犬脂肪基质干细胞复合珊瑚支架材料裸鼠皮下成骨的实验研究_沈海刚

收稿日期:2012 － 03 － 07 基金项目:浙江省自然科学基金资助项目(Y2080180) ;杭州市卫生 局重点科技项目(2003Z006) 作者简介:沈海刚(1969 －) ，男，浙江海宁人，副主任医师，硕士研 究生，研究方向:血管外科基础与临床研究。 ［7］ 侯高峰，隋勇，安立文．白细胞介素与慢性前列腺炎关系的研 究进展［J］．黑龙江医学，2005，29(12) :911 － 913． ［8］ Nadler RB，Koeh AE，Calhoun EA，et al． IL － l beta and TNF － alpha in prostatic secretions are indicators in the evaluation of men with chronic prostatitis［J］． J Urol，2000，164(l) :214 － 218． ［9］ Orhan I，Onur R，Ilhan N，et al． Seminal plasma cytokine levels in the diag － nosis of chronic pelvic pain syndrome． Int J Urol， 2001，124(8) :495 － 498． ［10］ 李树平，孟双艳，李锐．慢性非细菌性前列腺炎患者血清和 前列腺液 4 种细胞因子检测及意义［J］． 中华男科学杂志， 2006，12(1) :25 － 27． ［11］ Razumov SV，Medvedev AA，Chirun NV． Role of cytokines in the diagnosis of chronic prostatitis［J］． Urologiia，2003，Nov － Dec(6) :25 － 28． ［12］ 周晓辉，韩蕾，周智恒，等．免疫性慢性非细菌性前列腺炎大 鼠模型的形态学与分子生物学特性［J］． 中华男科学杂志， 2005，11(4) :290 － 295． ［13］ 朱辉，杨增明． 环氧合酶的研究进展［J］． 生理科学进展， 2004，35(1) :81． ［14］ 汪丙昂，李改丽．环氧合酶 2 的神经生物学作用［J］．中国临 床康复，2005，9(33) :133 － 135． ［15］ 高鹏，周君，白海燕． COX － 2 及其选择性抑制剂的研究现状 与展望［J］．天津药学，2002，14(2) :25 － 26． ［16］ 王勤章，王蓉，丁国富，等．膀胱癌中环氧化酶 － 2 的表达与 临床病理的关系［J］．中国现代医学杂志，2003，13(20) :32 － 34，38． ［17］ Mouithys MA，Deby DG，Dogne JM，et al． Effects of COX － 2 in- hibitors on ROS produced by Chlamydia pneum oniae － primed hum an prom onocytic cells(THP － 1) ［J］． Biochem Biophys Resccommun，2004，325(4) :1122 － 1130． ［18］ Pasqualotto FF，Aharma RK，Pottos JM，etal． Seminal oxidative stress in patients with chronic prostatitis［J］． Urology，2000，55 (6) :881 － 885． ［19］ 曾晓勇，叶章群，杨为民，等．塞来昔布治疗ⅢA型前列腺炎 的临床评估［J］．中华男科学杂志，2004，10(4) :278 － 281． ［20］ Nickel JC，pontari M，Moon T，et al． A randomized，placebo con- trolled，multicenter study to evaluate the safety and efficary of ro- fecoxib in the treatment of chronic nonbacterial prostatitis［J］． J Urol，2003，169(4) :1401 － 1405． ［21］ 王琦．王琦男科学［M］． 2 版． 郑州:河南科学技术出版社， 2007:641． 第 30 卷 第 7 期 2 0 1 2 年 7 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 30 No． 7 Jul． 2 0 1 2 中 华 中 医 药 1548 学 刊 犬脂肪基质干细胞复合珊瑚支架材料 裸鼠皮下成骨的实验研究 沈海刚1，李晔1，刘波2，袁捷3 (1．杭州市中医院外一科，浙江 杭州 310007;2．浙江省中医院，浙江 杭州 310006;3．