微流控芯片子宫_李伟萱

檵檵檵檵檵檵檵檵 檵 檵檵檵檵檵檵檵檵 檵 殝 殝殝 殝 研 究 快 报 DOI: 10． 3724 /SP． J． 1096． 2013． 30023 微流控芯片子宫 李伟萱 梁广铁 严 伟 张 琼 王 维 周小棉 刘大渔* (广州医学院附属广州市第一人民医院检验科研究室，广州 510180) 摘 要 由于体外环境对受精和胚胎发育的影响，现有人工辅助生殖技术存在受精成功率低和胎儿出生后 风险高的问题。针对上述问题，本研究发展了一种基于微流控芯片的人工子宫，其特色在于使用子宫内膜细 胞-胚胎共培养机制，并以连续灌流方式实现细胞与外界物质交换。实验利用上述芯片完成了排卵、受精、着 床以及胚胎发生等一系列过程。与传统方法相比，芯片方法不仅操作简便，而且可以获得更高的桑椹胚率和 囊胚率。已经取得的研究结果显示，这种芯片子宫有希望发展成人工辅助生殖的有力工具。 关键词 微流控芯片;子宫;共培养;受精;胚胎 2013-01-09 收稿;2013-02-26 接受 基金项目:国家自然科学基金(Nos． 81171418，81271730)、国家国际科技合作项目(No． 2010DFB33880)、广州市医药卫生科技项目 (Nos． 201102A213046，201102A212028，20121A021002)资助 * E-mail:ruark@ 126． com 1 引 言 辅助生殖技术的应用使得不育夫妇得以实现妊娠生子的愿望，由不育引发的相关问题也随之得到 解决。体外受精-胚胎移植(In vitro fertilization-embryo transplantation，IVF-ET) ，即试管婴儿，是辅助生 殖技术的重要内容。该技术是指将从母体取出的卵子体外受精并发育成前期胚胎后移植回母体子宫 内，经妊娠后分娩婴儿［1，2］。历经 60 余年的发展，IVF-ET 已经得到广泛推广并成为治疗不孕症的主要 手段。尽管 IVF-ET取得了巨大成功，该技术仍存在许多不足，其中最突出的问题包括妊娠率低、多胎妊 娠发生率明显增高和出生后缺陷风险增高［3］。究其原因，主要是由于现有细胞培养技术不能有效模拟 体内条件，因而影响了胚胎质量。因此，现实医疗工作中迫切需要一种能够模拟子宫环境，保证高质量 受精和胚胎发育的细胞培养技术。 微流控芯片是组织、器官仿真的有力工具［4 ～ 9］。一方面，微流控通道具有与体内微血管相似的尺 寸，在这个尺度下流体所具有的层流特性便于实现精确的流体控制;另一方面，通过芯片材料和芯片结 构设计，可以有效模拟组织或器官的结构和功能。前期研究报导了一系列基于微流控芯片的精子分选、 受精以及胚胎发育等单元操作技术［10 ～ 13］。在这些工作基础上，微流控芯片技术有望实现子宫的整体功 能以促进胚胎发育和提高胚胎质量［14，15］。本工作设计了一种微流控芯片子宫，保证在类似子宫内部的 环境下实现排卵、受精和胚胎发生。初步结果显示，芯片子宫较之传统细胞培养平台可以获得更高的桑 椹胚率和囊胚率。 2 实验部分 2． 1 实验材料 细胞呈像使用倒置荧光显微镜(IX71，Olympus) ;TS-2A 四通道独立可控式微量注射泵(保定兰 格) ;聚碳酸酯(Polycarbonate，PC)薄膜(8 μm 滤孔，英国 Whatman公司) ;SU8 3025 光刻胶(美国 Micro- Chem公司)。聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)前体及引发剂，30 mm 培养皿(美国 Dow Corning公司)。3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyl triethoxysilan，APTES)、PBS 、M16 培养基、明胶 及透明质酸酶(美国 Sigma 公司)。矿物油、二甲基亚砜(上海生工(上海)有限公司)。CellTracker Green和 CellTracker Red(美国 Life Technologies公司)。成年昆明小鼠购自广东省动物实验中心;小鼠 第 41 卷 2013 年 4 月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究快报 Chinese Journal of Analytical Chemistry 第 4 期 467 ～ 472 子宫内膜上皮细胞、子宫内膜上皮细胞培养基购自中国齐氏生物科技有限公司。孕马血清促性腺激素 (Pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)、人绒毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotrophin，HCG) 购自杭州动物药品厂。