孢哌酮钠舒巴坦钠的HPLC分析及其质量研究

液，以浓度为 !，响应值为 " 进行回归分析，得线性回 归方程：" ! " ##$% $ & " #’(’ $ !，$ ! " #’’’ (。 ! )" 回收试验 取稀释的谷氨酸钾注射液分为 # 份各加谷氨酸钾标准 液适量进行回收试验，结果见表 *。 表 ! 谷氨酸钾回收试验 ) % ! + #$% ! ,-./0-12 1-34563 7/1 8/6933:4; <5469;96-) % ! + 加入量 = ;<·> ? % 测得量 = ;<·> ? % 回收率 = @ !& = @ ,AB = @ *#" *#* %"% )C #+’ #D% %"" )D %"" )$ " ) $" C$D C$( %"" )+ %"*% %"*# %"" )D ! )&’ 酶电极法与旋光法测定谷氨酸钾注射液中谷氨酸钾 含量对比试验 酶电极法照“* ) +”操作，旋光法照中国药典谷氨酸钾注 射液含量测定项下操作。结果见表 +。 设旋光法结果为 "，酶电极法结果为 !，由表 + 数据可 得线性回归方程 " ! " ##’C# & +$ # ’C#!，两法测定结果间相 关系数 $ ! " ) ’’$D，对表 +数据进行方差分析与 E检验，得 E ! $ ) CDC F E（*，%$）! %’ ) DD示两种分析方法间无显著性差异。 表 ( 谷氨酸钾注射液中谷氨酸钾含量测定结果 ) @，% ! + #$% ( G/H6-H63 /7 8/6933:4; <5469;96- :H :63 :HI-.6:/H ) @，% ! + 批号 旋光法 酶电极法 ’’"’"( ’$ )#* ’D )’" ’C%""% ’C )$C ’C )D( ’("%"% ’C )%" ’( )$* ( 讨 论 谷氨酸钾注射液的原料谷氨酸是由产谷氨酸的短棒杆 菌经深层发酵制得，在原料中即含有约 " ) #@的其它氨基 酸［D］。酶电极法因其高度的立体专一性，不受其它氨基酸影 响，仅与谷氨酸（根）反应故结果较准确。而其它氨基酸分子 中亦含有不对称碳原子，对谷氨酸（根）的旋光性产生干扰使 旋光法测定谷氨酸钾的结果偏高。 参考文献 ［&］ 中国药典 ) %’’#年版二部［A］) %’’#：+"$ ) ［!］ 张先恩 )生物传感原理与应用［J］)长春：吉林科学技术出版 社，%’’%：% K D ) ［(］ 孙士青，王宁，何伟，等 )酶电极法测定葡萄糖注射液中糖含量 的研究［L］)中国药学杂志 ) %’’D，’（*’）：#D$ ) ［)］ 中国药典 ) %’’"年版二部注释［A］) %’’"：*C’ ) （收稿日期：*""*M"%M*C） 注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠的 *+,-分析及其质量研究 张哲峰%，杨更亮%，D"，梁贵键*，支丽娟+，陈义D（% )河北大学，河北 保定 "(%""*；* )空军总医院，北京 %"""+$；+ )河北省儿童医院， 河北 石家庄 "#""%%；D )中国科学院化学研究所，北京 %"""C"） 摘要：目的 建立头孢哌酮钠舒巴坦钠及其有关物质的 NO>G分析方法，并考察溶媒结晶法和冷冻干燥法两种工艺产品的质 量。方法 以三乙胺醋酸溶液M乙腈M% ;/5·> ? %醋酸M水（*" P %D" P # P C+#）为流动相，在 QBA柱上同时测定头孢哌酮钠和舒巴坦 钠，*%" H;检测。结果 两成分分离度及线性关系良好，回收率分别为 ’’ ) C$@和 %"" ) DD@，并可同时分离其中的头孢哌酮 A 异构体，RM%##%S及其它相关物质，冷冻干燥工艺产品的引湿性及有关物质含量高于溶媒结晶产品，在高温条件下前者质量下 降速度高于后者。结论 分析方法准确，可靠；溶媒结晶产品质量优于冷冻干燥工艺产品。 