分子微生物生态学及其研究进展

分子微生物生态学及其研究进展 3 张惠文 3 3 　张倩茹　周启星　张成刚 (中国科学院沈阳应用生态研究所 , 沈阳 110016) 【摘要】　分子微生物生态学是分子生物学实验技术应用于微生物生态学研究领域而发展形成的一门交叉 学科 ,在研究微生物生态系统组成结构、功能的分子机理以及微生物与生物和非生物环境之间相互关系等 方面显示了巨大的潜力. 十几年来分子微生物生态学研究所取得的成就证明 :分子生物学研究技术向微生 物生态学领域的不断渗透 ,为微生物生态学研究领域注入了新的活力 ,尤其在微生物多样性、微生物区系 分子组成及变化规律以及微生物系统进化研究方面取得了重大突破. 本文根据近年分子微生物生态学的 研究进展 , 就分子微生物生态学概念的提出、发展历程、主要研究领域、主要研究方法以及未来研究热点 领域作以简要综述. 关键词 　分子微生物生态学 　分子生物技术 　微生物生态学 文章编号 　1001 - 9332 (2003) 02 - 0286 - 07 　中图分类号 　Q938. 1 　文献标识码 　A Introduction and progress of molecular microbial ecology. ZHAN G Huiwen ,ZHAN G Qianru ,ZHOU Qixing , ZHAN G Chenggang ( L aboratory of Terrest rial Ecological Process , Institute of A pplied Ecology , Chinese A2 cademy of Sciences , S henyang 110016) . 2Chin. J . A ppl . Ecol . ,2003 ,14 (2) :286～292. Molecular microbial ecology is an interdisciplinary field of molecular biological techniques and microbial ecology , which deals with microbial population , diversity , function , and relationships between microorganisms and biotic and abotic environments in microbial ecosystem. All the progress in molecular microbial ecology , especially in mi2 crobial diversity , phylogeny and communities of some microoganisms , indicate the renovation in traditional mi2 crobial ecology by the introduction of molecular techniques and strategies. This article reviewed the ideation ,de2 velopment , key domains , main methods and the future hot fields in molecular microbial ecology . Key words 　Molecular microbial ecology , Molecular technique , Microbial ecology. 3 中国科学院知识创新重要方向资助项目 ( KZCX22SW2416) .3 3 通讯联系人. 2002 - 06 - 25 收稿 ,2002 - 09 - 28 接受. 1 　引 　　言 微生物作为自然界生物系统中的重要一员 ,在地球物质 循环、能量转换、环境与健康等方面发挥着重要作用. 