三黄三仙汤对辐射诱发实验小鼠白细胞减少症的作用研究_任莉莉

收稿日期:2012 － 02 － 07 基金项目:浙江省中医药科技计划项目(浙卫发［2011］107 号) 作者简介:任莉莉(1981 －) ，女，浙江杭州人，主治中医师，硕士，研 究方向:肿瘤的中西医结合治疗。 通讯作者:张爱琴(1969 －) ，女，浙江龙泉人，主任中医师，博士， 研究方向:肿瘤的中西医结合治疗。 滋阴、助阳的功效，能减少化疗的不良反应及保护骨髓、提 高食欲、增强体力、改善睡眠及精神状况、预防恶液质、延缓 终末期肿瘤患者的衰竭等效果［2］，可提高患者的生活质 量。 蔡氏扶正消癥汤是国家级名老中医蔡慎初教授治疗胃 癌的经验方。具有益气扶正，健脾和胃，解毒散结的功效， 经体外细胞实验证实能抑制人低分化及中分化胃腺癌细胞 增殖，尤其对人低分化胃腺癌细胞增殖的抑制作用更明显， 并在实验浓度范围内呈明显量效关系［3 － 5］;其作用机制可 能与干扰细胞周期［6］、诱导细胞凋亡有关［7］有关;并且能 抑制 VEGF 的表达，提示该药有抗血管生成作用［8］。通过 该临床观察，肯定了结合中医药调治，能有效缓解患者的临 床症状和体征，提高生活质量，减少了化疗的不良反应。化 疗联合扶正祛邪法组死亡 1 人，单纯化疗组死亡 3 人，提示 联合扶正祛邪法可能更有利于带瘤生存的患者存活下去。 参考文献 ［1］ Janunger KG，Hafstrom L，Glimelius B． Chemotherapy in gastric cancer;a review and updated meta － analaysis［J］． Eur J Surg， 2002，168(11) :597 － 608． ［2］ 李佩文．中医药对维护肿瘤患者生活质量的作用［J］．中华肿 瘤杂志，2002，24(2) :203 － 204． ［3］ 叶人，郎玮，尹丽慧，等．扶正祛邪法抑制胃腺癌细胞增殖的 实验研究［J］．浙江中西医结合杂志，2005，15(6) :331 － 332． ［4］ 尹丽慧，郎玮，叶人，等．蔡氏扶正消癥汤对胃癌细胞体外生 长的影响［J］．温州医学院学报，2006，36(1) :39 － 41． ［5］ 尹丽慧，叶人，吴建波，等．蔡氏扶正消癥汤对胃癌细胞增殖 的抑制作用研究［J］．中医药学刊，2005，23(3) :473 － 475． ［6］ 尹丽慧，章圣辉，郎玮，等．中药方剂 1 号对胃癌细胞体外生 长及细胞周期的影响［J］．癌变·畸变·突变，2005，17(4) : 220 － 223． ［7］ 郎玮，谢泳泳，叶人，等．扶正消癥方药液诱导胃癌细胞凋亡 的实验研究［J］．中国中医药科技，2006，13(5) :296 － 298． ［8］ 王海波，叶人，郎玮，等．蔡氏扶正消癥汤抑制胃癌血管生成 的机制研究［J］．上海中医药大学学报，2006，20(2) :49 － 51． 第 30 卷 第 7 期 2 0 1 2 年 7 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 30 No． 7 Jul． 2 0 1 2 中 华 中 医 药 1617 学 刊 三黄三仙汤对辐射诱发实验小鼠白细胞减少症的作用研究 任莉莉1，胡轶娟2，张爱琴1，普锦宝2，梁卫青2，郑军献2，程琳2，魏克民2，王晓稼1 (1．浙江省肿瘤医院，浙江 杭州 310022;2．浙江省立同德医院，浙江 杭州 310007) 摘 要:目的:探讨三黄三仙汤对 Se － 137 辐射诱导小鼠白细胞减少症的疗效和机制。方法:85 只清洁级 ICR雄性小鼠随机取 10 只为正常组，余 75 只以 Se － 137 为放射源复制白细胞减少症动物模型，建成后随机分为 5组，分别为模型组、阳性对照组、中药小剂量组、中药中剂量组、中药大剂量组。观察各组的生存差异及存活小 鼠的生活质量;各组存活小鼠第 1、4、7、10 天外周血 WBC 计数、第 10 天骨髓有核细胞计数(BMNC)及血清细胞 因子 GM － CSF水平。结果:中药组小鼠生活质量好于模型组及阳性对照组;中药各剂量组小鼠外周血WBC计数 及骨髓有核细胞数与模型组比较有明显回升(P ＜ 0． 