关键词：头孢哌酮钠舒巴坦钠；高效液相色谱法；有关物质；质量 中图分类号：,’*( 文献标识码：T 文章编号：%""% ? *D’D（*""+）"$ ? "D$* ? "+ 基金项目：国家自然科学基金资助项目（*’*"#"+(，*""(#""#），河北省自然科学基金（*"*"’$），科技部资助项目（*""*GGT+%""，ULGV* ? ND） 作者简介：张哲峰，男，副主任药师，在读博士生 R-5：（"+%%）#"#(’(# "通讯作者：杨更亮，男，教授，博士生导师 R-5：（"+%*）#"(’(CC，E9W：（"+%*）#"+*+%+ XM;9:5：Y<5Z;9:5) [\4) -]4) .H ./$0123 42/53 67 8976:9;$<6=9 4651/> $=5 4/0%$82$> 4651/> 76; 1=?98216= %3 *+,- ^NT_‘ ^[-M7-H<%，YT_‘ ‘-HaT_‘ ‘4:MI:9H*，^Na >:MI49H+，GNX_ Y:D（% # ’()(* +%*,($-*./，01234 *%5，"(%""*，67*%1；* # 8(%($19 ’2-:*.19 2; <*$ =2$>(，0(*?*%5 %"""+$，67*%1；+ # ’()(* @$2,*%>*19 67*93$(%’- ’2-:*.19，A7*?*4 1B7C1%5 "#""%%，67*%1；D # 6(%.($ ;2$ D29(>C91$ A>*(%>(，E%-.*.C.( 2; 67(F*-.$/，67*%(-( <>13(F/ 2; A>*(%>(，0(*?*%5 %"""C"，67*4 %1） @AB#C@-#：DAEF-#GHF R/ ]-0-5/8 6[- ;-6[/] 7/1 6[- ]-6-1;:H96:/H /7 .-7/8-19b/H- 3/]:4;（GO^）9H] 345\9.69; 3/]:4;（ASR） 7/1 :HI-.6:/H 9H] 6/ ;-9341- 6[- ]-<19]96-3 /7 6[- 81/]4.63 ;9]- \2 3/50-H6 .1236955:b96:/H 9H] 52/8[:5:b96:/H ;-6[/])IF#*DJ QBA ./54;H c93 43-] 6/ 93392 .-7/8-19b/H- 9H] 345\9.69; 3:;4569H-/4352 ) R1:-6[259;:H- <59.:95 9.-6:. 9.:] 3/546:/H M9.-6/H:61:5-M5 ;/5·> ? % ·*$D· 67*% @71$F G，HIIJ GC%(，K29 # JL M2 # N 中国药学杂志 *""+年 $月第 +C卷第 $期万方数据 !"#$%" !"%&’(!$#)（*+ , -.+ , / , 01/）(!2 32#& !2 $4# 567%8# 94!2#，(%$4 :; &#$#"$%6< !$ *-+ <5=!"#$%&# >4# "6596<#<$2 4!& ?66& 8%<#!) )#8!$%6< !<& $4#%) !@#)!?# )#"6@#)%#2 (#)# AA = 0BC D6) EFG !<& -++ = ..C D6) HI> )#29#"$%@#8J = H %265#) %< EFG，>’-//-I !<& 6$4#) )#8!$#& 2372$!<"#2 (#)# 2#9#)!$#& (#88= >4# K3!8%$J "4!)!"$#) 6D EFG 5!&# 7J 268@#<$ ")J2$!88%L!$%6< 6) 8J694%8%L!$%6< 5#$46& (!2 !826 2$3&%#&= >4# 8!$$#) (!2 56)# 4J?)62"69%" $4!