作为 自然界生态系统的一部分 ,微生物生态系统具有其自身的特 点 :1) 微生物就其种类和数量而言 ,是地球上仅次于昆虫的 第二大类生物[3 ] ;2) 由于频繁的遗传物质交换 ,微生物群落 表现出一定的遗传可塑性和灵活性 , 形成快速进化模式 ,并 在不同的选择压力条件下新功能基因在微生物群落内迅速 扩散 ,使整个群落遗传稳定性相对较差 , 这是导致目前所建 立的微生物分类系统还不十分完善的主要原因之一 ;3) 微生 物为适应各种生境条件 (从一般生态系统到其他生物很难生 存的极端环境) ,采取灵活的代谢方式和适应策略 ,导致了微 生物代谢途径的多样性和复杂性 ,给微生物生态学研究带来 了一定困难 ;4)大量微生物的不可培养性是传统微生物生态 学在揭示自然界微生物群落结构组成、生态功能及其相互关 系研究中的最大障碍. 由于自然环境尤其是极端环境中存在 大量不可培养的微生物 (unculturable microorganisms ,UCM) , 已经被分离并鉴定的微生物仅占估计数量的极少一部分 [3 ] , 使得单一种群生命活动对于整个群落功能的贡献和作用以 传统理论和方法很难测量和评价. 因此 ,传统的以细胞学为 基础的微生物生态学理论在某些方面存在偏差 ,最终导致微 生物多样性及生态学研究一直落后于其他生物的研究水平. 自 1953 年以来 , 以 Watson 等所建立的 DNA 分子结构 模型为标志 , 分子生物学理论和技术取得了惊人的成就. 许 多分子生物学研究方法和理念被应用到微生物生态学研究 中 ,为微生物生态学研究领域注入了新的活力 , 建立起难培 养微生物 (UCM)和不依赖于培养微生物 (culture2independent )生态学研究方法 ,使关于微生物多样性、微生物种群动力 学、重要基因定位、表达调控及其基因水平转移对生态系统 的影响等方面取得了长足的进展 ,并获得了许多意想不到的 新发现 ,极大地推动了分子微生物生态学的发展. 本文将就 分子微生物生态学概念的提出、发展历程、所涉及的主要研 究领域、主要研究方法以及未来研究热点等加以讨论. 2 　分子微生物生态学及其发展 分子生态学是伴随着分子生物学理论及其技术的不断 发展 ,向生态学研究领域的不断渗透 ,而逐步发展起来的一 个新的交叉研究领域. 1992 年 ,当《分子生态学》(《Molecular Ecology》)创刊时 ,编者对分子生态学概念进行了解释 :“分子 生态学的目的在于 :在分子生物学与生态学之间提供一个交 应 用 生 态 学 报 　2003 年 2 月 　第 12 卷 　第 2 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Feb. 2003 ,14 (2)∶286～292 汇点 , ⋯⋯用分子生物学研究方法提供生态学和种群生物学 中各个方面的新理论和新见解 ;主要探讨用分子生物学技术 解决有关自然和人为引入种群与他们所处环境之间的相互 关系 ,以及基因重组生物体 (genetic modified organism , GMO) 释放的生态风险问题. ”在阐述分子生态学的起源和发展时 指出 :分子生态学形成经历了 4 个阶段 ,即 1950～1970 年由 Ford创立的生态遗传学 ,代表了科学家为揭示生物在进化 框架内那些具有生态学意义的合理变异的最初尝试 ;60 年 代中期 ,同工酶电泳技术的引入及其蛋白质变异数据库的产 生 ,推动了对分子进化和适应进化等生物进化本质问题的探 索 ;20 世纪 80 年代开始 ,分子生物学研究技术被借鉴到生 态学研究中 ,在物种遗传多样性、分子适应、变异分子机制及 其进化意义等生态学基础理论研究方面均有所突破[12 ] . 1997 年 , Burk 等[10 ]指出 ,分子生态学已广泛地被认为是一 门明确的学科 ,在人们为分子生态学这个新术语划分界限的 同时 ,它已经迅速发展 ,并逐渐成为生态学研究中最有前途 的热点研究领域. 顾名思义 ,分子微生物生态学是利用分子生物学技术手 段研究自然界微生物与生物 (biotic) 及非生物 (abiotic) 环境 之间相互关系及其相互作用规律的科学 ,主要研究微生物区 系组成、结构、功能、适应性发展及其分子机制等微生物生态 学基础理论问题. 