8 抗原抗体反应

null第八章 抗原抗体反应抗原抗体反应（antigen-antibodyreaction）是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。可发生于体内，也可发生于体外。 体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用。 体外反应则根据抗原的物理性状、抗体的类型及参与反应的介质（例如电解质、补体、固相载体等）不同，可出现凝集反应、沉淀反应、中和反应及补体参与的反应等各种不同的反应类型。 可用已知的抗原（或抗体）检测未知的抗体（或抗原）。 因抗体主要存在与血清中，故又称为血清学反应。 第八章 抗原抗体反应null 抗原抗体特异性结合 ▼ 抗原和抗体分子结构互补性与亲和性 ▼ 抗原-抗体结合力 ＊ 疏水作用, 氢键, 范德华引力, 静电吸引作用 非特异性促凝聚 由亲水胶体转为疏水胶体的变化(一) 原理一、抗原抗体反应的原理与特点 null一、抗原抗体反应的原理与特点 （二）特点 ◆ 特异性(和交叉反应) 　 →反应的主体 ◆ 可见性（比例性）：反应体系中抗原/抗体最适比例 →决定反应结果的关键因素 ◆可逆性：非共价可逆结合 一定条件下（低pH、高浓度盐、冻融等） →抗原-抗体可被解离 null抗原抗体比例对反应现象的影响null 电解质 不可缺少 酸碱度 pH 6-8 温度 15-40c 二、影响抗原抗体反应的环境因素三、抗原抗体反应类型三、抗原抗体反应类型凝集反应 沉淀反应 补体参与的反应 中和反应 免疫标记技术(免疫荧光技术、免疫酶技术、同位素标记技术等)（一）凝集反应(Agglutination)（一）凝集反应(Agglutination) 细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后形成凝集现象，称为凝聚反应。 直接凝集：颗粒性抗原与相应的抗体直接反应，出现的凝集现象。 间接凝集：将可溶性抗原吸附于与免疫无关的小颗粒（载体）表面，此吸附抗原（或抗体）的颗粒与相应的抗体（或抗原）结合，在有电解质存在的适宜条件下而发生的凝集反应。 ▼间接凝集抑制试验：将可溶性抗原与相应抗体预先混合并充分作用后，再加入致敏载体，此时因抗体已被可溶性抗原结合，阻断了抗体再与致敏载体上抗原的结合，不再出现凝集现象。临床常用的免疫妊娠试验即属此类。null（二）沉淀反应（Precipitation)（二）沉淀反应（Precipitation) 血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶性抗原与相应抗体结合后出现的沉淀物现象称为沉淀反应。沉淀反应分类:▼ 液相沉淀：以无机盐缓冲液为介质。 ▼ 琼脂扩散（免疫扩散）：以凝胶为介质。 - radial immunodiffusion （单相扩散） - double immunodiffusion （双相扩散） ▼ 凝胶免疫电泳：在直流电场中进行的凝胶扩散。 - rocket immunoelectrophoresis （火箭电泳）null沉淀反应特点: ◆ 液相沉淀 Ag、Ab自由接触，需时短。 ◆琼脂扩散 Ag、Ab在固相化的凝胶中扩散，比液相慢，但Ag／Ab复合物不易散开，位置稳定，适合染色，可长期保存结果。 ◆ 凝胶免疫电泳 在电场下扩散和反应速度加快，节省时间。 电场规定了扩散方向，使反应集中，灵敏度提高。单向免疫扩散 (Single Immunodiffusion)单向免疫扩散 (Single Immunodiffusion)是将一定量已知抗体混于琼脂凝胶中制琼脂板，在适当位置打孔后将抗原加入孔中扩散。抗原在扩散过程中与凝胶中的抗体相遇，形成以抗原孔为中心的沉淀环，环的直径与抗原含量成正比相关。本法常用于测定血清IgG、IgM、IgA 和 C 3等的含量。null双向免疫扩散 （Double Immunodiffusion)双向免疫扩散 （Double Immunodiffusion)是将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，二者自由向周围扩散并相遇，在比例合适处形成沉淀线。如果反应体系中含两种以上的抗原抗体系统，则小孔间可出现两条以上的沉淀线。本法常用于抗原或抗体的定性 、组成和两种抗原相关性分析的检测。Ab琼脂免疫电泳 （Immunoelectrophoresis)免疫电泳 （Immunoelectrophoresis)是先将待测血清标本作琼脂凝胶电泳，血清中各蛋白组分被分成不同的区带，然后与电泳方向平行挖一小槽，加入相应的抗血清，把分成区带的蛋白抗原成分作双向免疫扩散，在各区带相应的位置形成沉淀弧。该法常用于血清蛋白种类分析，以观察Ig的异常增多或缺失。null将抗体混入琼脂内; 将待测样品（抗原）加入琼脂一端的加样孔中，进行电泳; 当定量的抗原在含有适量抗体的琼脂中泳动时，走在前面的抗原遇到琼脂中的抗体时，达到适当比例时形成大的不溶性复合物而发生沉淀，不再移动； 未与抗体结合的抗原以及较小的可溶性复合物可穿过此沉淀继续向前迁移，形成新的沉淀，但沉淀带越来越窄，直至全部抗原与抗体结合形成火箭峰样沉淀。 