上海市第九人民医院，上海 200011) 摘 要:目的:探讨犬脂肪基质干细胞(adipose derived stromal cells，ADSCs)作为种子细胞复合珊瑚支架材料 在裸鼠皮下成骨的可行性。方法:体外分离培养、成骨诱导、扩增犬 ADSCs，将第 2 代细胞接种于珊瑚支架上，形 成细胞 －材料复合物。倒置相差显微镜观测细胞形态，DIO染色后激光共聚焦荧光显微镜观察细胞在材料上的 生长状况，细胞材料复合物植于 8 只裸鼠右侧背部皮下作为实验组，在左侧对称部位植入单纯珊瑚支架作为对 照组。分别在移植后第 4、8 周取材，HE染色，进行组织学及组织形态计量学。结果:ADSCs倒置相差显微镜 下为成纤维细胞样梭形外观，与材料共培养后共聚焦显微镜可见细胞贴附于材料表面及孔隙内生长。HE 染色 显示，4 周时实验组可见新生骨组织形成;8 周时实验组新生骨组织形成增加。图像分析显示，两个时间点实验组 成骨量与对照组相比差异皆有统计学意义(P ＜ 0． 05) ;实验组第 8 周成骨量高于第 4 周，差异也具有统计学意义 (P ＜ 0． 05)。结论:犬 ADSCs作为种子细胞复合珊瑚支架材料可以在裸鼠皮下形成骨样组织。 关键词:脂肪基质干细胞;珊瑚;裸鼠 中图分类号:R －33 文献标识码:A 文章编号:1673 － 7717(2012)07 － 1548 － 03 Experimental Study of Subcutaneous Osteogenesis by Adscs with Coral Scaffolds SHEN Hai-gang1，LI Ye1，LIU Bo2，YUAN Jie3 (1． Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Hangzhou 310007，Zhejiang，China; 2． Zhejiang Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Hangzhou 310006，Zhejiang，China; 3． Shanghai Ninth People＇s Hospital，Shanghai 200011，China) 8451 第 30 卷 第 7 期 2 0 1 2 年 7 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 30 No． 7 Jul． 2 0 1 2 中 华 中 医 药 1549 学 刊 Abstract:Objective:This study was to investigate osteogenesis of canine ADSCs complex with coral scaffolds implan- ted subcutaneously． Methods:ADSCs were isolated and cultured in osteogenic － induced medium． The induced cells were complex with coral to co － culture． The ADSCs were observed under inverted microscope． The constructs were examined from confocal microscopy． The constructs were implanted into the subcutaneous tissue of the nude mice as experimental group，and the coral as control group． The engineered tissue was harvested in 4 and 8 weeks post － implantation and pro- cessed for HE staining，then evaluated by histology and histomorphometry． Results:The ADSCs appeared fibroblast － like under inverted microscope． Confocal microscopy showed ADSCs grew well on the coral． HE staining showed a small group of woven bone formation 4 weeks later in the experimental group，and more woven bone formation were observed 8 weeks later in the experimental group． Histomorphometry showed more woven bone formation in the experimental group than the control group at 4 and 8 weeks later(P ＜ 0． 