05) ;中药小剂量组小鼠血清 GM － CSF含量较模型组及阳性 组明显升高(P ＜ 0． 05)。结论:三黄三仙汤治疗白细胞减少症有确切疗效，并且对减轻放疗毒副反应有一定作 用。 关键词:三黄三仙汤;白细胞减少症;BMNC;GM － CSF 中图分类号:R285． 5 文献标识码:A 文章编号:1673 － 7717(2012)07 － 1617 － 03 Effect Study of Sanhuang Sanxian Decoction on the Leucopenia in Mice with Radiation Injury REN Li-li1，HU Yi-juan2，ZHANG Ai-qin1，PU Jin-bao2，LIANG Wei-qing2， ZHENG Jun-xian2，CHENG Lin2，WEI Ke-min2，WANG Xiao-jia1 (1． Zhejiang Cancer Hospital，Hangzhou 310022，Zhejiang，China; 2． Zhejiang Province Academy of Traditional Chinese Medicine，Hangzhou 310007，Zhejiang，China) Abstract:Objective:To observe the effect and mechanism of Sanhuang Sanxian Decoction(SHSX)on leucopenia in mice with Se － 137 radiation injury． Methods:10 mice were ramdomly chose from 85 mice as the normal control group，the remanent 75 mice were replicated the leucopenia models by Se － 137 radiation injury，and then randomly divided into 5 groups:the model group，the positive control group，the high dose SHSX group，the middle dose SHSX group and the low 7161 第 30 卷 第 7 期 2 0 1 2 年 7 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 30 No． 7 Jul． 2 0 1 2 中 华 中 医 药 1618 学 刊 dose SHSX group． The quality of life was observed，meanwhile，it was detected the quantity of WBC and BMNC as well as the expression of GM － CSF． Results:The SHSX groups＇ quality of life were better than the model group and the positive control group． WBC and BMNC increased in SHSX groups compared with the model group． The expression of GM － CSF increased in the low dose SHSX group compared with the model group and the positive control group． Conclusion:San- huang Sanxian Decoction has definite effect on the treatment of leucopenia and has certain effect on reducing radiation tox- icity． Key words:Sanhuang Sanxian Decoction;leucopenia;BMNC;GM － CSF 三黄三仙汤由生黄芪、黄精、黄芩、仙鹤草、淫羊萑、仙 茅、女贞子、当归、鸡血藤、白芍为基本组方，具有补肾升血、 健脾益气的作用。