在过去 30 多年中 ,我们见证了以细胞水平 描述自然区系中微生物多样性及其结构、功能研究方面的巨 大成就. 然而 ,分子生物学技术与微生物生态学理论的结合 在微生物多样性及生物系统进化研究方面所取得的成就 ,标 志着分子生物学对微生物生态学研究领域最引人注目的贡 献. 事实证明 ,分子微生物生态学的诞生并不仅仅是研究方 法上的进步 ,而是在微生物生态学相关理论的阐述和现象的 解释方面也取得了意想不到的突破 ,是在传统微生物生态学 理论基础上的巨大进步 [3 ,51 ] ,使传统微生物生态学研究领域 由自然界中可培养微生物种群扩展到微生物世界的全部生 命形式 (包括可培养、不可培养、难培养的微生物及其自然界 中环境基因组等) ,由微生物细胞水平上的生态学研究深入 到探讨各种生态学现象的分子机制研究水平 ,提出了微生物 分子进化和分子适应等全新理念 ,使微生物生态学理论更加 接近其自然本质. 微生物生态系统由于其结构和功能的多样性和复杂性 , 常常被比喻为神秘的“黑匣子”(black box) . 传统微生物生态 学研究主要以微生物分离培养为前提 ,具有一定的局限性 , 使其在全面揭示这个神秘“黑匣子”的全部结构、功能及其相 互关系等信息方面显得束手无策. 尽管分子生物学研究工 具免不了存在这样或那样的缺欠 ,但是在被选择用来破译这 个神秘系统的真实信息方面 ,分子微生物生态学具有传统方 法所无法比拟的优势和特点. 大量微生物新物种的不断发 现 ,自然界中微生物多样性和生态学功能的重新认识 [14 ] ,微 生物生态学研究领域的不断深入和扩展等分子微生物生态 学所取得的初步成就 ,对以细胞培养技术为基础的传统微生 物生态学的理论和方法提出了挑战. 3 　分子微生物生态学主要研究领域 　　微生物生态学作为一门成熟学科 ,在发展过程中形成了 其自身的研究范围 ,而分子微生物生态学在传统微生物生态 学的基础上 ,其研究领域有了部分扩展和深入 ,取得了许多 创新性成果. 微生物多样性研究是微生物生态学最重要的研 究内容之一. 利用分子生物学技术和研究策略 ,揭示自然界 各种环境中 (尤其是极端环境) 微生物多样性的真实水平及 其物种组成 ,是微生物生态学各项研究的基础和核心 ,是我 们重新认识复杂的微生物世界的开端. 利用微生物 ssu rRNA 基因特点及 PCR 等分子生物学研究手段 ,微生物学家 对自然界各种环境中微生物多样性进行了详细的研究 ,证实 了在自然界除了我们已经获得并鉴定的微生物物种以外 ,还 存在着大量未被认知的微生物新物种及其新功能 [1 ,51 ] . A2 mann 等[3 ]根据微生物原位的、不依赖于培养的微生物系统 发育学研究结果认为 :在自然界中 ,通过实验室人工培养方 法已经被分离和描述的微生物物种数量仅占估计数量的 1 %～5 % ,而其余 95 %～99 %微生物种群还仍然未被分离 和认识[3 ] . Garrity[25 ]描述了细菌 869 个属、4928 个种 ,由此 推测地球上存在的细菌物种总数将达到 10～50 万种. 正是 通过分子生物学技术的发展和向微生物生态学研究领域的 渗透 ,以及我们对 ssu rRNA 分子特征及其在生物进化方面 的意义的了解 ,使我们对自然界中微生物多样性的认识有了 新的突破 ,使微生物生态学研究拓展到了那些尚未人知的难 培养微生物 (UCM)世界[50 ] . Woese 等[70 ]利用生物细胞中 ssu rRNA 序列同源性分析 结果 ,将生物系统分成了 3 个部分 ,建立了以 ssu rRNA 为标 准的生命系统发育树 ,即著名的生物“三域学说”. 在这个进 化树中 ,可培养细菌构成了 12 个主要的进化分支. 但是 ,在 近 10 年的发展过程中 ,利用分子生物学技术对所有可培养 和难培养微生物的 16S rRNA 进行分析后 ,推测细菌域中有 大约 36 个进化分支 ,其中许多分支微生物仍为不能培养的 种群[37 ] . 