细菌的抹片制做及染色实验三 细菌的抹片制做及染色
【目的要求】
(1) 了解细菌简单染色法和革氏染色法的原理
(2)掌握细菌抹片标本的制备及几种常用染色法的操作步骤
【器材】
(1)大肠杆菌、葡萄球菌、巴氏杆菌等18.24小时液体培养物和斜面培养物。
(2)美蓝染色液、革兰氏染色液和瑞特氏染色液。
(3)载玻片、接种环、酒精灯、染色架、蜡笔、吸水纸等。
【原理】
细菌个体微小,无色而半透明,折光性弱,在普通光学显微镜下观察活细胞时,只能见其大致轮廓。必须制成抹片标本,应用适当染料染色后,才能较清楚地观察到细菌的形态及某些构造...
实验三 细菌的抹片制做及染色
【目的要求】
(1) 了解细菌简单染色法和革氏染色法的原理
(2)掌握细菌抹片标本的制备及几种常用染色法的操作步骤
【器材】
(1)大肠杆菌、葡萄球菌、巴氏杆菌等18.24小时液体培养物和斜面培养物。
(2)美蓝染色液、革兰氏染色液和瑞特氏染色液。
(3)载玻片、接种环、酒精灯、染色架、蜡笔、吸水纸等。
【原理】
细菌个体微小,无色而半透明,折光性弱,在普通光学显微镜下观察活细胞时,只能见其大致轮廓。必须制成抹片标本,应用适当染料染色后,才能较清楚地观察到细菌的形态及某些构造。此外,还可根据细菌呈现出的不同颜色反应而对其进行鉴别。
【内容和方法】
(一)细菌抹片标本的制备
1.抹片 根据所用材料不同,抹片的方法亦有差异
(1)固体培养物 用经酒精灯火焰烧灼灭菌后的接种环,蘸取无菌蒸馏水(无菌肉汤、生理盐水均可)一环于清洁无油脂的载玻片中央,再钩取细菌的固体接着物少许混于蒸镏水中,涂抹成直径为1—1.5cm大小的均匀菲薄的抹片。
(2)液体培养物 可直接用灭菌接种环钩取细菌培养液1.2环,涂抹于玻片上即可。但应注意净管底Iili物摇匀,以免影响涂片效果。
(3)组织涂片 用灭菌的剪刀镊子取被检组织一小块,以其断面在玻片上压印或涂抹成适当大小的薄片。如为肝脾组织,脓汁、血液、乳汁等可直接涂抹于玻片上。无论何种方法,切忌涂抹太厚,否则不利于染色和观察。
2.干燥 将抹片置于空气中让其自然干燥
3固定 固定的方法因材料不同而异:
(1) 火焰固定 细菌培养物抹片,常采用火焰固定法,即将已干燥的抹片菌膜面向上,以钟摆速度在酒精灯火焰上通过数次(用手背触及抹片反面,以不烫手为宜)。
(2) 化学固定 血液、组织等抹片常用此法固定,即以数滴甲醇滴加在玻片上,固定3.5min。
抹片经固定后便粘附于玻片上而不易被水冲掉,并能改变细菌对染料的通透性,增加与染料的亲和力而更容易着色,同时多数细菌能被杀死。
(二)细菌的常用染色方法
1.简单染色法 只用一种染料进行染色的方法。染色后一般只能显示出细菌的外形、大小及排列。
美蓝染色法在已固定的细菌抹片上,滴加美蓝染色液染i.2min,水洗,干后镜检。结果细菌呈蓝色。
2、复杂染色法 用两种或两种以上的染料进行染色的方法。结果使不同的细菌或不同的构造呈现出不同颜色,从而显示出细菌的特殊结构及染色特性。
(1) 瑞特氏染色法细菌抹片自然干燥后,滴加瑞特氏染液约1ml以固定标本,l-3min~,再滴加与染液等量的磷酸缓冲液或中性蒸镏水,轻轻晃动玻片或用口吹气,使之与染液混匀,经3-5min,待
面显金属闪光,水洗,
干后镜检。
结果细菌吁蓝色,组织细胞等物呈其他颜色。
(2)革兰氏染色法
①在经固定后的抹片上,滴加草酸铵结晶紫染色液,染1.3min,水洗。
②加革兰氏碘液媒染1.3min,水洗。
③滴加95%乙醇脱色约30秒至1分钟至水洗。
④用石炭酸复红或沙黄染色液复染1.2min左右,水洗,干后镜检。
结果革兰氏阳性菌呈蓝紫色,革兰氏阴性菌呈红色。
革兰氏染色法是微生物学中最重要和广泛使用的一种鉴别染色法,此法
能将所有的细菌分成两大类:染成蓝紫色的革兰氏阳性菌和红色的革兰氏阴