其在临床治疗白细胞减少症中已取得一 定疗效［1］。为给该方的临床应用提供实验依据，现进行下 述研究。 1 材料与方法 1． 1 实验材料 1． 1． 1 实验动物 清洁级 ICR 雄性小鼠，共 85 只，6 ～ 8 周龄，体重 18 ～ 22g，由浙江省实验动物中心提供［合格证 号:SCXK(浙)2008 － 0033］。 1． 1． 2 实验药品 三黄三仙汤:生黄芪 30g，黄精 30g，黄 芩 20g，仙鹤草 30g，淫羊萑 15g，仙茅 18g，女贞子 12g，当归 12g，鸡血藤 15g，白芍 12g(购于浙江省立同德医院第二门 诊部中药房)用水浸泡 1h 后，煎煮 2 次，每次 1h，合并煎 液，离心，浓缩，分别稀释至药液浓度为生药 5． 12、2． 56、 1. 28g /mL 3 种浓度(分别相当于成人用量的 16 倍、8 倍、4 倍)。利可君片(购于江苏吉尔贝药业，批号 080606) ，临用 前用蒸馏水溶解稀释，配成 1mg /mL的溶液。 1． 1． 3 主要仪器 酶标仪(Bio － RAD公司 680，美国) ;台 式离心机(Biofoge pico，Heraeus 公司，德国) ;电子天平 (METTLER TOLEDO AB204 － S，瑞典) ;解剖显微镜(O- LYMPUS SZ － 11，日本) ;生物显微镜(OLYMPUS，CHK2 － F － GS日本)。 1． 1． 4 主要试剂 Mouse GM － CSF(USCN LIFE SCI- ENCE ＆ TECHNOLOGY COMPANY，Catalog NO． E0045m) ; 冰醋酸(分析纯，杭州化学试剂厂，批号:060626)。 1． 2 实验方法 1． 2． 1 白细胞减少症动物模型复制 实验动物于实验开 始前 2 天适应环境。实验当天(第 0 天) ，除正常空白组 (n = 10)外，其余小鼠(n = 75)在浙江省农业科学院辐射 中心接受以 Se － 137 为放射源的辐射，剂量率为 0． 87Gy / min，总剂量为 3． 5 Gy，辐射距离为 80cm。以照射后第 1 天小鼠外周血 WBC计数降至 4 × 109 /L 以下为模型成功 复制［2］。 1． 2． 2 实验动物分组 实验共分 6 组，其中 A组为中药大 剂量组、B组为中药中剂量组、C 组为中药小剂量组、D 组 为利可君阳性对照组、E组为模型对照组、F组为正常组。 1． 3 实验动物给药方式及剂量和浓度 分组后灌胃给药，每日 1 次，共 10 天。A、B、C 3 组分 别灌服 25mL /(kg·d)高中低浓度的三黄三仙汤;D 组灌 服利可君溶液 25mg /(kg·d) ;E组及 F组各灌服生理盐水 25mL /(kg·d)。 1． 4 检测指标 ①各组的生存差异及存活小鼠的生活质量。②各组存 活小鼠第 1、4、7、10 天外周血 WBC计数。③各组存活小鼠 第 10 天骨髓有核细胞计数(BMNC)［3］及血清细胞因子 GM － CSF水平 1． 5 统计学方法 实验数据以均数 ±标准差(珋x ± s)表示，应用 SPSS 11． 0 分析软件对实验数据进行统计分析，采用多个样本均数比 较的单因素方差分析法，取以 P ＜ 0． 05 为有差异，P ＜ 0． 01 为差异明显。 2 结 果 2． 1 至实验第 10 天各组实验小鼠生存情况 见表 1。 表 1 各组存活情况统计 组别 总数 (只) 死亡 (只) 存活 (只) 存活率 (%) 正常组(F组) 10 0 10 100． 0 模型组(E组) 15 5 10 66． 7 阳性组(D组) 15 3 12 80． 0 小剂量组(C组) 15 1 14 93． 3 中剂量组(B组) 15 2 13 86． 7 大剂量组(A组) 15 3 12 80． 0 2． 2 各组小鼠的生活质量 正常组小鼠无明显异常表现，各辐射组小鼠出现不同 程度精神不振、食欲下降、动作迟缓、好蜷于笼边，背部照射 区毛发稀疏、易掉毛，各中药组小鼠自实验后半程起精神状 态逐渐好转，胃纳增加，动作逐渐敏捷，掉毛较模型组及阳 性组少。 