05)． Conclusions:The ADSCs /coral composites implanted subcutaneously in nude mice could construct woven bone． Key words:adipose derived stromal cells;coral;nude mice 自脂肪基质干细胞被发现以来，体外实验已经证明在 合适的诱导条件下能够向成骨细胞表型分化的可能，因脂 肪基质干细胞具有取材容易，细胞获取量大，成为组织工程 种子细胞研究的热点［1］。我们的前期实验发现犬 ADSCs 在天然珊瑚支架上能够表达碱性磷酸酶(AKP)和骨钙蛋白 (OCN)等成骨的特异性蛋白质［2］。本实验验旨在探讨已 经在珊瑚支架上诱导分化的细胞在裸鼠皮下异位成骨的可 能性，为进一步的实验研究奠定基础。 1 材料与方法 1． 1 实验动物与主要实验试剂和仪器 Beagle 犬 1 只，1 岁龄，雄性，购自上海农学院;4 周龄裸鼠(品系为 BALB / c) ，共 8 只，(由上海第九人民医院动物实验中心提供和饲 养)。天然珊瑚支架材料由广州海洋研究所提供;Ⅱ型胶 原酶(美国，Worthington) ;地塞米松、β －磷酸甘油钠和 2 － 磷酸抗坏血酸(美国，Sigma) ; (美国，Biomedical technolo- gies) ;DMEM培养液(美国，GIBCO公司)、10%的胎牛血清 (美国，HYCLONE) ;胰蛋白酶、EDTA(华美生物工程公 司) ;恒温 CO2 培养箱(美国，Forma Scientific) ;倒置相差显 微镜(日本，Nikon ) ;激光共聚焦荧光显微镜(德国， ZEISS)。图像分析系统，包括 Nikon E600 研究用显微镜， Diractor Penguin 600CL数码影像采集系统，图像分析软件 包为 Image Pro Plus Ver． 4． 5，统计软件包为 SAS 6． 12。 1． 2 ADSCs的分离获取、诱导分化、培养扩增 无菌条件 获取犬腹股沟皮下脂肪组织。0． 01% Ⅱ型胶原酶消化 30min，1200g离心 5min，以 5 × 104个 /cm2的密度接种于培 养皿中，加含有地塞米松(10nmol /L)、β － 磷酸甘油钠 (2． 16g /L)和 2 －磷酸抗坏血酸(37． 5mg /L)的成骨条件培 养液，置 37℃、5%CO2培养箱内培养，24h 换液。待细胞融 合至 80%左右时，0． 25%胰蛋白酶消化传代，以 2 × 104个 / cm2接种，诱导培养至第 2 代。倒置相差显微镜下观察原代 及第二代细胞形态。 1． 3 细胞接种 珊瑚制备成 3mm × 3mm × 3mm 的立方 体，超声清洗，60Co照射灭菌备用。 将第 2 代 ADSCs细胞 20 × 106 /mL的细胞悬液接种密 度［3］接种于珊瑚材料上，确保材料被细胞悬液浸匀，接种 4h后加入成骨条件培养液，培养 7 天后回植，实验组共 8 块。未接种细胞的同等大小珊瑚材料 8 块作为对照。 1． 4 DIO标记细胞及激光共聚焦荧光显微镜观察细胞形 态 另将第 2 代诱导 ADSCs 收集后制成细胞悬液，将 DIO 用无水乙醇配成 2mg /mL的溶液，按 1μL /10M的浓度标记 细胞;标记前，将所需体积的 DIO 溶液用 10%胎牛血清 DMEM稀释 250 倍，加入 ADSCs 细胞悬液中，在 37℃、5% CO2培养箱中孵育 20min，1000r /min 离心 5min，弃上清，加 入 PBS冲洗，1000r /min 离心 5min，弃上清，重复 1 次。标 记细胞以 20 × 106 /mL 的接种密度滴入 3mm × 3mm × 3mm 大小的珊瑚，确保材料被细胞悬液浸匀。接种 4h后加入成 骨诱导培养液，隔天换液一次，细胞材料复合物于接种后第 1、3、5、7 天行激光共聚焦荧光显微镜观察，DIO 的激发波 长为 484nm，发射波长为 501nm。 1． 5 回植手术 共用 8 只裸鼠，在 SPF 级动物房的超净工 作台内进行。每只裸鼠经乙醚吸入麻醉后，所有植入操作 均在背部皮下选取，中线两侧各选 1 个部位。每只裸鼠一 侧植入 1 块细胞材料复合物作为实验组，另一侧植入 1 块 单纯材料作为对照组。植入材料后，严密缝合皮肤，关闭创 面。按照随机化原则，将实验动物分为两组，分别在术后 4 周及 8 周取材。 1． 6 组织学检测 术后 4、8 周时，各取 4 只裸鼠皮下局部 开创，取出实验组及对照组标本。4%多聚甲醛固定 4h 后，经 15%甲酸脱钙、浸蜡、透明、石蜡包埋后连续切片， 厚度为 5μm，制成组织切片，行 HE 染色，观察新生物形态 结构及新骨生成情况。 