精子洗液 PureSperm Wash(瑞典 Nidacon international AB 公司)。实验用水为二 次蒸馏水。 2． 2 芯片结构与加工 芯片包含 3 层结构，顶层和底层为 PDMS而中间层为多孔 PC膜(图 1a)。PDMS层采用标准软刻蚀 工艺［16］加工。首先在平板玻璃上完成 SU-8 模板的制作。取直径为 3 英寸的玻璃置于浓 H2SO4-H2O2 (3∶ 1，V /V)中煮沸 30 min，取出后用蒸馏水冲洗 3 次，并在蒸馏水中超声清洗 2 次，每次 30 min。超声 后的玻璃用氮气吹干，备用。将洁净玻璃置于匀胶台，向其中心处滴加 SU8 3025 光刻胶，匀胶机转速为 600 r /min，持续 30 s，升高转速至 1000 r /min，再持续 30 s。铺胶后的玻璃置于烘胶台上进行前烘，95 ℃ 烘 15 min。待玻璃自然冷却后，用掩膜覆盖玻璃面的 SU-8 胶层，置于紫外光刻机下曝光 20 s。曝光 后立刻将玻璃置于烘胶台上 95 ℃烘 15 min。待玻璃自然冷却后将其置于显影液中，轻轻震荡进行显 影，之后用电吹风将其吹干。最后，将模板置于 175 ℃烘箱中烘 1 h，进行坚模以得到 SU-8 模板。将 Sylgard184 单体与引发剂按体积比 10:1 混合均匀，导入 SU-8 模板，将模板置于真空气缸内真空脱气。 脱气后置于 80 ℃烘箱固化 1 h，自然冷却后将 PDMS从模板上剥离，剥离后在入口和出口处打孔。芯片 顶层含有宽 500 μm，高 110 μm蜿蜒形通道，通道中交错分布一系列用于捕获卵细胞的弧形筛网，筛网 直径 150 μm，由 6 根直径 35 μm 的微柱围成。芯片底层含有 4 个平行的矩形通道(6 mm × 3 mm × 110 μm) ，两端与共同的入口和出口连接。通道底面具有 4 × 3 微柱阵列用于支撑 PC 膜。PC 膜处理按 照文献［17］的方法，将 PDMS 层等离子处理后与 APTES 处理的 PC 膜封接，步骤如下:①将需要封接的 PDMS及 PC膜 表面氧等离子处理 1 min;②等离子处理后的 PC 膜浸泡于 5% APTES 溶液中 20 min; ③将 PC膜取出，用蒸馏水冲洗3次，以去除表面未结合的APTES，氮气吹干薄膜;④将PDMS与PC膜 图 1 a．芯片结构立体示意图;b．芯片结构截面图说明芯片对于子宫结构的仿真;c．芯片结构俯 视图及单个灌流培养单元放大图 Fig． 1 a． Schematic illustration of microchip;b． A section-view picture illustrating the microchip that mimics the uterus;c． A top-view picture showing the pattern of microfluidic channels (left)and an enlarged view of a single perfusion culture unit 864 分 析 化 学 第 41 卷 加压接触 1 h，实现两者的有效封接。 2． 3 生殖细胞和子宫内膜细胞的准备 IVF公鼠的选择、取精与精子处理［18］，具体方法:选择 8 周龄以上、体重大于 25 g、雄性特征明显的 公鼠，颈部脱臼致死，剖开腹部取出附睾及输精管，用小镊子挤压附睾尾部使精子挤入 1 mL 平衡过夜 的精子洗液滴中，去掉附睾组织，将此液滴置于 37 ℃、5 % CO2、饱和湿度条件下培养 20 ～ 25 min，使 精子自由浮动。精子获能操作参考精子洗液试剂盒说明书进行，具体方法:取 10 μL 上述初步孵育、分 散较好的活跃精子悬浮液加入到 50 μL平衡过夜的精子洗液滴中，用血细胞计数器计算精子浓度并调 整至 2 × 105 ～ 5 × 105个 /mL，将此精子悬浮液置于 37 ℃、5 % CO2 和饱和湿度条件下继续培养 2 h。 IVF母鼠的选择与处理参考文献［19，20］，具体方法:选择 6 周龄以上、体重大于 20 g 的健康母鼠， 每只母鼠腹腔注射 10 IU PMSG，间隔 48 h后再注射 10 IU HCG，间隔 13 ～ 17 h待用。将上述处理的母 鼠于注射 HCG后 13 ～ 17 h，取其输卵管置于 1 mL卵细胞洗涤液中，自输卵管壶腹部取出成熟卵冠丘 复合体(Oocyte-corona-cumulus complex，OCCC) ，用 0． 3 %透明质酸酶溶液处理去除卵丘细胞，再用 50 μL洗涤液冲洗 4 次，得到成熟裸卵。 小鼠子宫内膜细胞在培养瓶中进入指数生长期后收获并制成密度为 2 × 105 /mL的细胞悬液备用。 2． 