2． 3 对小鼠外周血 WBC计数及骨髓有核细胞数的影响 各辐照组小鼠外周血 WBC 计数及骨髓有核细胞数明 显减少，与正常组比较差异均有显著性(P ＜ 0． 01 及 P ＜ 0. 05)。在给药后期，中药各剂量组小鼠外周血 WBC 计数 及骨髓有核细胞数与模型组比较有明显回升，差异有显著 性(P ＜ 0． 05) ，其中中剂量组与模型组比较，差异更有显著 性(P ＜ 0． 01 及 P ＜ 0． 05)。见表 2。 2． 4 对小鼠血清 GM － CSF含量的影响 与正常组比较，模型组小鼠血清 GM － CSF 含量升高 (P ＜ 0． 05)。与模型组比较，各给药组小鼠血清 GM － CSF 含量升高更加明显，差异具有显著性(P ＜ 0． 05)。作用的 强弱依次为中药小剂量组 ＞阳性组 ＞中剂量组 ＞大剂量 组。见表 3。 8161 第 30 卷 第 7 期 2 0 1 2 年 7 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 30 No． 7 Jul． 2 0 1 2 中 华 中 医 药 1619 学 刊 表 2 中药对 Se － 137 辐射小鼠 WBC计数及骨髓有核细胞数的影响(× 109 /L，珋x ± s) 组别 WBC计数(× 109 /L) 1 天 4 天 7 天 10 天 BMNC(× 107 /个) 正常组 12． 97 ± 3． 67 11． 28 ± 2． 17 10． 86 ± 2． 97 10． 48 ± 2． 76 2． 38 ± 0． 07 模型组 2． 52 ± 0． 75＊＊ 1． 29 ± 0． 37＊＊ 1． 78 ± 0． 45 1． 85 ± 0． 43 0． 88 ± 0． 04* 阳性组 2． 36 ± 0． 71＊＊ 1． 34 ± 0． 56＊＊ 2． 42 ± 0． 76$ 2． 60 ± 0． 79$ 1． 16 ± 0． 01* $ 小剂量组 2． 43 ± 0． 86＊＊ 1． 47 ± 0． 41＊＊ 2． 44 ± 0． 56$ 2． 57 ± 0． 57$ 1． 16 ± 0． 01* $ 中剂量组 2． 50 ± 0． 47＊＊ 1． 52 ± 0． 84＊＊ 2． 98 ± 0． 93$ $ 3． 31 ± 1． 74$ $# 1． 41 ± 0． 04* $ # 大剂量组 2． 39 ± 0． 55＊＊ 1． 25 ± 0． 42＊＊ 2． 58 ± 0． 58$ 2． 65 ± 0． 68$ 1． 22 ± 0． 03* $ 注:与正常组比较，* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01;与模型组比较，$ P ＜ 0． 05，$ $P ＜ 0． 01;中药各组与阳性组比较，#P ＜ 0． 05。 表 3 中药对 Se － 137 辐射小鼠血清 GM － CSF 含量的影响(ng /L，珋x ± s) 组别 n GM － CSF 正常组 10 21． 99 ± 1． 72 模型组 10 32． 56 ± 3． 13* 阳性组 12 68． 39 ± 6． 18＊＊ $ $ 小剂量组 14 88． 03 ± 4． 15＊＊ $ $ # 中剂量组 13 65． 73 ± 5． 06* $ $ 大剂量组 12 47． 24 ± 2． 45＊＊ $ # 注:与正常组比较，* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01;与模型组比较， $ P ＜ 0． 05，$ $ P ＜ 0． 01;中药各组与阳性组比较，#P ＜ 0． 05。 3 讨 论 恶性肿瘤发病率逐年升高，目前其治疗的主要手段仍 以放化疗为主，白细胞减少症是放化疗最常见的毒副反应 之一，属中医“虚劳”范畴，其主要病机为脾肾亏损，气血不 足。中医学认为，肾主藏精，主骨生髓，精能化血，精足则血 旺。脾主运化水谷精微，为气血生化之源。研究表明，健脾 补肾和补血养阴的中药对促进骨髓造血有显著疗效［4］。 三黄三仙汤是国家级名中医魏克民的自拟经验方，由生黄 芪、黄精、黄芩、仙鹤草、淫羊藿、仙茅、女贞子、当归、鸡血 藤、白芍为基本方组成。