有机酸—苹果酸的发酵生产工艺设计

有机酸—苹果酸的发酵生产设计》 精细0520 陈思 陈姣丽 孙鑫 冯琪 （有机酸的分类： 1、柠檬酸 柠檬酸是生物体主要代谢产物之一，在自然界中分布很广，主要存在于柠檬、柑橘、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中，尤其以未成熟者含酸量较多。植物叶子中（如烟叶、棉叶、菜豆叶等）也含有柠檬酸。柠檬酸在植物体内常与苹果酸、草酸及酒石酸等共同存在。在动物中，柠檬酸存在于骨骼、肌肉、血液、乳汁、唾液、汗和尿中，或者以游离状态或金属盐类的形式存在。 2、乳酸 早在1841年，Boutron和Fremy的记载中就有关于乳酸的生产，即是将麦芽或酸乳放入淀粉浆和牛乳中，任其自然发酵，然后逐渐中和而的记载中就有关于乳酸的生产方法，即是将麦芽或酸乳放入淀粉浆和牛乳中，任其自然发酵，然后逐渐中和而产出乳酸。但是，实际上用工业方法生产乳酸是在1881年开始于美国。约在1894年，乳酸开始成功地用于皮革和纺织工业，当时美国的生产量折合纯品约为每年5吨。 我国也早就有乳酸盐额度研究和生产。1944年，重庆振元化学药品厂首先生产乳酸钙，在1955年发表了“乳酸发酵和乳酸钙制造”一文。该厂以后迁到无锡，改名为无锡第二制药厂，生产乳酸钙。现在已采用真菌制剂代替砻糠曲的生产工艺，采用大米等为原料，并发行发酵法生产乳酸钙。 3、醋酸 醋酸发酵可以说是起源于食醋发酵，而食醋发酵在古代最早只是酿酒受细菌污染的结果，即所谓“酒酸变醋”。因此醋酸发酵的历史几乎与酿酒一样悠久，可以追溯到一万年以前。中国的“醋”一词有陈酒之意。 能生产食醋的原料很多，如葡萄、苹果、麦芽、谷物原料、乳清等天然含糖原料皆可。我国食醋生产的历史非常悠久，现已有多种风味和特色的食醋生产方法。 早先获得醋酸的方法有天然发酵醋的蒸馏和木材的分解蒸馏(所谓“木醋”)。真正的醋酸发酵应该说是从快速制醋法开始发展起来的，它是现代淋醋工艺的前身。快速制醋工艺由德国学者舒莱巴赫在1823年首先提出，因此在国外称为“德国工艺”。 4、葡糖酸 1880年，Boutroux首先发现利用微生物的氧化作用，能将葡萄糖氧化成葡糖酸。他发现用醋化醋杆菌能发酵葡萄糖产生一种不挥发酸，后来确定为葡糖酸。以后许多研究者也相继报道，其他数种细菌也能产生葡糖酸或酮基葡糖酸。本世纪30年代以前，细菌发酵是生产葡糖酸的主要方法。1922年，Molliard发现，利用霉菌的氧化作用也能产生葡糖酸。后来人们知道，黑曲霉、米曲霉、文民曲霉和青霉都有上述氧化作用。Bernhager1942年发现，采取中和生成酸的方法，黑曲霉能高效地将葡萄糖转化成葡糖酸，而添加碳酸钙最好。在较低温度、限制氮源的条件下，生成的葡糖酸几乎可达理论产率。 我国在1955年由轻工业部上海工业试验所试制葡糖酸成功，选出了黑曲霉87号菌种，不久即在山东投入生产。目前，我国已经有数家葡糖酸发酵工厂。 5、衣康酸 衣康酸（又称为甲叉琥珀酸、分解乌头酸）最早是由Baup1836年蒸馏分解柠檬酸时发现的。而微生物产生衣康酸的能力是日本人木下广野1929年在一种嗜高参压的霉菌培养物中首先发现的，他称之为衣康酸曲霉。原来Raistrick通过对霉菌代谢物的长期研究发现，土曲霉表面培养时也能产生衣康酸。 我国的衣康酸生产尚属空缺。金其荣等人于1984年开始着手对衣康酸产生菌进行选育和工艺条件的研究。 6、苹果酸 苹果酸广泛存在于生物体中，它在很多水果中是占优势的酸。微生物产生苹果酸的能力也早已被人们所认识，早在1928年，Yuill就报道过，在培养黄曲霉时，有少量苹果酸伴随琥珀酸和富马酸产生。Schreyer1931年报道，在丛花青霉的表面培养液中，生成的有机酸钙相当于耗糖的1/4，其中大部分是苹果酸钙。Bernhauer等报道，在蔗糖为碳源的黑曲霉发酵液中，除生成大量的柠檬酸之外，也有少量苹果酸生成。 我国在发酵法生产苹果酸方面也有很大进展。