HPLC测定黄芪桂枝五物汤及方中药对的黄芪甲苷含量

第12卷第2期 2006年2月 中国实验方剂学杂志 ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormulae V01．12．No．2 Feb．，2006 HPLC测定黄芪桂枝五物汤及方中药对的黄芪甲苷含量 施旭光+，许晓峰，朱伟，黄兆胜 (广州中医药大学中药学院，广东广州 510405) [摘要】 目的：测定黄芪桂枝五物汤不同配伍情况下黄芪甲苷的溶出量。：采用高效液相色谱法，色谱条件：色谱柱： HypersilODSC。。柱(4．6mm×250ram，5tim)，流动相：甲醇．水(20：80)为流动相；检测波长：201nm；流速：1．0mL／min。结果：不同配伍 组黄芪甲苷的溶出量也不同，全方组为0．079％，黄桂组、黄姜组、黄白组、黄枣组、黄芪组分别为0．079、0．069、0．061、O．055、 0．062％。结论：方中不同药味与黄芪配伍后，对黄芪甲苷的煎出量有不同程度的影响。 [关键词】黄芪桂枝五物汤；高效液相色谱法；黄芪甲苷 [中图分类号】R284．1[文献标识码】 B [文章编号] 1005．9903《2006)02．0020'03 DeterminationofAstragalosideinHuangqiGuizhiWuwuTang anditsCompatiblerecipesbyHPLC SHIXu—guang，XaXiao-feng，ZHUWei，HUANGZhao-sheng (GuangzhouUniversityofTraditionalTraditionalChineseMedicine，Guangzhou510405，China) [Abstract]Objective：TodeterminethecontentsofdissolvedastragalosideinHuangqiGuizhiWuwuTang (HQGZWWT)anditscompatiblerecipes．Methods：ThecontentsofAstragalosidewasdeterminedbyHPLC，theanalysis wascarriedonanHypersilC18(4．6×250mm，5／zm)columnelutedwithmethanol—water(20：80)asmobilephaseand detectedat201nm，withflowrate1，0mL／min．Results：Thecontentsofdissolvedastragalosideweredifferentinthe differentcombinationsoftheherbaldragsdissimilarteam．Itwas0．076％inHQGZWWTandinHuang—Gui，Huang— Jiang，Huang—Bai，Huang—ZaoandHuangqiteams，thecontentsofastragalosidewere0．079％、0．069％、0．061％、 0．055％and0．062％respectively．Conclusion：RadixAstragelicombinedwithdissimilarChinesedrugsinHQGZWWT wouldevidentlyaffectthecontentsofdissolvedAstragaloside． [KeywordsJ HuangqiGuizhiWuwuTang；HPLC；Astragaloside [收稿日期]2004—12．21 【通讯作者]施旭光，E-mail：gzzyydxsxg@126．eom (2)甲醇提取方法的考察石油醚脱脂后的样 品分别用甲醇50mL超声提取和索氏提取器提取，提 取液过滤、定容，用上述聚酰胺薄层法试验，两 种提取方法中的芦丁斑点大小、颜色相同，超声提取 法操作简便，故选择超声提取法。 (3)甲醇超声时间的考察石油醚脱脂后的样 品分别用甲醇50mL超声20min和30min，提取液滤 过，定容至50mL，摇匀，用微孔滤膜(0．45ttL)滤过， 取续滤液，用高效液相色谱法测定，二者峰面积相 近，说明，甲醇超声提取20min即可。 ·20· 3．2 HPLC方法学研究中，流动相选择曾试用过甲 醇水、乙腈水系统的多种比例，均不能在该制剂中有 效分离芦丁。经反复筛选确定四氢呋喃．水．冰醋酸 (25．5：73：1．5)为流动相，使槐角痔疮膏中的芦丁得 到了成功分离，并且保留时间在10min之内。 