* 实验组 B 20 19． 67 ± 2． 43* 2． 41 ± 0． 13* 0． 83 ± 0． 35* # 0． 5 ± 0． 02* # 2． 30 ± 0． 21* # 注:与对照组比较，* P ＜ 0． 05;与实验组 A比较，# P ＞ 0． 05。 如图 1 和表 2 所示，实验组 B 与对照组和实验组 A 比 较，离体股骨组织中 TGF － β1 蛋白表达显著上调(P ＜ 0. 01);实验组 A与对照组比较，离体股骨组织中 TGF － β1 蛋白表达无明显变化(P ＞ 0． 05)，无统计学意义。 对照组 实验组 A 实验组 B 图 1 各组大鼠股骨股组织 TGF － β1 受体蛋白表达(× 400) 表 2 各组大鼠股骨组织 TGF － β1 受体 蛋白表达平均光密度值 组别 n MOD 对照组 20 0． 196 ± 0． 021 实验组 A 20 0． 213 ± 0． 013# 实验组 B 20 0． 297 ± 0． 024* 注:与对照组相和实验组 A 比，* P ＜ 0． 01;与对照组相比， # P ＞ 0． 05。 3 讨 论 糖尿病系全身性代谢紊乱，不仅包括糖、脂、蛋白质三 大营养物质的代谢异常，也涉及水盐电解质及骨矿代谢异 常，糖尿病患者由于胰岛素减少和作用减弱，成骨细胞数目 减少［1］，活性降低，使成骨作用减少，从而发生不同程度的 骨量减少。骨质疏松是一种以骨量减少及骨组织显微结构 破坏为特征的全身代谢性疾病。骨质疏松症发生后，骨的 脆性增加，骨折的危险性升高［2 － 3］。近来有多项研究认为 骨质疏松症影响骨折愈合，引起骨痂形成量减少，骨痂中骨 密度减低，生物力学性能下降。 饲喂高糖高脂 +链尿佐菌素(STZ)是建立Ⅱ型糖尿病 的经典模型［4 － 5］，是研究Ⅱ型糖尿病的相关疾病的基础。 本实验证明，Ⅱ型糖尿病中离体股骨组织中 TGF － β1 蛋白 表达上调，加速骨质疏松的形成。 转化生长因子 β(transforming growth factor ，TGF － β) 是一类多肽生长因子，属于 TGF 超家族［6］，TGF － β1 存在 于骨基质中，在大鼠长骨细胞中，TGF － β1 减少了骨吸收 并且抑制维生素 D介导的骨吸收［7 － 9］。骨质疏松患者 TGF － β1 检验变异率明显高于正常人，表现为骨转换增加、骨 量明显丢失。证明 TGF － β1 蛋白的表达和骨质疏松症有 密切关联。 参考文献 ［1］ Dieudonné SC，Foo P，van Zoelen EJ，et al． Inhibiting and stimulating effects of TGF － beta 1 on osteoclastic bone resorption infetal mouse bone organ cultures［J］． J Bone Miner Res，1991， 6(5):479 － 487． ［2］ 付永伟，和红兵，欧炯光．实验性糖尿病牙周炎骨丧失动物模 型研究［J］．实用口腔医学杂志，2009，25(1):13 － 17． ［3］ 洪丽莉，许冠荪，申国明． SD 大鼠 2 型糖尿病模型的建立 ［J］．中国比较医学杂志，2005，6:379 － 381． ［4］ 青少汀，葛宝丰，徐印坎．实用骨科学［M］．北京:人民军医出 版社，1999． ［5］ 吴阶平，裘法祖．黄家驯外科学［M］．北京:人民卫生出版社， 1999． ［6］ 付永伟，和红兵，欧炯光． 牙周炎与糖尿病关系的研究进展 ［J］．云南医药，2007，28(1):73 － 76． ［7］ 刘梅，张君，王旭霞．糖尿病大鼠牙槽骨骨密度与全身骨密度 变化的相关实验研究［J］． 华西口腔医杂志，2009，27(4): 4451 － 454． ［8］ 李霞，程珏，孙克勤．结扎丝法构建大鼠实验性牙周炎模型的 研究［J］．首都医药临床医学，2007，7:34 － 35． ［9］ 付承英．组织病理学实验教程［M］．北京:科学出版社，2005: 5 － 6． 9271