4 芯片实验操作 芯片和聚四氟乙烯毛细管在使用之前 80 ℃烘烤 1 h，微量注射器在 75%乙醇中浸泡 6 h 后用灭菌 蒸馏水冲 3 次。使用前芯片、毛细管和注射器均置于紫外灯下照射，使用时在超净工作台上将芯片与注 射器通过毛细管连接。明胶用灭菌双蒸水配制成 0． 5%的溶液。部分实验中使用 CellTracker Green 标 记小鼠子宫内膜细胞，以 CellTracker Red 标记卵细胞。CellTracker 工作液使用二甲基亚砜新鲜配置。 细胞标记步骤如下:①收集细胞悬液后离心，吸取上清液，加入 CellTracker 染液于细胞悬液中至终浓度 10 μmol /L，37℃孵育 30 min;②将细胞离心，弃上清后加入 PBS 缓冲液，37 ℃孵育 10 min;③再次离心 并加入 PBS缓冲液洗涤细胞，目的在于清除未结合染料。用 CellTracker Green 标记细胞在荧光显微镜 下观察时用蓝光激发观察，而 CellTracker Red标记细胞用绿光激发观察。 芯片操作步骤如图 2 所示:(a)芯片通道出入口 1，4 开放，2，3 关闭。操作前先用 0． 5%明胶溶液 灌注芯片通道 2 min。微量注射泵抽取 20 mL子宫内膜细胞悬液从芯片进样通道缓慢注入，该步骤使子 宫内膜细胞沉积在上层通道的卵细胞捕获区。排出剩余细胞悬液后芯片静置于培养箱中静置 8 h 后， 用齐氏实验室配制的子宫内膜培养基以 10 μL /h流速灌流培养; (b)培养小鼠子宫内膜上皮细胞 24 h 后，芯片通道出入口 1，2 开放，3，4 关闭，以 10 μL /h流速引入小鼠卵细胞悬液以将卵细胞其捕获于微 筛网中;(c)继而以 10 μL /h流速向通道引入获能精子，保留 6 h 完成受精; (d)芯片通道出入口 3，4 开放，1，2 关闭，以 10 μL /h速度持续灌流 M16 胚胎培养液。实验期间每隔 24 h 在倒置显微镜下观察 芯片中胚胎的发育情况并拍照记录。 2． 5 芯片与传统方法对照实验 对照实验中，在直径 30 mm的培养皿中加入胚胎培养液 M16 100 μL，覆盖矿物油。每个液滴中约 含 5 个卵细胞。加入获能的精子，受精后把受精卵移到新的培养液滴中，每 24 h 更换一次培养液，直到 受精卵发育成囊胚。 芯片组的卵细胞样本总数为 292，对照组卵细胞样本总数为 295。比较芯片方法与传统方法在受精 率、4-细胞率、桑葚胚率和囊胚率方面的差别。其中，受精率、4-细胞率、桑葚胚率和囊胚率分别为发育 成 2-细胞体、4-细胞体、16-细胞体和 32-细胞体的受精卵占卵细胞总数的百分比。两组实验数据差异显 著性用 t检验分析。 3 结果与讨论 3． 1 微流控芯片设计 本研究借助微流控芯片细致模拟子宫的结构与功能，保证受精和胚胎发生过程在类似体内环境下 完成。子宫腔内衬子宫内膜，是直接与受精卵 /胚胎接触的部分。为模拟上述结构，研究设计了一种多 964第 4 期 李伟萱等:微流控芯片子宫 层微流控芯片，其特色在于以多孔薄膜材料支撑子宫内膜细胞生长，模拟子宫内膜结构(图 1b)。实验 选用孔径为 8 μm的 PC滤膜，一方面可以截留子宫内膜细胞，另一方面可以作为细胞培养的支撑并允许 培养液经由滤孔扩散为细胞及受精卵提供养分。子宫内膜细胞培养区的微筛网结构可以实现卵细胞定位 捕获，这样就模拟体内微环境建立了卵细胞 /胚胎-子宫内膜细胞共培养体系(见图 2)。此外，结合芯片内 部设计与外部控制，将卵细胞定位、受精和胚胎形成在芯片上集成，可以尽量减少外界对细胞的干扰。 图 2 明场与荧光合成图显示芯片上卵细胞与子宫内膜细胞的共培养 Fig． 2 A composite photo showing the co-culture of endometrial epithelial cells and zygote on microfluidic chip a．明场下芯片内的受精卵与子宫内膜上皮细胞;b． 子宫内膜上皮细胞荧光染色图(CellTracker Green 标记) ;c． 受精 卵荧光染色图(CellTracker Red标记) ;d． 合成图(放大倍数 10 × 10，标尺 100 μm)。 a． Endometrial epithelial cells and zygote on microfluidic chip (bright field) ;b． Fluorescence photo of endometrial epithelial cells (stained with CellTracker Green) ;c． Fluorescence photo of zygote (stained with CellTracker Red) ;d． A composite pho- to of a，b and c．