北京微生物研究所研究了固定化皱褶假丝酵母的苹果酸生产技术。福建三明真菌研究所试验过L-苹果酸的霉菌固体发酵。 6/1苹果酸的性质 苹果酸是一种较强的有机酸，又名羟基丁二酸，是一种白色或荧白色粉状、粒状或结晶状固体。晶体中不含结晶水，DL-型熔点129℃，L-型熔点100℃，加热到180℃可以失水分解成富马酸或马来酸。在通常条件下，苹果酸是稳定的，但其纯晶体稍有吸湿性，在高湿度条件下可能液化。在相对湿度98％，25℃下放置6天，约增重50.4％. 苹果酸在催化剂存在下与醇可发生酯化反应。以三氟化硼为催化剂与醇回流可形成单酯。与多元醇、芳香多元羧酸作用，可形成树脂类产品，如醇酸聚酯树脂。 在氧化银存在下，苹果酸酯与卤代烷反应可以产生醚类，如乙氧基琥珀酸。 在醇溶液中，苹果酸酯与氨作用，可以生成苹果酸酰胺。 6/2苹果酸的发酵机理 L-苹果酸在生物体中普遍存在，它作为三羧酸循环的一员而参与细胞代谢。在一般生物中它只参与循环而不会大量积累，否则会造成代谢流的阻塞。要想积累苹果酸，必须要有补充4碳酸的途径。理论上讲，补充4碳酸的途径有两种：乙醛酸循环和丙酮酸羧化支路。 实际上，苹果酸的生物合成机理虽然早就研究得很清楚，但它只是从生物生理学的角度去研究的。对于微生物发酵中苹果酸合成机理尚没有进行过细致研究。一般认为，苹果酸发酵牵涉到CO2的固定（即丙酮酸羧化），其证据有：发酵依赖于CaCO3或其他碳酸盐，添加生物素可以促进苹果酸积累等。但是，CO2固定反应在各种菌的发酵中究竟占多大比例还未见有报道。毫无疑问，无论有无乙醛酸循环存在，提高丙酮酸羧化的比例则能提高碳源的利用率，也即能提高苹果酸产率。因此，这是苹果酸发酵值得研究的课。 6/3苹果酸发酵微生物的分类 1、 黄曲霉 2、 米曲霉 3、 寄生曲霉 4、 华根霉 5、 无根根霉 6、 膜瞨毕赤酵母 7、 短乳杆菌 8、 产氨短杆菌 6/4苹果酸的发酵工艺 L-苹果酸的发酵工艺大体可以分为三类：一步发酵法、两步发酵法和酶法转化。一步发酵又称为直接发酵，它用糖类为原料，用霉菌直接发酵产生苹果酸。两步发酵法也是用糖类为原料，先由根霉发酵成富马酸（或富马酸-苹果酸混合物），再由酵母或细菌转化成苹果酸。酶法转化是用富马酸（盐）或马来酸为原料，用微生物酶（包括全细胞）转化成苹果酸。与化学合成法不同的是，发酵方法利用了微生物酶的立体异构专一性，生产的都是L-苹果酸，是生物体内所存在和可以利用的构型，而化学合成法只能生产DL-苹果酸，如作为食品和药物，则有一半不能得到利用。 6/4.1直接发酵工艺 (1) 菌种扩大培养 用于苹果酸直接发酵的黄曲霉和米曲霉都易于产生孢子。将保存在麦芽汁琼脂斜面上的黄曲霉孢子用无菌水洗下，接到三角瓶中。瓶中装有种子培养基。在33℃静置培养2~~4天，待长出大量孢子，接到种子罐中。 种子罐装有下述种子培养基（g/L） 葡萄糖（水解糖中）30 豆饼粉 10 FeSO4 0.5 K2HPO4 0.2 NaCL 0.01 MgSO4 0.1 CaCO3 60(单独灭菌) 种子罐培养的目的是使孢子发芽，以缩短生产罐的发酵迟滞期。种子罐的体积是生产罐的10％，装液70％，例如50L罐装液35L。在100℃灭菌20~30min后，冷至40℃以下，加入单独灭菌的CaCO3，接种黄曲霉孢子后在33~34℃通气搅拌培养。通气量0.15~0.3vvm，罐压维持100KPa，加入泡敌（50l罐加20ml）抑制泡沫生成。培养18~20h后接入生产罐。 （二）发酵 发酵培养基采用葡萄糖70~80g/l,其余成分与种子培养基相同。 生产培养基除CaCO3以外，直接在生产罐内配制，在缓慢搅拌下直接通蒸汽升温至100℃，维持20min灭菌。冷至40℃时，加入单独灭菌（干热160℃，2h）的CaCO3。当品温降到34℃时，接种10％种子培养液，通气搅拌进行发酵。发酵时控制温度33~34℃，通气量0.7vvm,搅拌转速180r/min,泡沫自由控系统流加泡敌控制。整个发酵过程约需40h。待残糖降到1g/l以下，放罐进入提取工序。 (三)、影响苹果酸发酵的因素 1.氮源 2.碳酸盐种类 3.碳酸钙用量 4.碳源种类 5.金属离子 6.铁盐 7.抑制剂 8.氨基酸和维生素 9.温度 6/4.2两步发酵工艺 两步发酵是先用根酶将糖类发酵成富马酸（或富马酸与苹果酸混合物），再由酵母或细菌发酵成L-苹果酸的工艺。这前一步称为富马酸发酵，后一步称为转换发酵。 （一）富马酸发酵 根霉产生富马酸的能力早就被人们所认识。著名的根霉富马酸发酵菌种有华根霉、无根霉和黑根霉。根霉在葡萄糖马铃薯汁琼脂斜面上，于30℃培养7天后，易于长出大量孢子。 对于华根霉6508的富马酸发酵，可以采用下述培养基（％） ： 葡萄糖 10 （NH4）2SO4 0.5 K2HPO4 0.1 MgSO4·7H2O 0.05 FeCl3·6H2O 0.002 CaCO3 5 在500ml三角瓶中装液50ml，另外还要加入各种表面活性剂，具体添加量见后述。接种华根霉孢子后，先静置培养一段时间，再振荡培养，维持温度30℃。 （二）转换发酵 转换发酵是在根霉发酵一定时间后，再加入第二种微生物使富马酸发酵转换成苹果酸发酵。有这种转换能力的微生物很多。佐佐木等普查了分别属于假丝酵母属、德巴利酵母属、汉逊酵母属、毕赤酵母属、红酵母属、酵母属和球拟酵母属的23株酵母，发现膜璞毕赤酵母的转化率最高。 6/4.3酶法转化工艺 酶法转化工艺相当于两步发酵工艺中的转换发酵。转换发酵是将第一步发酵生成的富马酸转化成苹果酸;而酶法转化是用富马酸盐（一般是化学合成的）为原料，利用微生物的富马酸酶转化成苹果酸(盐)。酶法转化是现在国外生产L-苹果酸的主要方法。如果转化是以钙盐的形式进行的，则称为“转晶”，即富马酸钙晶体转化成苹果酸钙晶体: Ef CaFu Ca2+ + Fu2- Ma2+ + Ca2+ CaMa 6/4.4固定化细胞转化工艺 前面已经提到，富马酸向L-苹果酸的转化只牵涉一步酶催化反应，因此只要把富马酸酶提取出来，固定到载体上，就可以利用固相酶反应柱连续生产L-苹果酸。但实际上遇到的问题是，酶的提纯手续复杂，酶的回收率低，成本高。 （1） 产氨短杆菌细胞固定与苹果酸生产 （2） 黄色短杆菌细胞固定与苹果酸生产 1. 氮源 2. 碳源 3. 玉米浆 4. 通气 5. 温度 6. 培养时间 6/4.5其他发酵方法 （1） 担子菌发酵法 （2） 产碱杆菌酶法转化 （3） 解脂假丝酵母转化法 （4） 解烃富马酸假丝酵母发酵法 （5） 假丝酵母酶法转化 （6） 栖热菌酶法转化 （7） 固定化皱褶假丝酵母转化法 6/5苹果酸的提取和精制 1． 苹果酸的提取 发酵液的处理包括前6个步骤，即酸解、过滤、中和、过滤、酸解、过滤。由于苹果酸发酵中需要添加过量的CaCo3，另外形成放的苹果酸钙盐溶解度也极低，所以成熟的发酵酿成浓浆状。 发酵液—— —— —— —— —— 无砷硫酸— 石膏渣、菌体 CaCo3+Ca(OH)2 滤液 无砷硫酸 —— 石膏渣 结晶成品 50％浓缩液 苹果提取工艺流程 二、苹果酸的精制 三、苹果酸结晶工艺流程 苹果酸溶液 富马酸晶体 富马酸晶体 苹果酸结晶工艺流程 6/6苹果酸的检验 6/6.1定性检验 1. 三氯化钛法 2. 美国药典法 3. 纸层析法 6/6.2定量检验 1. 酸碱滴定法 2. 紫外分光光度法 3. 荧光分光光度法 6/7苹果酸的用途 苹果酸广泛存在于各种生物体中，是生物体重要的代谢循环——三羧酸循环的成员之一。在天然水果（苹果、山楂、葡萄、樱桃）中含量较高，它具有明显的呈味作用，其酸味柔和别致，解渴爽口。苹果酸广泛用于食品和医药工业中，它的质地稳定，在水中溶解度大。它在食品等部门中的用途简介如下： 1. 食品酸味剂 2. 食品加工 3. 食品添加剂加工 4. 烟草加工 5. 医药 6. 日用化工 7. 化学工业 酸解 过滤 中和 过滤 酸解 过滤 精制 真空浓缩 结晶 干燥 前浓缩 第一次富马酸结晶 过滤 中间浓缩 第二次富马酸结晶 过滤 苹果酸结晶 干燥