抗原含量越高，火箭峰越长。 * 实验流程 抗体+琼脂琼脂板  打孔数个(孔与板缘距离1cm)  加入样品(由低浓度到高浓度)  电泳火箭电泳null（三）中和反应细菌外毒素或病毒与相应抗体结合所致的中和反应 　　中和试验是免疫学和病毒学中常用的一种抗原抗体反应试验方法，可用于毒素或病毒种型的鉴定与抗原性分析，还可用于抗毒素或中和抗体的效价滴定。 null（四）补体结合反应（ComplementFixation, CFT) 敏感性和特异性均较高，但该试验影响因素较多，现在已有被其它新方法取代的趋势。原理：根据补体的作用无特异性，能与任何一种抗原抗体复合物结合；但当抗原与抗体不相对应时，补体则不被结合而游离存在。此时如在上述反应系统中．加入绵羊红细胞(抗原)和溶血素(抗体)系统，即可与游离的补体结合而出现溶血现象。因此，绵羊红细胞和溶血素是CFT的指示系统(亦称溶血系统)。试验结果根据溶血现象是否产生，即可得知检测系统中有无相应的抗原或抗体存在。（五）免疫标记技术（五）免疫标记技术用荧光素、同位素或酶等示踪物质 标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。标记物质与抗体（或抗原）的化学连接未改变抗体（或抗原）的免疫学特性，同时标记物的性质依然存在，因而极大的提高了反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、定性或定位检测。 免疫标记技术主要有三种基本类型：免疫荧光技术、免疫酶技术和同位素标记技术。免疫荧光技术 (Immunofluorescence Technique)免疫荧光技术 (Immunofluorescence Technique)是用荧光素（常用的有异硫氰酸荧光素，FITC) 与抗体连接成荧光抗体，再与待测标本的抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发出荧光，借此对标本中的抗原作鉴定和定位。 包括直接荧光法、间接荧光法和补体法。null直接荧光法：将荧光素直接标记抗体作标本染色。该法的优点是特异性强，但其缺点是每检测一种抗原必须制备相应的荧光抗体。 间接荧光法：用一抗与标本中的抗原结合，再用荧光素标记的二抗染色。该法的优点是敏感性比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗可用于多种抗原的检测，但非特异性荧光亦会增加。 补体结合免疫荧光法：此法是在间接法的第一步抗原—抗体反应时加入补体，使之与抗原——抗体复合物结合；再用荧光素标记的抗C3抗体进行示踪。null间接免疫荧光法示意图nullnull流式细胞术 （Flow Cytometry, FCM) FCM是将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对单个细胞的表面标志（抗原或受体）进行快速、精确的分析和自动检测，并将不同类型的细胞分选收集。FCM还可对同一细胞的多种参数（如DNA、RNA、蛋白质和细胞体积等）进行多信息分析，为当代生命科学研究领域中广泛使用的一项新技术。null流式细胞术： 酶免疫测定 (Enzyme Immunoassay, EIA)酶免疫测定 (Enzyme Immunoassay, EIA) 是用酶（常用的有辣根过氧化物酶，HRP和碱性磷酸酶，AP) 标记的抗体进行的抗原抗体反应。EIA将抗原抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后显色来判定结果。 常用的方法 * 酶免疫组化法：测定组织中或细胞表面抗原 * 酶联免疫吸附试验（ELISA）：测定可溶性抗原或抗体酶联免疫吸附试验 (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)酶联免疫吸附试验 (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原抗体反应进行,再利用酶标记的第二抗体来检测。洗去未结合的标记抗体之后加入相应底物,在酶的催化下引起底物水解显色,可通过分光光度计或者酶标仪进行读取。方法主要有双抗体夹心法、间接法、BAS-ELISA等。nullnull放射免疫测定法 (Radioimmunoassay, RIA)放射免疫测定法 (Radioimmunoassay, RIA)是用放射性核素标记抗原进行的免疫学检测技术。它将放射性核素显示的高灵敏性和抗原抗体反应的特异性结合，使检测的敏感性达pg水平。常用于标记的放射性核素有I125和I131。常用于胰岛素、生长激素、药物等微量物质的测定。null或放射 自显影RIA法原理及标准曲线RIA法原理及标准曲线 7550 30 100110100 1000未标记抗原浓度（ng/ml)结合/未结合的放射活性（%）