响应面法优化地衣芽孢杆菌A2发酵培养基

2009年第 7期 中国饲料 [摘要】为了提高地衣芽孢杆菌A2(Bacillus licheniformis A2)发酵液的活菌含量，采用 Plackett—Burman设计法 和响应面分析法对其发酵培养基进行优化。先用 Plackett—Burman设计从 8种原料中筛选出对活茵含量有显著影响 的 因素 ，再 用最陡爬坡试-@eL Box—behnken设计进一步优化 。结果 明，MgSO ·7H20、酵母粉 和尿 素是 影响发 酵液 活茵含量的显著因素，优化后的培养基为：可溶性淀粉 5 g／L，尿素 1．29 g／L，K2HPO4 6 g／L，KH2PO4 3 g／L，MnSO · H2o 0．2 g／L，MgSO4·7H2O O．41 g／L，豆粕 10 g／L和酵母粉 0．99 g／L。在 此条件 下 ，发酵液 中 A2的活菌含量可以从优 化前的 4．73x10 CFU／mL提 高到 1．30x10“CFU／mL。 『关键词1地衣芽孢杆菌；培养基优化；响应面法 ．- 【中图分类号]$816．6 [文献标识码】A [文章编号]1004—3314(2009)07—0017—04 [Abstract】In order to enhance the content of live Bacillus lwheniformi~A2 strain，Plaekett-Burman and response surface methodology were used to optimize the fermentation medium．A Plaekett—Burman design was used to evaluate the influence of eight related factors firstly．Then，the path of steepest ascent and the Box-Behnken design were adopted for further optimization．Results showed that the concentration of MgSO4·7H20，yeast powder and urea p1ayed important roles in influencing the content of live Bacillus licheniform／s A2 strain．The optimal fermentation medium was obtained as follow— ings：soluble starch 5 g／L，urea 1．29 g／L，K2HPO4 6 g／L，KH2PO4 3 g／L，MnSO4·H2O 0．2 g／L，MgSO4·7H20 0．41 g／L，soybean meal 10 g，L and yeast powder 0．99 g／L．The content of live Bacillus l~heniform／s A2 strain increased from 4．73x10 CFU／ mL to 1．30x10“CFU／mL after medium optimization． [Key words】Bacillus licheniformis；medium optimization；response surface methodology 由于抗生素等药物性饲料添加剂产生的药物 残留、细菌耐药性等危害，无毒、无公害的微生态 饲料添加剂的研究和开发备受关注。微生态饲料 添加剂以益生菌为原料 ，可改善微生物与酶的平 衡或刺激特异性与非特异性免疫 ，改善肠道菌群 构成，抑制有害菌及有害物质，提高免疫力，降低 胆固醇 (曾子丹和姚朔影 ，2007)。发酵培养基的成 分对微生物发酵液含菌量有很大的影响 (储炬 ， 2002)。芽孢杆菌液体发酵培养基的优化一般采用 单因子试验和正交设计的方法．在考察的因素较 多时，这些方法不仅要求的试验次数多。而且还可 基金项 目：湖北省工业微 生物重点实验 室基金项 目 (200413) 能导致不可靠的结论。响应面法(Response Sur— face Methodology，RSM)可 同时对影响生物产量 的 各因子水平及其交互作用进行优化与评价，可快 速有效 地确定多 因子系统 的最 佳条件 (Box， 1960)。该方法可以简化试验，提高准确性 (金菲等，2008；王金华等，2007；张丽霞等，2006)。 本研究采用响应面试验设计法对从鸡肠道分离筛 选得到地衣芽孢杆菌 A2 (Bacillus lichen@rmis A2)培养基进行研究，以期获得活菌含量较高的 培养基配方。 1 材料与方法 1．1 菌株 地衣芽孢杆菌 A2，本实验室 自行分 离和保存。 1．2 培养基 中国饲料 20o9年第 7期 1．2．1 种子及斜面保存培养基 牛肉膏 3 g，L，蛋 白胨 10 g／L，氯化钠 5 geL，琼脂粉 15 g／L，pH 7．0 ～ 7．2。固体培养基则在液体培养基中添加 1．5％ 的琼脂作为凝固剂。 1．2．2 初始发酵培养基 可溶性淀粉 5 g／L，尿素 2 g／L，K2HP04 6 g／L，KH2P04 3 g／L，MnSO4’H20 O．