这是分子生物学技术在微生物系统学研究领域最 突出贡献之一. 这一成果是对传统的以形态特征和生理生化 特性等多种指标为依据所建立的系统进化关系和分类体系 的突破和创新 ,从分子遗传学角度对生物系统进化的本质进 行了诠释[3 ,51 ,71 ] . 随着分子生物学技术的不断进步和物种遗传改良技术 的不断完善 ,大量被遗传改良和分子修饰过的微生物工程菌 被人为地释放到环境当中 ,发挥他们的特定功能. 为了跟踪 检测这些微生物释放到自然环境后的命运 ,某些特异分子标 记为这项工作提供了可能. 另外 ,由于具有抗性特征分子标 记的大量使用以及向环境中的释放 ,将对自然环境和生态系 统的土著微生物区系造成潜在的生态影响. 因此 ,所引入的 遗传改良微生物 (genetic midified microorganisms GMM)及其 抗性分子标记在环境中的转移和生态安全问题 ,是我们关注 的重大环境问题之一 ,成为目前微生物学家和生态环境学家 关注的焦点[6 ,59 ] . 分子微生物生态学的理论和研究策略为 7822 期 　　　　　　　　　　　　　　张惠文等 :分子微生物生态学及其研究进展 　　 GMM 释放到环境中的命运和生态风险的评价 ,提供了科学 的理论指导和研究方法. 在地球上所有生物中 ,微生物以其灵活的适应机制和多 样性的代谢方式 ,适应各种复杂的生态环境. 从条件相对温 和的正常环境到条件恶劣 (强酸、强碱、高温、高压、高盐、营 养贫瘠等)的极端环境都有微生物生命活动的踪迹 ,形成了 各种独特的微生物生态系统. 微生物在各种生态系统中所 采取的代谢方式、种群组成、结构特点以及环境条件对生态 系统的影响等是微生物生态学要解决的又一重要课题. 由 于大量微生物种群的不可培养性 (尤其是极端环境古细菌 群) ,利用传统方法所获得的关于微生物多样性、种群组成和 结构特征的结果便显得不够完善 ,具有一定的局限性. 而利 用分子生态学理论和技术 ,研究各种不同生态系统微生物种 群组成、结构及其演替规律 ,使我们能够从本质上对自然界 微生物多样性、适应生存及其与环境之间的关系有了系统的 认识 ,为更好地研究和利用这些资源奠定基础. 从分子微生 物生态学产生的那一时刻起 ,大量工作便集中到该研究领 域 ,并积累了大量研究和研究结果 ,包括土壤微生物区 系及种群变化[23 ,33 ] ;污水处理系统微生物区系组成及其功 能[26 ,58 ] ;人类和动物肠道正常微生物区系 [22 ,61 ]及生理学意 义 ;水生生境中微生物区系 [44 ] ;口腔微生物区系 [41 ]等. Koonin 等[42 ]研究发现 ,在自然环境中 ,微生物基因及其 质粒等遗传因子在微生物种间的水平转移是普遍现象. 基因 水平转移并与宿主基因重组形成具有特异功能的微生物类 群 ,适应各种不同环境 ,形成各环境中的优势种群 ,这是微生 物适应各种环境条件而自然进化的动力之一 [52 ,66 ] . 分子生 物学技术是研究自然环境中不同种群间基因水平转移规律 及其在微生物进化和分子适应方面研究的最重要的手段 ,使 传统微生物生态学研究深入到分子水平. 分子微生物生态学在可水平转移的遗传因子的获得、重 组、基因突变、基因表达调控与微生物进化及其分子适应的 相关性研究方面取得了新的突破 :通过研究发现了在自然环 境条件下基因组重排 (gene shuttling) 现象 ;探讨了微生物多 样性与其所处生态环境之间的相互关系 ,以分子微生物生态 学的观点 ,阐述了生态环境因子 ,尤其是极端环境因子 (如污 染、高温、高压、强酸、强碱、高盐等) 对特定物种在时间和空 间上分布的影响 ,以及微生物适应环境胁迫的策略及其分子 机制 ;以 Escherichia coli 等一些已知基因组核苷酸序列的物 种为例 ,研究其在生态因子及环境条件变化下基因组核苷酸 序列的变异和重排 ,并探讨了这种变异在种群进化方面的意 义[8 ,9 ,27 ,66 ] ,为建立微生物在不同环境选择压力下的适应策 略和适应进化的分子机制理论奠定了基础. 