【参考文献] [1]王爱月，傅乃华，程瑞生．紫外分光光度法测定槐角丸 中总黄酮含量[J]．河北中医，1994，16(2)：31． 万方数据 第12卷第2期 2006年2月 中国实验方剂学杂志 ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormulae V01．12．No．2 Feb．。2006 黄芪桂枝五物汤是《金匮要略》中治疗痹症的一 首名方，由黄芪、桂枝、白芍、生姜、大枣五味中药组 成，具有益气温阳、温经散寒、通痹止痛的功效，可用 于治疗类风湿性关节炎等疾病。本文从黄芪桂枝五 物汤君臣佐使配伍关系出发，以君药黄芪为核心，进 行药物配对研究，采用高效液相色谱法¨、2o测定全方 及各药对中黄芪甲苷的含量，以考察不同配伍情况 对黄芪甲苷煎出量的影响。 1材料 1．1仪器和试剂 SUMMITT”P680型高效液相色谱 仪(美国DIONEX)，ASI。100型自动进样器，PDA一100 型二极管陈列检测器，STH585柱温控制器。电热恒 温水浴锅(上海医疗器械取厂)，BSll0S型电子天平 (北京赛多利斯仪器系统有限公司)，黄芪甲苷对照 品(中国药品生物制品鉴定所提供，0781．200109)；甲 醇(色谱纯)，实验中所用其它试剂均为纯，包 括：正丁醇(上海三浦化工有限公司，批号： 20010828)、甲醇(广州化学试剂厂，批号：20011106— 2)、无水乙醇(广州化学试剂厂，批号：20020301—2)、 氢氧化钠(汕头市光华化学厂，批号：20021013)。 1．2药材黄芪：膜荚黄芪Astragalusm,emblarlgtceas (Fich．)Bge．，桂枝：CinnamomumcassiaPresl，白芍： PaeonialactifloraPall．，生姜：ZingiberoffwinaleRose．， 大枣：Zi五phusjujubaMill．，所有中药均经过本校中药 鉴定教研室李薇教授鉴定。 2方法与结果 2．1色谱条件色谱柱：HypersilODSC。。柱(4．6mm ×250mm，5肛m)，大连依利特科学仪器有限公司；流 动相：甲醇一水(20：80)；检测波长：201nm；柱温： 20。C；流速：1．OmL／min。 2．2曲线的绘制 精密称取黄芪甲苷对照品 10．0rag，以甲醇溶解并定容于10mL容量瓶中，分别 吸取对照品溶液2、4、6、8、lOptL，按上述色谱条件进 行测定。以峰面积的积分值为纵坐标(Y)，黄芪甲 苷含量(mg)为横坐标(x)，绘制标准曲线，求得回归 方程：Y=0．3413×103X一0．318，r=0．9997。表明 黄芪甲苷在2～10肛g范围内线性关系良好。 2．3 精密度实验 精密称取黄芪甲苷对照品 3．87mg，以甲醇溶解并定容于2mL容量瓶中，吸取对 照品溶液109L重复进样5次，测定峰面积，计算黄 芪甲苷峰面积积分值的相对标准偏差，其RSD为 1．48％。 2．4稳定性实验 取2．3项下标准溶液，每隔 30rain进样一次，共5次，每次进样量为IO／ML，测定 峰面积，计算黄芪甲苷峰面积积分值的相对标准差， 其RSD为1．35％，说明黄芪甲苷在2．5h内稳定性较 好，符合。 2．5重复性试验按2．8．2项下方法，取同一批供 试品进行5次测定。结果RSD=1．28％(n=5)，表 明重现性符合要求。 2．6回收率实验精密取5份已知黄芪甲苷含量 的样品，分别准确加入黄芪甲苷标准对照品溶液 (0．46mg／mL)2．0mL，按供试液同法处理，上样测定黄 芪甲苷的回收率。其平均回收率为99．8％，RSD为 1．81％，结果见表1。 表1加样回收率试验结果 2．7空白试验取已提取纯化的阴性组(组成见表 2)，按样品测定项下的色谱条件测试。 2．8样品组成及溶液的制备 2．8．1药对组合分为黄芪桂枝五物汤组，黄芪．桂 枝组，黄芪一自芍组，黄芪一生姜组，黄芪一大枣组，黄芪 组共6组。各组药物组成及剂量见表2。 2．8．2样品溶液的制备将以上7组中药按表2 所示剂量，分别按常法煎二次，纱布过滤，合并二次 滤液，并用水洗涤纱布，水浴浓缩并定容到lOOmL， 备用。 分别精密吸取不同组方的水煎剂20mL，用水饱 和的正丁醇萃取4次(20，15，15，10mL)，合并正丁醇 液，以0．5％氢氧化钠洗涤3次(10，10，5mL)，再用蒸 馏水洗涤2次(10mL，10mL)，弃去水层，取正丁醇溶 液置水浴上蒸干，残渣用蒸馏水5mL溶解，水溶液加 至D㈣型大孔吸附树脂柱(1．