2 g，L，MgSO4"7H20 l g／L，豆粕 10 g／L，酵母粉 0-4 g／L，pH 7．2。 1-3 试剂和原料 豆粕为市售，过 20目筛备用。 其他试剂均为分析纯。 1．4 培养条件 1．4．1 种子培养条件 250 mL三角瓶装种子培 养基 50 mL，接斜面活化后的种子一环 ，30 ， 180 dmin，旋转振荡培养 18 h。 1．4．2 发酵培养条件 250 mL三角瓶装发酵培 养基 50 mL，按照4％的接种量接种后在 30℃， 180 r／min，旋转振荡培养24 h。 1．5 活菌数的测定 活菌数的测定采用平板稀 释法。 1．6 培养基优化试验设计 1．6．1 Plackett—Burman设 计 在优化初 期利用 Plackett—Burman(简称 PB)设计法 (Xu等 ，2002)， 将初始发酵培养基的8种成分：可溶性淀粉(X )、 尿素( 2)、K2HPO4(X3)、KH2PO ( 4)、MnSO4·H2O (X )、MgSO ·7H O(X )、豆粕( )和酵母 膏( )， 分别作为 PB试验设计的 8个因素，每个因素取 2 个水平 。即低水平(一1)为初始发酵培养基各成分 的浓度 ，高水平(+1)取低水平的 1．5倍。活菌含量 作为响应值 y。 1．6．2 最陡爬坡试验 响应面拟合方程只有在考 察的紧接邻域里才充分近似真实结果，故只有先 逼近最大 目标产物产量区域后才能建立有效的响 应面拟合方程(Montgomery等，1991)。根据 PB试 验筛选出的对发酵液活菌含量影响显著的因素， 以各显著因素的正负效应确定最陡爬坡试验的路 径(包括变化方向和变化步长)，快速的逼近最大 响应区域 1．6．3 Box—behnken设 计 Box—behnken设计 (Viswanathan和 Surlikar。2001)适用 于 2～5个因 素的优化试验，基于PB试验设计和最陡爬坡试 验的试验结果，进行 Box—Behnken设计：以PB试 验筛选得到的对发酵液活菌含量影响显著的因素 作为设计因素，以最陡爬坡试验得出的浓度作为 中心点，根据相应的试验表进行试验后，使用 SAS 9．0对试验结果进行响应面分析。 2 结果与讨论 2．1 影响因素的 筛选 按照 Plackett—Burman试 验设计，在发酵 24 h时取样测定发酵液的活菌含 量 ，Plackett—Burman试验设计及结果见表 1。 表 l Plackett—Burman试验设计与结果 序号 X1 X2 X X5 X6 X7 X8 Y／(xl09CFU／mL) 对表 1进行回归分析 ，所得结果列于表 2。由 表2分析，MgSO ·7H O、酵母粉和尿素作为重要 影响因子的可信度大于85％，对发酵液活菌含量 影响显著，是影响发酵液活菌含量的主要影响因 子；其中，尿素与 MgSO ·7H O的浓度对活菌含量 的影响是负效应 ．酵母粉的浓度对活菌含量的影 响是正效应 表 2 Plackett—Burman试验设计回归分析结果 组别 因素 堡 f检验 件>I￡I 重要性排序 一 l l 2．2 中心试验点的确定 根据 PB试验结果设计 最陡爬坡试验路径 ：按一定的梯度减少尿素与 MgS04-7H：0在发酵液中的浓度，并按一定的梯度 增加酵母粉在发酵液中的浓度，其余 5个因素均取 初始浓度，检测最终发酵液活菌含量的变化，从而 8 O 5 5 2) 5； O 踟 如 ∞勰 ● ● 0 ● ● ● ● J 0 0 ● ● 0 ● ● 0 一 ● 0 0 2 3 4 5 6 7 8 9 m ¨ wangzhi 高亮 2009年第 7期 中国饲料 确定此 3因素的最适浓度范围，结果如表 3所示。 表 3 最陡爬坡试验设计及其结果 随尿素、MgSO ·7H／O和酵母粉浓度的变化 ， 发酵液中的活菌含量先上升后下降 ，当尿素、 MgS0 ·7H20和酵母粉浓度分别为 ：1．4、0．4 g／L和 1 g／L时，所对应的发酵液的活菌含量达到最大 值，以此浓度作为中心点，进行下一步优化试验。 2．3 最佳发酵培养基的确定 以 MgSO ·7H2O、 酵母粉及尿素三个重要因素为自变量，各因素编 码水平 如表 4所示 。Box—behnken试验设计及结 果如表 5所示 表 4 Box—behnken设计各因素及其编码值 序号 1 2 x3 Y／(~10’CFU／mL) 利用 SAS软件对表 5的结果进行回归拟合 ． 得 到 二 阶 回 归 方 程 为 ：Y=130．7—6．025 1+ 1．1625 2 +1．1875 3 —5．7875 l 1 —1．1X1X2 + 5．55 1 3—14．1 125 2X2—0-375 3—16_3625 3。 对回归结果进行方差分析，对于二次多项式 各项对响应值的影响大小用 t检验评价。从表 6 可以看到，在模型各参数中，除 ， ，， ：， 。 对活菌含量无影响外，其他各项均有较显著的影 响(可信度 >90％)。由可信度分析得该模型决定 系数 R =0．9456．表明模型能解释 94．56％菌量的 变化，回归拟合程度较好，可以用此模型对发酵液 的活菌含量进行预测 。 表 6 Box—behnken试验的回归分析结果 方程项 参数估计 差 t检验 Pr>It I - 6．