性菌。其原理主要是由于两类细菌细胞壁的化学组成和结构的不同。革兰氏
阳性菌细胞壁肽聚糖层很厚,且结构致密,当用乙醇脱色时,肽聚糖层孔径
缩小,使结晶紫一一碘的复合物被截留在细胞壁内,所以细菌仍保留结晶紫
的颜色。革兰氏阴性菌的细胞壁脂类含量高,乙醇抽提出脂质,导致通透性
增加;且因肽聚糖含量低,结构疏松,其孔径在乙醇处理后仍保留足够的大
小,致使结晶紫一一碘复合物可被洗脱出来,经复染后,则染上了复染液的
红色。
(三)细菌的特殊染色方法
1. 抗酸染色法(石炭酸复红—硫酸美蓝法) 在经固定后的抹片上滴加石炭酸复红液,微加热染3min,水洗;再用硫酸美蓝液(美蓝2g溶于75ml水中,慢慢滴加浓硫酸25ml混合即成)染约lmin,水洗,干后镜检。
结果:抗酸菌呈红色,其他细菌皆为蓝色。
2. 荚膜染色法(碱性美蓝染色法) 细菌抹片自然干燥后,滴加甲醇固定3—5min,用水轻微冲洗;再用碱性美盐染色液染2~3min,水洗,干后镜检。
结果:荚膜呈粉红色,菌体呈蓝色。
3. 芽胞染色法 在已固定的细菌抹片上,滴加石炭酸复红液,微加热至发生蒸气染5min,水洗;用95%乙醇脱色2min,水洗;再用碱性美蓝液复染1rain,水洗,干后镜检。
结果:芽胞呈红色,菌体呈蓝色。
4. 鞭毛染色法(魏曦一张颖悟二氏改良染色法)
(1) 染液配制
第一液:20%钾明矾液(加温溶解)2Oml,5%石炭酸液50ml,20%鞣酸液(加温溶解)20ml。
第二液:复红酒精饱和液。
取第一液9份与第二液1份混合后立即过滤。滤液放置6h后使用,其效果更佳。
(2) 染色方法 取变形杆菌6~8h血琼脂平板培养物,仔细从菌膜伸展最远处挑菌少许,轻轻放入盛有蒸馏水的试管中,经数分钟让其自行分散后,再置37℃中孵育25—30min。取上述菌液1接种环,轻轻滴于洁净无油迹的玻片上。涂抹时接种环随水滴移动,切勿与玻片相磨,以免鞭毛脱落。
待抹片自然干燥后(勿用火焰固定),加染液染l~2min,水洗,干后镜检。
结果:鞭毛呈淡红色,菌体呈红色。
附:常用染色液的配制和特殊的染色方法
通常将常用染色液配制成乙醇或水的饱和溶液以作原液贮存,以后再稀
释成不同浓度。
按配制量及染料溶解度称量,放入乳钵中,先倾入少量溶剂进行研磨,
待染料全部溶解后,倒入棕色瓶中,再用其余溶剂将乳钵中染料逐一洗入瓶
常用染料在水和乙醇中的溶解度
内避光保存
染料
100溶剂中染料
的克数
染料
100毫升溶剂中染料
的克数
于水中
f95%乙醇中
于水中
于95%乙醇中
俾士麦褐Y
结晶紫(氯化物)
伊红Y(钠盐)
碱性品红(新)
孔雀绿(草酸盐)
1_36
1.68
44.20
1.13
7.60
1.08
13,87
2.18
3.20
7.52
甲基紫
美蓝(氯化钠)
中性红(氯化物)
沙黄O
甲苯胺蓝O
2.93
3.55
5.64
5.45
3.82
15.21
1.48
2.45
3.41
0.57
1 .碱性美蓝染色液
美蓝乙醇饱和液 30ml
10%氢氧化钾水溶液 0.1ml
蒸镏水 lOOml
混合即成
2、石炭酸复红液
碱性复红乙醇饱和液 lOml
l5%石炭酸水溶液 9Oml
混合即成
3、稀释石炭酸复红液
石炭酸复红液 lOml
蒸镏水 90ml
混合即成
4、革兰氏染色液
(1) 草酸铵结晶紫染液
结晶紫乙醇饱和液 20ml 混合即成
1%草酸铵水溶液 80ml
(2)革兰氏碘液
碘片 1g
碘化钾 2g
蒸镏水 300ml
(3)95%乙醇
(4)沙黄乙醇饱和液lOml、蒸镏水90mI混合即是
说明:目前,我院根据当前情况,特意配制实验室常用染色液,如, 碱性美蓝染色液, 革兰氏染色液,瑞特氏染色液,并向各个实验室长期提供.
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