5×12cm)内，用蒸馏水 50mL洗脱，弃去水液，再用30％乙醇30mL洗脱，弃 去30％乙醇洗脱液，继续用70％乙醇50mL洗脱，收 集洗脱液，置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解，移入 2mL容量瓶中，以甲醇稀释至刻度，作为供试品溶 液。 · 21 · 万方数据 第12卷第2期 2006年2月 中国实验方剂学杂志 ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormulae V01．12．No．2 Feb．，2006 2．9样品的测定各供试品溶液进样10tsL，按上述 色谱条件进行测定，按各药对取样量求出相应百分 浓度，并计算其含量，结果见表2及图1。 3方差分析 采用SPSSl0．0统计软件分析。根据方差齐性 检验结果，分别采用LSD或Tamhane’sT2法进行分 析。 表2黄芪桂枝五物汤及各药剂量及黄芪甲苷含量(n=3) 注：1)表不与五物汤组、黄一桂组比较，P<0．01；2)表示与黄一白、 黄芪组比较，P<0．01。 单因素方差分析 以黄芪桂枝五物汤不同配伍 作为因素变量，黄芪甲苷含量作为因变量，以探讨不 同配伍是否对黄芪甲苷溶出率有显著影响，方差分 析结果有显著性差异。 多重比较分析 由方差分析结果显示，配伍使 得供试液间黄芪甲苷含量存在显著差异。为进一步 了解两两水煎液中黄芪甲苷含量是否存在显著差 异，作多重比较检验，结果见表2。 4讨论 中药汤剂多为复方，每种生药又含有多种化学 成分，临床共煎过程中可能产生挥发、水解、中和、沉 淀等一系列十分复杂的化学物理变化，这些变化直 接影响到制剂的疗效和毒副作用。本实验采用 HPLC考察黄芪桂枝五物汤不同配伍情况是否会影 响黄芪中黄芪甲苷的煎出量，实验结果表明：桂枝、 生姜与黄芪配伍后能显著增加黄芪甲苷的煎出量； 白芍与黄芪配伍后，黄芪甲苷的煎出量基本无影响； 而大枣与黄芪配伍后，黄芪甲苷的煎出量显著下降； 五物汤全方中黄芪甲苷的煎出量显著上升，这是方 中几种药物综合作用的结果。方中黄芪与桂枝配伍 后黄芪甲苷的溶出率最高，这也从一方面说明桂枝 · 22· 2 3 黄芪甲苷对照品 l川 1 2 3 黄一桂 1 2 3 黄一姜 1 2 3 黄芪 1 2 3 五物汤 1． 2 3 黄一白 1 2 3 黄一枣 1 2 3 阴性 图1黄芪桂枝五物汤及方中药对黄芪甲苷含■色谱图 注：各图谱中1表示黄芪甲苷。 作为臣药，确实有加强君药功效的作用。 从实验中我们发现，具有发散风寒的桂枝、生姜 能显著提高黄芪甲苷的溶出量，而具有补益作用的 白芍、大枣却降低黄芪甲苷的溶出量，具体的原因目 前还不清楚，但却提醒我们在以后的研究中是否可 以考虑把该方拆成发散风寒组与补益组，再进行药 效学、化学等方面的比较研究，进一步探讨该方的配 伍规律。 [参考文献] [1]王炜．高效液相色谱法测定益气活血饮中黄芪甲苷的 含量[J]．湖南中医药导报，1997，3(5)：28—29． [2]阎汝南，王静竹，刘舒平，等．HPLC法测定黄芪中黄芪 甲苷的含量[J]．中国中药杂志，1998，23(7)：389．399． 万方数据 HPLC测定黄芪桂枝五物汤及方中药对的黄芪甲苷含量 作者： 施旭光， 许晓峰， 朱伟， 黄兆胜 作者单位： 广州中医药大学中药学院,广东,广州,510405 刊名： 中国实验方剂学杂志 英文刊名： CHINESE JOURNAL OF EXPERIMENTAL TRADITIONAL MEDICAL FORMULAE 年，卷(期)： 2006,12(2) 被引用次数： 4次 参考文献(2条) 1.阎汝南;王静竹;刘舒平 HPLC法测定黄芪中黄芪甲苷的含量 1998(07) 2.王炜 高效液相色谱法测定益气活血饮中黄芪甲苷的含量 1997(05) 引证文献(4条) 1.陈荣.黄梦娴 HPLC法测定归芪补血口服液中黄芪甲苷的含量[期刊论文]-中国药师 2009(1) 2.林绪芳.张礼菊.邓晓辉 黄芪甲苷定量检测方法比较[期刊论文]-中国药房 2007(21) 3.张志芳.郭静.刘晋权 近十年来中药药对研究进展[期刊论文]-内蒙古中医药 2007(1) 4.王惠勇.冯尚彩.程运丽 黄芪提取物及半合成产物的指纹图谱研究[期刊论文]-海洋湖沼通报 2007(1) 本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_zgsyfjxzz200602008.aspx