(10 × 10，scale bar:100 μm)． 图 3 芯片操作步骤示意图(箭头表示液流方向) Fig． 3 Illustration of operation processes on microfluidic chip (arrows show the directions of fluid) (a)子宫内膜细胞沉积; (b)卵细胞定位捕获; (c)受精; (d)胚胎生成。 (a)Sedimentation of endometrial epithelial cells on porous poly- carbonate (PC)film; (b)Capturing of mouse oocytes; (c)Fer- tilization; (d)Embryo formation． 3． 2 芯片上细胞共培养机制的建立 如图 3 所示，在连接芯片出入口的 4 路微量注 射泵协同控制下，可以完成一系列细胞操作。首先 利用多孔滤膜截留子宫内膜细胞，继而用微筛网捕 获卵细胞。这样，卵细胞贴附于子宫内膜细胞层上， 模拟了排卵过程。贴附有子宫内膜细胞的滤膜模拟 子宫内膜结构，不仅对卵细胞起到支持、保护和营养 作用，还可以通过细胞连接建立细胞之间的通讯。 滤膜上的细胞藉由滤孔与底部的灌流培养液进行物 质交换，模拟了体内细胞与毛细血管之间的物质交 换形式。这种结合主动灌流与被动扩散的物质运输 形式，不仅避免了流体剪切力对于细胞的伤害，而且 还可以及时排除代谢产物，消除代谢物蓄积对细胞 生长发育的不利影响。这种包含细胞-细胞相互作用 以及细胞-外界物质交换作用的芯片共培养体系，有 效模拟了子宫内部的微环境。 3． 3 芯片子宫内的受精及着床 卵细胞培养 24 ～ 48 h 后，向芯片引入获能的小 鼠精子模拟受精过程。少量精子接触卵细胞后与其 结合，约 6 h后完成受精。受精后继续灌流培养，培 养液一方面为受精卵不断补充新的营养物质，另一方面可以及时排除代谢废物。受精后约 12 h 后能观 察到小鼠精卵细胞结合。受精卵经过连续多次分裂之后在 4 d内形成桑椹胚(16 细胞) ，后者在芯片通 道内继续分裂形成囊胚(32 细胞) ，大约在受精后 6 ～ 8 d进入子宫内膜层完成着床(见图 4)。 3． 4 芯片子宫与传统方法的比较 实验比较了芯片子宫与传统方法获得的 2-细胞率、4-细胞率、桑椹胚率和囊胚率，这些指标可以动 态地反映胚胎生成状况。在离体培养哺乳类动物(包括人)受精卵时发现，在一些化学成分确定的培养 074 分 析 化 学 第 41 卷 图 4 连续观察芯片上受精卵细胞 Fig． 4 Continuous observation of a fertilized ovum on microchip a． 0 h;b． 12 h (2-细胞) ;c． 72 h(16-细胞) ;d． 96 h(32-胞) (放大倍数 10 × 10，标尺 100 μm)。a． 0 h;b． 12 h (2-cells) ;c． 72 h (16-cells) ;d:96 h (32-cells) (10 × 10，scale bar:100 μm)． 基中受精卵往往不能发育到囊胚，而是停顿在某个特定的发育时期，这种现象被称作“发育阻断”。“发 育阻断”发生的具体机制尚不明了，分析可能是由于体外环境中存在不利于胚胎生成的因素。为了克 服胚胎体外发育阻断，实验在芯片上采用卵细胞与子宫内膜细胞灌流共同培养方法，提供高度仿真的微 图 5 芯片子宫与传统培养皿中胚胎形成的比较 Fig． 5 Comparison of embryo development in petri dish and microfluidic uterus * :p ＜ 0． 05，difference is significent compared with the control- group． 环境以促进胚胎发育。 结果显示，培养皿组的 2-细胞体，4-细胞体，桑椹 胚以及囊胚数目分别为 202，149，128 和 73，而芯片 组的对应数值为 206，200，159 和 122。芯片组受精 卵各时期地发育情况均优于培养皿组 (图 5)。虽然 两组的受精情况(2-细胞率)大致相当，但在胚胎逐 渐发育的过程中体现出明显差异。结果表明，芯片 组桑椹胚率和囊胚率明显高于培养皿对照组，以囊 胚率的提高最为显著。相对于传统的培养皿方法， 本研究发展的芯片子宫方法更有利于提高受精率及 囊胚率。与单纯的卵细胞培养相比，微流控芯片子 宫更有利于体外小鼠胚胎发育，分析其原因可能为: (1)子宫内膜上皮细胞模拟体内子宫内环境，可分泌 一些对早期胚胎发育有利的物质;(2)子宫内膜上皮 细胞可能通过与胚胎的相互作用促进其发育;(3)所 采用的灌流培养方法模拟了生理状态细胞与外界的物质交换形式，不仅为细胞提供充足的养分，还可 以及时清除对于胚胎发育不利的代谢产物。