环境问题是社会学家和生态学家关注的焦点 ,评价各种 污染物的环境生态效应以及被污染环境的生态修复是目前 全世界关注的三大主题之一. 在环境工程中分子微生物技 术发挥了重要作用 ,微生物遗传多样性及其微生物区系变化 评价指标的引入 ,使传统污染物生态风险评价指标体系更加 科学和更加完善 [67 ,68 ] . 同时 ,微生物以其独特的适应能力和 灵活的代谢方式 ,被应用于污染环境修复 ,具有得天独厚的 优越性. 大量具有污染物降解功能的基因被检测和定位 ,特 异菌株被选育 ,并开始应用于污染环境修复工程中 [4 ,17 ] . 农 药是目前重要的污染源之一 ,因而关于农药污染的生态评价 研究成为环境科学家的重要课题. 分子微生物生态学在农药 潜在的生态风险研究方面具有独特的优势 ,为完善农药生态 评价指标体系提供了依据. 同时 ,由于从自然界和污染环境 中分离纯化出具有农药降解活性的菌株及其基因 ,为农药污 染环境的生物修复 ,提供了可供选择的资源储备 [38 ,73 ] . 关于 重金属污染对环境中微生物区系的影响及微生物抗性机制 的研究也是研究的热点 ,积累了大量文献资料 [53 ,54 ] . 环境基因组 (metagenome) 是分子生物学技术应用于微 生物生态学研究领域而形成的一个新概念和重要的生物资 源.环境基因组学研究所取得的成果 ,为揭示微生物生态系 统功能及其分子基础 ,提供了更全面的遗传信息 ,为微生物 新功能基因的筛选、开发提供了物质基础 [57 ] . Torsvik 等[65 ] 研究证明 ,在不同土壤环境中存在着高度复杂的环境 DNA 序列多样性 ; Entchev 等[20 ]利用环境基因组克隆技术从微生 物共生体中分离出完整的操纵子及基因. Henne 等 [31 ,32 ]从 环境基因组库中筛选得到利用 42羟基丁酸酯的基因和具有 降解脂类活性的基因. Cottrell 等 [15 ]从海洋微生物中分离出 几丁质酶基因 ,并应用于生产. 这些事例证明 ,环境基因组 (尤其土壤环境基因组)是有待开发的重要基因资源库 ,是一 种重要的有待开发的自然资源. 环境基因组还包括了比传统 可培养微生物 (culturable microoganism)基因组所包含的更多 的遗传信息. 因此 ,有关环境基因组遗传信息学方面的研究 结果 ,将赋予微生物生态学所有现象和规律方面更本质的理 解. 微生物与植物共生现象 (有益共生及有害共生) 是自然 界中生物共生现象之一. 微生物与植物在长期共同进化过 程中 ,形成了独特的共生方式 ,对维持生态系统的健康发展 具有重要的意义. 由于传统的以共生菌分离培养为基础的 研究方法的局限性 ,所获得的共生菌数量和种类十分有限. 微生物显微观察研究却发现 ,大量共生菌存在于植物茎、叶 及根内 ,由于得不到微生物纯培养 ,而限制了对此类微生物 特征及功能的认识和研究. 分子生物学技术的引入 ,为研究 植物共生菌及其生态学意义提供了有效的方法 ,使其成为当 前微生物生态学和资源学研究的重要课题之一 [24 ,29 ,60 ] . 4 　分子微生物生态学涉及的主要研究方法 411 　标记核酸探针杂交技术 　　原位荧光杂交技术 (fluorescent in situ hybridazation , FISH)是根据已知微生物不同分类级别上种群特异的 DNA 序列 ,以利用荧光标记的特异寡聚核苷酸片段作为探针 ,与 环境基因组中 DNA 分子杂交 ,检测该特异微生物种群的存 在与丰度. 该方法的特点是可以进行样品的原位杂交 ,应用 于环境中特定微生物种群鉴定、种群数量分析及其特异微生 物跟踪检测 ,是目前在分子微生物生态学领域应用比较广泛 882 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　14 卷 的方法之一[28 , 34 ,48 ] . 　　