1． 7 形态计量学分析 术后 4 周实验组和对照组各 4 个 标本，术后 8 周实验组和对照组各 4 个标本，HE 染色后， 通过图像分析系统以真彩色分辨率 2776 × 2074 采集图像， 放大倍率为 × 100。每个标本切片取 5 个视野，应用软件 包计量新生骨小梁面积(Trabecular bone volume，TBV) ，以 × 100 下空白视野面积作为底数，测得的骨小梁面积占其 百分比的多少为最终结果，重复 3 次［4］。采用团体 t 检验 方法进行两两比较(实验组 4 周和 8 周之间，对照组 4 周 和 8 周之间，实验组 4 周和对照组 4 周之间，实验组 8 周和 对照组 8 周之间) ，进行统计学分析，定量检测新骨形成情 况。 2 结 果 2． 1 ADSCs形态观察 在倒置相差显微镜下，可见原代 9451 第 30 卷 第 7 期 2 0 1 2 年 7 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 30 No． 7 Jul． 2 0 1 2 中 华 中 医 药 1550 学 刊 ADMSCs呈球形悬浮于培养基中，24 后细胞贴壁生长，形态 逐渐呈成纤维细胞样长梭形外观(插页Ⅴ图 1A) ;细胞传 代后，第 2 代细胞形态稳定，亦为成纤维细胞样长梭形外观 (插页Ⅴ图 1B)。 2． 2 DIO标记细胞及激光共聚焦荧光显微镜观察 接种 后 24h细胞黏附于支架材料的实质部分或在孔的边缘上单 层排列，细胞呈均匀的绿色荧光(插页Ⅴ图 2A) ;接种后第 3 天，细胞数量明显增多(插页Ⅴ图 2B) ，至第 5 天孔中细 胞多层排列(插页Ⅴ图 2C) ;第 7 天细胞覆盖了大部分材料 表面充分伸展，融合成片，荧光强度未见减弱，细胞和其分 泌的细胞外基质充填于珊瑚的孔隙中，占据着大部分空间 (插页Ⅴ图 2D)。 2． 3 组织学及组织形态计量学分析 HE 染色示皮下植 入 4 周后，实验组珊瑚孔隙中大量的核深染细胞排列无序， 充满类骨质，有新生的幼稚编织骨形成(插页Ⅵ图 3A) ，对 照组为纤维结缔组织，有散在未降解的珊瑚微粒(插页Ⅵ 图 3B)。8 周时，实验组新生幼稚编织骨较 4 周时增多(插 页Ⅵ图 3C) ，对照组仍为纤维结缔组织(插页Ⅵ图 3D)。组 织形态计量学分析骨形成面积，实验组 4 周时成骨量达 (19． 5 ± 3． 8)%，8 周时成骨量增加为(28． 7 ± 5． 1)%。统 计结果显示，实验组 8 周时成骨量显著高于 4 周(P ＜ 0． 05) ，在两个时间点，实验组新骨形成面积都显著高于对 照组(P ＜ 0． 05)。在对照组 8 周时成骨量与 4 周时差异无 统计学意义(P ＞ 0． 05)。 3 讨 论 2001 年，Zuk 等［1］利用人吸脂术获得的脂肪组织成功 分离出一种成体干细胞，呈成纤维细胞样外观，称为 AD- SCs。文献报道由吸脂术获取的 1000 mL 人体脂肪组织中 可获得 5． 5 × 1010个细胞，这提示脂肪组织中间充质干细 胞数量较多、来源充足。另外，ADSCs 生长迅速，体外培养 的倍增时间为 16 h，经短暂的潜伏期后，细胞即进入对数 生长期［5］，是骨组织工程理想的种子细胞。 实验选用天然珊瑚作为支架材料，主要是因为该材料 具有适合细胞生长的良好结构，袁捷［6］等的研究表明天然 珊瑚的孔径和孔隙率分别为(150 ± 50)μm 和(57． 60 ± 1． 50)%，孔与孔之间都有小孔天然连通形成网络样空间结 构，类似于正常松质骨。此外，我们的前期实验证实犬 AD- SCs 在珊瑚支架上经过诱导，能够检测到碱性磷酸酶 (AKP)和骨钙蛋白(OCN)表达［2］。AKP 是成骨细胞分化 的标志，在体内钙化过程中起关键作用，其活性高低可反映 成骨细胞的成熟状况，AKP 活性越高，表明细胞向成骨细 胞分化的程度越高。OCN 是骨组织中成骨细胞合成的特 异性蛋白，是骨代谢细胞分化成熟，处于功能状态的标志， 可作为成骨细胞活动的标志性产物。因此本实验选用天然 珊瑚作为脂肪基质干细胞的载体进行异位成骨的构建。 诱导的犬 ADSCs 复合天然珊瑚支架，植入裸鼠皮下 后，通过组织学切片 HE 染色，证明植入后 4 周和 8 周时 有新骨形成。形态计量学分析显示，在任一时间段的实验 组成骨较单纯材料组都有显著提高，表明复合细胞后可促 进形成组织工程化骨。尽管结果表 ADSCs 复合天然珊瑚 支架可以在裸鼠皮下成骨，但 4 周及 8 周时出现的类骨质 新生的幼稚编织骨，没有成熟骨形成，未发现明显的骨改 建。出现以上结果的原因，考虑可能为以下因素，实验选用 裸鼠皮下这个异位成骨环境来构建组织工程化骨，基本排 除了应力刺激对骨生长的促进作用。