025 1．735 133 —3．47236 0．017804 X2 1．1625 1．735133 0．669977 0．532565 X3 1．1875 1．735133 0．684385 0．524158 1 —5．7875 2．554047 —2．26601 0．072801 l 一 1．1 2．453849 —0．44828 0．672712 3 5．55 2．453849 2．261753 0．073191 一 14．1 125 2．554047 —5．52554 0．00266 3 -0．375 2．453849 —0．15282 0．884515 3 —16．3625 2．554047 —6．4065 0．001374 9．650843 Pr>F=0．O1 1214 RZ=0．9456 AJj R2=0．8476 利用 SAS软件对回归模型进行响应面分析， 得到各响应面立体分析图，见图 1～图 3。由图及 软件分析可知，回归方程存在稳定点。通过岭脊分 析预测，当 ，， 2， 的编码值分别为(一0．55461， 0．06358，一0．05850)，即尿素、MgSO4·7H20和酵母 粉的最佳浓度分别为 ：1．29、0．41 g／L和 0．99 g／L 时，响应值 l，达到最大值 ，即发酵液的活菌含量 最高，为 1．32~10“CFU／mL。 图 1 X3 -0 9 图 2 y_厂( ， )的响应面立体图 2．4 优化结果验证 为了检验模型的准确性 ．在 预测最佳培养基配方条件下进行发酵试验 3次， 黧一黧 一 20 一 中国饲料 2009年第 7期 1【)2 0 9 图3 y ， )的响应面立体图 所得 的实 际发 酵 液活 菌 含量 平 均 为 1．30xlO“ CFU／mL。与预测值 1．32x10“CFU／mL接 近 ，可见 该模型能较好的预测实际发酵情况；而在未优化 培 养基 条件 下 的发酵 液 活 菌含 量 为 4．73xl0m CFU／mL．可见优化后 的培养基能显著提高发酵液 中的活菌含量。 3 结论 通过 Plaekett—Burman设计 、最陡爬坡试验及 Box—behnken设计 的方 法确定地衣芽孢杆菌 A2 发酵培养的最适培养基为：可溶性淀粉 5 g／L，尿 素 1．29 g／L，K2HPO4 6 g／L，KH2PO4 3 g／L，MnSO4· H20 0．2 g／L，MgS04．7H20 O．41 g／I ，豆粕 10 g／L和 酵母粉 0．99 g／L。优化后 ，地衣芽孢杆菌 A2发酵 24 h的活菌 含量从优化 前 的 4．73xl0m CFU／mL 提高到 1．30x10“CFU／mL。 参考文献 【1_1储炬 现代I业发酵调控学【M】北京：化学工业出版社，2002，251 [2】金菲，王春维，赵胜军，等 双酶法水解猪血球蛋白参数的优化羽．中国饲 料 ，2{)08，5(10)：41～44 【3]王金华，谈丹，陈雄，等．响应面设计法优化 GST发酵培养基Ⅱ】．武汉理 工大学学报，2007，29(11)：35～39 f41曾子丹，姚朔影．益生茵的发展前景及国内外发展状况町食品工业科 技 ，2007，28(8)：251～254 【5_5 张丽霞，李荣禧，王琦，等．枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化Ⅱ】中国生物 防治．2006，22(增刊)：82～88 f61 Box Behnken Some New Three Level Designs for the Study of Quantitative Variables[J]Technometrics，1960，2：455～475． 【71 Montgomery D C Design and analysis of experiments (3nd)『M】．New York：John Wiley&Sons，1991 [8】Viswanathan P，Surhkar N R Production of o【一amylase with Aspergillus flavus Oil Amaranthus Grains by Solid—state Fermentation册．Basic Microbiol， 2001，41(1)：57～64 [9】Xu C P，Kim S W ，Hwang H j，et a1．Apphcation of statistically based experimental design s for the optimization of exo—polysaccharide production by Cordyceps militaris NG3[JI．Biotechnol Appl Biochem，2002，36：127～131． 『通讯地址：武汉市武 昌南湖李家墩特 1号 ， 邮编：4300681 生物抗氧化超强硒源 奥 尔硒 (纳 米硒 ) 硒的作用： · 谷胱甘肽过氧化物酶活性中心组成成分，通过酶促反应高效消除畜禽 内自由基，抗氧化能力比维生素E强一百倍。 · 保护畜禽细胞膜免受 自由基破坏，减少滴水现象 · 增强机体免疫应答，提高抗体水平。 · 提高畜禽繁殖功能，增强精子活力，促进卵泡正常发育 奥尔硒 ； 一