分子杂交及同源性分析 (DNA2DNA/ DNA2RNA) 方法是 分子微生物生态学发展初期 ,在 PCR 技术尚未发明之前的 主要研究方法 ,是研究微生物区系系统发育关系、微生物鉴 定、微生物物种之间同源性等分子微生物生态学研究方法的 基础[36 ] . 　　荧光蛋白质2核苷酸特异探针原位杂交 (protide nucleic acid , PNA)以荧光标记的特异多肽为探针 ,通过 PNA 在原 位与样品中的 DNA 结合 ,对样品中的微生物进行鉴定及原 位分析. PNA 探针与 DNA 探针相比 , PNA 具有探针短 ,与 样品中 DNA 杂交速度快 ,而且杂交时不依赖于缓冲液盐的 浓度等优点 ,并且 PNA 的两性电解质骨架 ,使其更适合于原 位杂交. 该方法代表了微生物区系遗传信息与微生物功能和 代谢方式多样性之间相互关系研究方法的发展趋势 [69 ] . 412 　基于 PCR 技术的研究方法 　　PCR 是 1985 年由 Mullis 发明的一种聚合酶链式反应技 术 ,主要特点是短时间内在实验室条件下人为地控制并特异 扩增目的基因或 DNA 片段 ,使研究的目的基因及其环境样 品中的微量微生物基因得到无限的扩增 ,为这些基因和微量 微生物种群的研究提供了保证. 　　末端限制性片段长度多态性 T2RL FP (terminal restric2 tion fragment length polymorphism) 研究方法是利用一定的 标记引物对样品中 DNA 进行特异扩增 ,然后进行限制性内 切酶酶切 ,检测末端限制片段的多样性 ,主要应用于微生物 群落组成和结构、微生物系统发育及其菌种鉴定等研究 ,是 一种应用比较广泛的微生物生态学研究方法 [18 ,45 ] . 限制性 酶切片段多态性 RFL P (restriction frangment length polymor2 phism)方法是利用限制性内切酶特性及其电泳技术 ,对特定 的 DNA 片段的限制性内切酶产物进行分析 ,对微生物遗传 多样性尤其是微生物的种下分类具有重要意义 [40 ] . 　　PCR 技术的发明和不断完善 ,不仅为分子生物学的发 展作出了巨大的贡献 ,同时也为分子微生物生态学的发展和 分析技术的建立提供了有利工具. ssu rRNA 以其在生物生 命活动中结构和功能的广泛性和保守性 ,实验室条件下的可 操作性 ,不同物种高级和初级结构的相对特异性 ,特定物种 rDNA 序列在进化过程中的稳定性被选择用来作为微生物 分子标记. 在分子微生物生态学中 ,以 rDNA2PCR 分子微生 物生态学研究方法为基础 ,利用小亚基核糖体核酸 16S rRNA (ssu rRNA)作为微生物分子标记 (molecular signature) 及其自然进化分子钟 ,为自然状态下不依赖于培养的微生物 生态学研究及其微生物自然进化过程研究提供了技术平 台[46 ,51 ] . 　　在 PCR 反应中 ,由于不同的引物决定了扩增产物的特 异性 ,所以利用不同随机引物 ,选择性扩增 DNA 片段. 根据 电泳后多态性片段的特点 ,通过分析样品多样性所建立的随 机引物扩增多态性 ( random amplified polymorphic DNA , RAPD)方法 ,可方便地检测同源和异源等位基因的存在 ,适 合于微生物种内和种下分类和鉴定 ,被广泛应用于微生物分 类、基因鉴别、系统发育等方面[11 ] . ARDRA (amplified ribo2 somal DNA restriction analysis)扩增性 rDNA 限制性酶切片段 多态性分析方法是由 16S rDNA2PCR 技术与 RFL P 技术相 结合而发展起来的分子微生物生态学研究技术. 由于该方法 分析样品不受是否可培养的影响 ,在植物共生微生物、寄生 微生物多样性及其系统学研究方面具有独特的优越性 ,得到 广泛的应用[35 ] . DNA2PCR2RFL P 技术综合了分子生态学中 常用的 AFL P、IGS(intergenic gene spacers )2PCR2RFL P 以及 ARDRA 技术 ,应用于微生物遗传多样性、区系组成及其变 化规律研究方面 [21 ] . 