综上所述，研究通过在微流控芯片上细致仿真子宫的结构 和功能形成了一个类似于子宫的微环境。这种芯片子宫有利于卵细胞受精及受精后胚胎的生长发育， 并能得到质量较好的胚胎。该技术除可应用于人类生殖医学工程，还可为深入研究胚胎发育机制及动 物胚胎工程提供优质的胚胎，具有较为广阔的应用前景。 4 结 论 发展了一种微流控芯片子宫，通过使用子宫内膜细胞-胚胎共培养以及连续灌流方式细致模拟子宫 环境以促进胚胎生成。利用上述芯片子宫，完成了排卵、受精、着床以及胚胎发生等一系列实验过程。 芯片子宫不仅操作简便，还可以获得较之传统方法更高的胚胎形成率。我们的后续实验会将芯片子宫 发生的囊胚移植到动物子宫，直至发育成胎儿。 References 1 Reefhuis J，Honein M A，Schieve L A，Correa A，Hobbs C A，Rasmussen S A． Hum． Reprod，2009，24(2) :360 － 366 2 Lii J，Hsu W J，Parsa H，Das A，Rouse R，Sia S K． Anal． Chem．，2008，80(10) :3640 － 3647 174第 4 期 李伟萱等:微流控芯片子宫 3 Hansen M，Bower C，Milne E，de Klerk N，Kurinczuk J J． Hum． Reprod，2005，20(2) :328 － 338 4 HUO Dan-Qun，LIU Zhen，HOU Chang-Jun，YANG Jun，LUO Xiao-Gang，FA Huan-Bao，DONG Jia-Le，ZHANG Yu- Chan，ZHANG Guo-Ping，LI Jun-Jie． Chinese J． Anal． Chem．，2010，38(9) :1357 － 1365 霍丹群，刘 振，侯长军，杨 军，罗小刚，法焕宝，董家乐，张玉婵，张国平，李俊杰． 分析化学，2010，38(9) : 1357 － 1365 5 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Hospital， Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College，Guangzhou 510180，China) Abstract Due to the influence of environment in vitro，conventional human assisted reproduction technology associates the problems such as low fertilization rate and high risk of postnatal infants． To circumvent this issue，we developed a microfluidic chip based artificial uterus which features the co-culture of embryo and endometrial cells with perfusion flow． A series of steps related to embryogenesis， including ovulation， fertilization，implantation and embryo formation，were continuously implemented on the microfluidic chip． In comparison with conventional petri dish methods，the microfluidic uterus based protocol is simple in operation， and is able to achieve higher morulae rates and blastocyte rates． The results indicated that the developed microfluidic uterus may serve as a powerful tool for human assisted reproduction． Keywords Microfluidic chip;Uterus;Co-culture;Fertilization;Embryo (Received 9 January 2013;accepted 26 February 2013) 274 分 析 化 学 第 41 卷