< $4# D6)5#)；!<& 56)# &#?)!&!$%6< 9)6&3"$2 (#)# D6)5#& $4!< $4# D6)5#) !$ 4%?4#) $#59#)!$3)#=’()’%$#*() >4# &#$#)5%4# K3!8%$J 6D $4# 9)6&3"$ 5!&# 7J 268@#<$ ")J2’ $!88%L!$%6< 5#$46& %2 7#$$#) $4!< $4!$ 6D $4# 9)6&3"$ 5!&# 7J 8J694%8%L!$%6< 5#$46&= +", -(!.# "#D69#)!L6<# 26&%35 M 2387!"$!5 26&%35；NFOE；)#8!$#& 2372$!<"#；K3!8%$J 头孢哌酮钠’舒巴坦钠（EFG’HI>）为抗生素与酶抑制剂 的复合剂，EFG产品中除药用形式 P构型外，尚有对革兰阴 性杆菌几乎无效的 H异构体、降解物（>’-//-I）及具抗原性 的高聚物等［-］，严重影响着产品质量。EFG与 HI> 在 QRH 柱上的保留行为差别较大，可同时测定，但要与 H异构体及 >’-//-I同时分离，存在一定难度。本实验根据这 . 种物质 的分子结构特点，经微机查询“常用药物色谱行为数据 库”［*］，探索建立了 NFOE分离测定法，并考察了溶媒结晶法 和冷冻干燥法两种工艺制备的 EFG对本品质量的影响。 / 材 料 / =/ 仪器与试药 S!$#)2 T/-+ 泵，岛津 HFR U -+VR紫外检测器，HFR U 00-+ 数据处理机，P4#6&J<#W-*/ 定量进样阀（OQQF X *+ !O）；头孢哌酮（!）、（ "）型异构体及舒巴坦对照品（中国药品 生物制品检定所），代号为 >’-//-I的相关物质（大连辉瑞制 药有限公司）。注射用头孢哌酮钠’舒巴坦钠（V厂，溶媒结晶 工艺；I厂，溶媒结晶工艺；E厂，冻干工艺）。 / =0 实验条件 Y<#)$2%8 E-0柱（. = + 55 Z *+ "5，/!5）；流动相：三乙胺醋 酸溶液（冰醋酸 -W 5O 与三乙胺 -1 = A 5O 置 -++ 5O 量瓶， 加水至刻度）’乙腈’- 568·O U -醋酸’水（*+ , -.+ , / , 01/）；流 速：- 5O·5% 对照品各 /+ 5? 置 同一 /+ 5O量瓶中，按“供试液”制备。 / =1 =1 分离度测定溶液 分 别 称 取 EFG’H 异 构 体 及 >-//-I对照品各适量，置供试液中制成浓度为 + = +- 5?· 5O U -的溶液。 0 色谱分析方法 0 =/ 系统适用性实验 0 =/ =/ 量取分离度测定溶液 *+!O 注入色谱仪，记录色谱 图，见图 -。可见各峰之间均达基线分离，分离度分别为 P舒’> X 1 = 0，P>’E X . = *，PE’H X * = 0。柱效以 HI> 及 EFG 计， 分别为 1 /++和 1 1++。 0 =/ =0 精密量取供试液 *+!O，注入色谱仪，连续进样 /次， HI> 与 EFG峰面积的 PHR分别为 + = 10C和 + = 1-C。 图 / 系统适用性试验色谱图 - U HI>；* U >’-//-I；1 U EFG；. U H异构体 345 / E4)65!$6?)!5 6D 2J2$#5 23%$!7%8%$J - U HI>；* U >’-//-I；1 U EFG；. U H’%265#) 0 =0 线性关系考察 精密量取对照品贮备液 .，B，0，-+，-*，-. 5O，分别置 -++ 5O量瓶中，各用流动相稀释至刻度。分别精密量取 *+ !O，注入色谱仪，记录色谱图，以峰面积（ #）与浓度（ $）对进 样量进行直线回归，得回归方程，舒巴坦钠：# X - %A Z -+1 $ U B %* Z -+1，& X + %AAA A；头孢哌酮钠：# X 0.