该方法综合了各研究方法的优势 ,使微 生物生态学研究方法更加方便和稳定. 以 PCR 原理为基础 发展起来的定量 PCR 应用于环境样品中特定微生物物种、 种群的定量分析 ,能更精确地研究自然环境中特异微生物组 成特征和变化规律 [64 ] ,使微生物生态学对微生物区系的组 成研究更定量化 ,更加精确 . 反转录 PCR (reverse trancrip2 tion2PCR RT2PCR) 技术是利用反转录酶 ,使样品中 mRNA 反转录为 DNA ,然后利用 DNA 分析方法进行研究. 虽然在 活的微生物细胞中 mRNA 的含量较高 ,但当细胞死亡和裂 解以后 ,释放到环境中的 mRNA 迅速被降解. 因此 , RT2 PCR 技术常被用来分析环境样品中活体微生物生存状况和 活性. SSCP(single strand conformation polymorphism) 单链构 像多态性 PCR 技术 ,利用 DNA 片段核苷酸组成的差异 ,造 成单链构像的不同 ,使单链 DNA 或 RNA 分子在电泳时产生 特异性谱带. 该项技术是由 Orita 等于 1989 年发明 , Hayashi 等[30 ]对该技术进行了详细的描述. 此后被应用于微生物鉴 定、微生物区系、微生物多样性等研究领域 [59 ,63 ] . 413 　微生物基因组中特异 DNA 片段的序列分析 　　16S rDNA PCR 扩增片段核苷酸序列分析 (16S rDNA2 PCR2Sequencing )技术是分子微生物生态学研究最早应用的 方法之一 ,并在分子微生物系统学、微生物的分类鉴等研究 方面作出过重要贡献. 虽然该方法比较耗时 ,且需要大量财 力支持 ,但是由于该方法对微生物细胞中 16S rRNA 基因进 行特异扩增后对核苷酸序列进行测定 ,并与已知菌种 16S rRNA 进行比较 ,以此进行微生物鉴定和微生物系统学研 究 ,因此该方法是目前比较准确的方法之一 ,在微生物生态 学研究中占有重要的地位 [7 ,13 ] . 　　rRNA 间隔翻译区 ( rRNA internal tanscribed spacer , ITS)核苷酸序列分析方法利用微生物特异 ITS 引物 ,从环 境样品尤其是难分离的微生物共生样品中 ,通过 ITS2PCR2 RFL P 技术对不能人工分离培养的微生物进行了鉴定和分 类 ,解决了 AM 由于不可培养性而导致的分类和系统学研究 的难题[55 ] . IRS(internal spacer of rRNA) / 16S223S RGS(16S2 23S ribosomal genes spacer) 利用 16S223S rDNA 间隔区特异 核苷酸引物 ,扩增该间隔区的核苷酸片段 ,然后分析该扩增 片段的核苷酸序列或比较其差异 ,而进行微生物分类和多样 性研究[47 ] . 414 　DNA 扩增片段电泳检测技术 　　变性梯度胶电泳技术 ( denaturing gradient gel elec2 9822 期 　　　　　　　　　　　　　　张惠文等 :分子微生物生态学及其研究进展 　　 trophoresis ,D GGE)最早应用于生物基因点突变检测 ,他的发 明使传统琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分辨精度 提高到一个核苷酸残基差异水平. Myuzer[49 ] 第一个将 D GGE电泳检测技术应用于分子微生物学研究领域 ,并证明 该技术在揭示自然微生物区系的微生物遗传多样性和微生 物种群异化方面具有独特的优越性 ,因此被广泛引用到分子 微生物生态学研究领域 ,尤其在微生物多样性检测、微生物 鉴定、微生物分子变异以及种群异化等方面得到广泛的应 用[62 ] . 　　温度梯度胶电泳技术 ( temperature gradient gel elec2 trophoresis , TGGE) 利用温度梯度变性的原理 ,对不同核苷 酸片段进行分离分析 ,具有方便 ,结果分辨率高等特点 ,因此 在分子微生物生态学研究中得到广泛使用 [19 ] . 