其在临床升白治疗中已取得一定 疗效［1］。方中黄芪为补气要药［5］，含有多糖、蛋白质、生物 碱、氨基酸、黄酮类等多种生物活性物质，能够有效调节机 体的免疫功能［6］。仙茅、淫羊藿补命门，助肾阳而振发脾 阳。黄精益气养阴、滋补脾肾;女贞子补肾养阴;当归、鸡血 藤、白芍养血活血;黄芩、仙鹤草清热凉血。全方具有补肾 升血、健脾益气的作用。 祖国医学以整体观为主导思想，放疗属外邪，邪气外侵 则正气受损，继则身体各部分相互影响，正所谓“牵一发而 百病生”。肾为五脏之本，主生髓，其华在发，脾为后天之 本，主运化，主统血，在体合肌肉，主四肢，脾肾亏虚则出现 精神萎靡、活动减缓、毛发脱落、胃纳减少等一系列症状。 三黄三仙汤从脾肾为着眼点，进行整体调理，以减轻放疗毒 副反应、改善生活质量。 骨髓有核细胞(BMNC)包含了粒系、红系和巨核系三 系的祖细胞，BMNC计数在一定程度上反映骨髓造血细胞 的增生情况。辐射对造血系统损伤明显，而给药后期中药 各剂量组小鼠外周血 WBC 计数及骨髓有核细胞数与模型 组比较有显著回升。证明三黄三仙汤可促进外周血 WBC 及 BMNC增加，改善辐射所致的造血系统损害，促进造血 功能的恢复。 骨髓细胞的增殖很大程度上也归之于造血生长因子 (CSF)的存在。绝大多数造血生长因子既刺激细胞增殖， 又促进细胞成熟。对于白细胞的分化和增殖来说，GM － CSF是重要的正调控因子之一。它由单核—巨噬细胞、激 活的淋巴细胞、内皮细胞等产生，能够刺激中性粒细胞、单 核细胞和嗜酸性粒细胞的生成［7］。通过检测血清中 GM － CSF水平可以反应骨髓造血能力。本次实验中发现辐射模 型组小鼠血清 GM － CSF含量较正常组增加，可能与造血组 织受损，粒细胞生成减少，反馈性地使 GM － CSF 生成增加 有关。与模型组比较，给药后小鼠血清 GM － CSF含量均明 显增加，说明三黄三仙汤可以增加 GM － CSF 水平，从而刺 激造血干细胞 /祖细胞增殖，回升 WBC计数。 本研究中，三黄三仙汤小剂量组血清 GM － CSF含量较 中、大剂量组明显增高，同时在存活率上也有明显优势。而 中剂量组则在外周血 WBC 计数及骨髓有核细胞数上较其 余两组有优势。可能原因:放疗损伤了小鼠的正气，使其免 疫力降低，消化系统亦变得脆弱，而大剂量组的药物由于过 分浓缩而变得过于黏腻，使得药物不能被充分吸收，进而影 响其疗效，使得高剂量组不如小、中剂量组作用明显。同 时，由于样本量较小及实验中存在的误差，小、中剂量组间 的差别尚不明确，有待于进一步增加样本量进行统计区分。 本次研究证明:三黄三仙汤能加速恢复 Se － 137 辐射 诱导白细胞减少症小鼠的骨髓造血功能，同时对减轻放疗 毒副反应有一定作用，为其用于白细胞减少症治疗的临床 应用提供了实验依据。 参考文献 ［1］ 陈志炉，魏克民，蒋慧芳． 三黄三仙汤治疗白细胞减少症 40 例疗效观察［J］．中西医结合，2007，36 (9) :112． ［2］ 田枫，张阔，康爱君，等．小鼠白细胞减少症模型的建立［J］． 实验动物科学，2008，25(2) :1 － 3． ［3］ Zhang HQ ，LIN AP ，Sun Y ，et al． Chemo － and radio － protec- tive effects of polysaccharide of Spirulina piatensis on hemopoiet- ic system of mice and dogs［J］． Acta Pharmacologica Sinica， 2001，22(12) :1121 － 4． ［4］ 陈灏珠，． 实用内科学［M］． 12 版． 北京:人民卫生出版社， 2005:2395． ［5］ 国家药典委员会．中华人民共和国药典［S］．北京:化学工业 出版社，2005:212． ［6］ 邵鹏，赵鲁杭．黄芪多糖对树突状细胞表型及功能成熟的影 响［J］． 中华微生物学和免疫学杂志，2006，26(7) :637 － 640． ［7］ 姚泰，乔健天，樊小力，等．生理学［M］． 5 版．北京:人民卫生 出版社，2001:58． 9161