+$ ] B % . Z -+1，& X + %AAA 0。 0 =1 含量测定及回收率实验 精密量取供试液和对照液各 *+!O，注入色谱仪，按外标 法测得 1 批样品含量分别为（EFG M HI>，C）：-++ = . M AA = 1， AA = 0 M A0 = W 及 -+- = B M A0 = A，PHR（C，’ X /）分别为 + = -B M + = *-，+ = -0 M + = *+和 + = *+ M + = *.。 精密称取本品及对照品各适量，混合，照上法测 / 份加 样回收率，结果为（EFG M HI>，C）AA = 10 M -+- = *，-++ = B M -+- = +，AA = * M AA = W，AA = W M AA = / 和 -++ = . M -++ = 0。平均为 AA = 0B M -++ = ..，PHR为 + = B*C M + = W0C。 1 有关物质考察 取供试品贮备液作为溶液 V，取 V液适量，用流动相稀 释 *++倍作溶液 I，取 I液 *+!O注入色谱仪，调节仪器灵敏 度使主峰高为满量程的 1+C。另取 V液 *+!O注入色谱仪， 用有关物质对照品定位各有关物质峰，并以各峰面积占总峰 面积的百分比指代其含量，同法考察 1个厂家两种生产工艺 .批样品的有关物质，结果见表 -。 6 稳定性考察 6 =/ 吸湿试验及水分对稳定性的影响 照文献［1］法，测定 V，I及 E 1厂家两种工艺产品的吸 ·1B.·中国药学杂志 *++1年 B月第 10卷第 B期 ()*’ +),&- .，/001 .2’3，456 % 17 85 % 9万方数据 湿性，引湿增重分别为 ! " #$，! " %$及 #& " !$。取 ’厂家产 品，照该法制备含水分不同的样品，胶塞蜡封后，置 %()培养 箱中，定时取样，测定其中 ’*+及 ,-. 含量，以初始含量为 表 ! ’*+ / ,-. 有关物质考察结果 "#$ ! .01 2134516 789754:;17 61512<=:45=>: 2178357 >? ’*+ / ,-. 生产厂 ’*+工艺 有关物质含量 / $ ,异构体 .@#&&#- 杂质 A 杂质 & 杂质 B C 结晶 D E "E% # "!B # "FA F "!B - 结晶 D E "!& # "(G # "A! F "!E 结晶 D E "A( # "AA # "(E F "!# ’ 冻干 D B "!E E "(! E "E# # "E% #FF$计，’厂的变化情况见图 E。 图 % 水分对 ’*+ / ,-. 含量的影响 — D ’*+；D D D D ,-.；# D水分：E "!$；E D水分：#% "E$ &’( % .01 =:?381:;1 >? H4512 >: 501 ;>:51:57 >? ’*+ / ,-. — D ’*+；D D D D ,-.；# D H4512：E "!$；E D H4512：#% "E$ ) "% 温度对稳定性的影响 分别取冻干和结晶工艺产品置 AF)培养箱中，考察各项 指标的变化，结果见表 E。 表 % 高温条件下两种工艺的 ’*+ / ,-. 稳定性考察结果 "#$ % .01 7549=3=5I >? ’*+ / ,-. 45 AF) <461 9I 501 5H> 51;0:>3>JI 生产厂 ’*+工艺 时间 性状 溶液颜色 总降解 ,-.含 ’*+含 / 6 物 / $ 量 / $ 量 / $ C 结晶 初始 白色粉末 黄色 %号 B "&F GA "B! G& "B% & 淡黄色粉末 黄色 (号 #E "F( !! "B% !& "A% #F 黄色粉末 K黄色 #F号 EF "A% (! "AE (# "BA - 结晶 初始 白色粉末 黄色 %号 & "%B GA "!E G& "(B & 淡黄色粉末 黄色 (号 #% "!A !