415 　环境基因组 DNA 提取方法 　　环境样品微生物总基因组 DNA 提取技术的建立和发 展 ,为分子生物学技术在微生物生态学研究中的应用提供了 物质基础. 关于环境中微生物总 DNA/ RNA 提取方法研究 内容较多 ,主要包括 :DNA/ RNA 提取方法建立和比较研究 ; 提取 DNA/ RNA 粗样品进一步纯化方法研究等. 这是分子 微生物学研究中的一项重要技术. 因为在提取环境样品 (尤 其是土壤样品)基因组 DNA/ RNA 时 ,同时被提取的还有样 品中存在的杂质 (腐殖酸、多糖、酚类等物质) ,这些杂质对后 续 PCR 过程中有关酶的活性和实验结果的真实性及稳定性 有极大的影响 ,因此要想获得真实可靠的实验结果 ,获得较 高纯度的环境总 DNA/ RNA 是致关重要的 [2 ,43 ,56 ] . 　　环境样品中总 DNA/ RNA 直接提取方法 :不经过微生 物培养分离过程 ,对样品进行 DNA/ RNA 直接提取 ,这样可 以保证所获得样品具有一定的代表性 ,克服了传统方法微生 物培养技术的局限性 [16 ,43 ,56 ] . 此法主要是采用物理或化学 方法将细胞中的 DNA/ RNA 游离释放出来 ,然后进行直接 提取. 物理方法包括研磨、机械破碎 ( bead beater homogen2 enization) 、超声波破碎法 (ultrasonic) 等. 而化学法包括变性 剂 SDS、CTAB、PVP、溶菌酶法等. 　　环境中基因组 DNA 的间接提取 :即在实验室条件下 ,通 过改进人工分离培养基的特异性和培养条件来分离纯化环 境样品中的微生物 ,然后提纯 DNA ,并进行分析. 这种方法 由于受到人为因素的影响较大 ,受到微生物培养特性的制 约 ,故利用此方法获得的微生物多样性和区系组成的信息存 在一定的不足. 5 　分子微生物生态学应用 　　国际微生物生态学会在描述当前微生物生态学研究的 热点时指出 ,随着分子微生物生态学的起步和发展 ,分子微 生物生态学在以下研究领域正有所作为 [39 ] :1) 我们从哪里 来 ? 我们如何而来 ? 这是困扰生物学家的首要问题. 因为微 生物是地球上出现最早的生命形式 ,所以利用分子生物学技 术解决微生物起源和早期进化问题 ,可以为生命起源的初期 形式提供信息. 2)微生物漫长的进化历史造就了丰富的微生 物多样性 ,而其中近 95 %～99 %的微生物物种刚刚开始被 人类所认识和了解 ,估计自然界中有近一百万种微生物存 在 ,但是到目前为止仅有近五千种被描述. 要揭示复杂世界 的多样性 ,分子生物学研究技术将显示出巨大的潜力. 3) 在 地球以外的太空中是否存在生命 ? 这是目前生物学界关注 的问题之一. 如果外空存在生命的话 ,估计最有可能的是微 生物 ,而在我们尚未认识他们时 ,不可能有有效的分离方法. 此时利用分子微生物生态学的研究方法和策略 ,是最佳选择 . 4)不同生态环境对微生物区系的影响及其微生物对环 境条件变化的响应规律. 5)在退化生态系统和污染环境的微 生物生物修复工程中 ,微生物及其工程菌的作用最具前途 ; 6)以分子微生物生态学的观点重新审视参与自然界物质循 环的微生物种群及其他们在其中的作用. 6 　结 　　语 　　分子生物学技术对传统微生物生态学理论和研究方法 的冲击是巨大的 ,取得的突破是显著的. 但是在研究和发展 分子微生物生态学的过程中 ,应该注意分子生物学技术本身 存在的不足及其在研究过程中不稳定因素对实验结果的影 响[5 ] . 因此 ,在利用分子生物学所取得的结果进行理论探讨 时 ,应该时刻考虑到方法的代表性和稳定性 ,同时应参考传 统微生物生态学分析方法所获得的结果 ,作出合理的判断和 解释 ,只有这样才能使分子微生物生态学健康发展. 参考文献 1 　Aharon O. 2002. 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