力学环境是影响骨组 织结构和功能的重要因素，有学者认为，力刺激产生的应 变引起骨单位中细胞间液体的流动，以两种方式对细胞产 生作用，一方面是剪切力产生的剪应力，另一方面是离子 流动形成流动电压，从而引起细胞的反应，最终产生骨改 建［7］。体外实验发现培养的成骨细胞在适当频率和持续 时间的周期性载荷刺激下，其增殖与受力成正比，且此周 期性载荷能促进成骨细胞特异的碱性磷酸酶和骨桥蛋白的 表达增强［8］。体内实验中，研究者给鼠施加正畸治疗时发 现，牙本质基质蛋白 － 1(DMP － 1，与骨涎蛋白为同一家 族)在受力改建部位的骨细胞内的表达在 4 天后达到高 峰，增加了 3． 5 ～ 3． 7 倍，进一步支持了骨细胞参与局部应 力刺激下骨改建的假说［9］。 本研究初步证明，脂肪基质干细胞复合珊瑚材料后， 可以在裸鼠皮下形成组织工程化新生骨，为进一步应用组 织工程技术修复体内骨缺损的研究，提供了有意义的参 考。但关于 ADSCs成骨的研究仍处于初始研究阶段，在细 胞纯化、诱导时间长短、体内成骨质量及细胞最终转化等方 面仍需大量的实验研究。 参考文献 ［1］ Zuk PA，Zhu M，Ashjian P，et al． Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells［J］． Mol Bio Cell，2002，13 (12) :4279 － 4295． ［2］ 付全花，沈海刚，李钢，等．犬脂肪基质干细胞体外复合珊瑚 支架材料的生长特性和成骨活性［J］． 中华中医药学刊， 2010，28(8) :1686 － 1688． ［3］ Ito Y，Tanaka N，Fujimoto Y，et al． Bone formation using novel interconnected porous calcium hydroxyapatite ceramic hybridized with cultured marrow stromal stem cells derived from Green rat ［J］． J Biomed Mater Res，2004，69(3) :454 － 461． ［4］ 袁捷，殷德民，王敏，等．犬骨髓基质干细胞复合珊瑚羟基磷 灰石皮下成骨的实验研究［J］． 中国口腔颌面外科杂志， 2005，3(3) :207 － 211． ［5］ De Ugarte DA，Morizono K，Elbarbary A，et al． Comparison of multilineage cells from human adipose tissue and bone marrow ［J］． Cells Tissues Organs，2003，174(3) :101 － 109． ［6］ 袁捷，刘广鹏，祝联，等．骨髓基质干细胞体外复合珊瑚材料 的生长和成骨活性［J］． 组织工程与重建外科杂志，2006，2 (5) :251 － 255． ［7］ Wang L，Cowin SC，Weinbaum S，et al． Modeling tracer trans- port in an osteon under cyclic loading［J］． Ann Biomed Eng， 2000，28(10) :1200 － 1209． ［8］ Nagatomi J，Arulanandam BP，Metzger DW，et al． Frequency － and duration － dependent effects of cyclic pressure on select bone cell functions［J］． Tissue Eng，2001，7(6) :717 － 728． ［9］ Gluhak －Heinrich J，Ye L，Bonewald LF，et al． Mechanical load- ing stimulates dentin matrix protein 1 (DMP1)expression in osteo- cytes in vivo［J］． J Bone Miner Res，2003，18(5):807 －817． 0551 第 30 卷 第 7 期 2 0 1 2 年 7 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 30 No． 7 Jul． 2 0 1 2 中 华 中 医 药 Ⅴ 学 刊 犬脂肪基质干细胞复合珊瑚支架材料裸鼠皮下成骨的实验研究 (正文见 1548 － 1550 页) 第 30 卷 第 7 期 2 0 1 2 年 7 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 30 No． 7 Jul． 2 0 1 2 中 华 中 医 药 Ⅵ 学 刊 地龙舒腰胶囊的鉴别及含量测定研究 (正文见 1562 － 1564 页)