( "B! !E "%B #F 黄色粉末 K黄色 #F号 E# "!% (G "E# (# "%E ’ 冻干 初始 类白色粉末 黄色 &号 #F "#E GA "%# G& "A( & 黄色粉末 黄色 G号 EE "!( !% "E# (& "#! #F 黄色粉末 K黄色 #F号 %F "G% (A "B! AA "!G * 讨 论 * "! ’*+分子结构中含多个氮原子，故与固定相表面残余 硅羟基之间形成氢键而相互作用［B L &］，致使色谱峰严重拖尾 并展宽，因而与 ,异构体间分离效果很不理想，流动相中加 入适量三乙胺作为扫尾剂（54=3=:J@78MM217=:J 214J1:5），首先与 固定相表面残余硅羟基作用［B L &］，使 ’*+ 分子与这些硅羟 基的作用受到抑制，峰形大为改善，并提高了与 ,异构体的 分离度。实验表明，三乙胺量过低时，扫尾效果不太明显，增 至 F " %$时，峰形不再变化，拖尾因子接近于 #。 * "% ’*+和 ,-. 作为弱碱化合物在 NO,柱上的保留时间， 随流动相 MP升高逐渐降低见图 %，且 MP值的变化对几种有 关物质的分离度影响较大，MP Q B时，保留时间过长，峰形过 宽，影响积分，MPB L &时，’*+与 .@#&&#-分离不理想，经计 算机辅助优化定 MP为 & " &（即本法 MP值），分离较好。醋酸 浓度对 ’*+与 .@#&&#-的分离度也有明显影响，较低时，不 利于其分离。 图 + 流动相 MP值对 ’*+ / ,-. 及有关物质 !R的影响 # D ,异构体；E D ’*+；% D .@#&&#-；B D ,-. &’( + S:?381:;1 >? <>9=31 MP >: 501 !R >? ’*+ / ,-. 4:6 21345@ 16 789754:;17 # D ,@=7><12；E D ’*+；% D .@#&&#-；B D ,-. * "+ 质量研究表明：’*+两种工艺制得的产品内在质量存 在一定差异，冻干工艺产品的有关物质含量高于结晶产品 （表 #）。文献报道［#］，.@#&&#-主要在于 ’*+转化的钠盐中， 与转盐工艺有一定关系。实验表明，冻干品中该杂质稍高于 结晶品，’*+工艺条件控制得当，产品中一般检不出 ,异构 体。高温条件下放置，冻干品质量下降的速度高于结晶品， 贮存条件下的质量变化有待进一步考察。 * ") ’*+钠盐结晶产品含一分子结晶水，冻干产品不含结 晶水，但引湿性远高于结晶产品，游离水对 ’*+和 ,-. 均有 加速破坏作用（图 E），故在生产及贮存时，冻干品更易受环境 湿度的影响。实验表明，C，-两厂结晶产品的质量无明显差 别，均优于冻干品。文献［#］报道 ’*+在生产和贮存过程中 会聚合产生具有抗原性的高分子杂质，水分参与聚合反应的 发生。故两种工艺产品高聚物的情况有待进一步考察。 参考文献 ［!］ 中国药典［,］" #GGF年版，二部：#AE " ［%］ 梁贵键，朱莉 " EFF 种药物 R*@P*T’ 色谱行为测试及数据库 的建立与应用［U］"中国药学杂志，#GG&，%F（,8MM3）：BG " ［+］ 仇士林，林素青 "抗菌素类药品引湿性测定方法探讨［U］"药物 分析杂志，#G!#，#（E）：#F! " ［)］ 李修禄 "用 P*T’法分析碱性含氮有机药物的进展［U］，国外 医学·药学分册，#GG#：#!（&）：EA& " ［*］ R>>7 RV，W1HM>25 XO" X1:1243 21Y12716@M0471 0=J0 M12?>2@ <4:;1 3=Z8=6 ;02><45>J24M0=; <150>6 ?>2 501 71M4245=>: >? 628J7 87=:J 52=150I34<=:1 47 4 ;>