3种酚酸类物质对花生发芽和土壤微生物的互作效应研究_刘苹

江西农业学报 2012，24(8) :85 ～87 Acta Agriculturae Jiangxi 3种酚酸类物质对花生发芽和土壤微生物的互作效应研究 刘 苹，高新昊，孙 明，张英鹏，仲子文，万书波，李 彦* 收稿日期:2012 －05 －25 基金项目:环保公益性行业科研专项(201109018) ;现代农业产业技术体系建设专项(CARS －14) ;国家自然科学基金(30800135)。 作者简介:刘苹(1978─) ，女，山东泰安人，助理研究员，博士，主要从事农业生态学研究。* 通讯作者:李彦。 (山东省农业科学院 农业资源与环境研究所，山东 济南 250100) 摘 要:采用培养皿培养的方法，研究了花生根系分泌物中 3种酚酸类物质，即:苯甲酸、对羟基苯甲酸和邻苯二甲酸，对 花生种子发芽、花生炭疽病菌与固氮菌的影响和互作效应。研究结果明，3 种成分在较高添加浓度时对花生种子的发芽均 产生了抑制作用，对炭疽病菌的生长主要表现为抑制作用，对固氮菌的生长表现为低浓度促进、高浓度抑制。3 种酚酸类物质 之间存在互作效应，当两两互作时对花生种子发芽的化感效应有增强的趋势，对炭疽病菌生长的化感效应有减弱的趋势，而 对固氮菌生长的化感效应表现出低浓度时增强、高浓度时减弱的趋势。 关键词:酚酸;化感作用;互作效应;花生;连作障碍 中图分类号:Q946． 8 文献标识码:A 文章编号:1001 －8581(2012)08 －0085 －03 Interactive Effects of Three Kinds of Phenolic Acids on Peanut Germination and Soil Microbes LIU Ping，GAO Xin － hao，SUN Ming，ZHANG Ying － peng，ZHONG Zi － wen，WAN Shu － bo，LI Yan* (Institute of Agricultural Resources and Environment，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Ji’nan 250100，China) Abstract:The influences and interactive effects of three kinds of phenolic acids (benzoic acid，p － hydroxy benzoic acid and phthalic acid)on peanut seed germination，peanut anthracnose pathogen and nitrogen － fixing bacteria were researched by using the method of culture in Petri dishes． The results showed that the studied three kinds of acids at relatively high adding concentration had inhibitive effect on peanut seed germination． They mainly exhibited inhibitive effect on the growth of peanut anthracnose pathogen． They promoted the growth of nitrogen － fixing bacteria at low adding concentration and inhibited the growth at high adding concentra- tion． The interactive effects were found among the studied three kinds of phenolic acids，when they acted each other，their allelopathic effect on peanut seed germination revealed an enhanced trend，while that on the growth of peanut anthracnose pathogen appeared a weakened trend，but that on the growth of nitrogen － fixing bacteria exhibited an enhanced trend at low concentration and a weakened trend at high concentration． Key words:Phenolic acid;Allelopathy;Interactive effect;Peanut;Continuous cropping obstacle 花生是我国主要的油料经济作物之一。花生连作后 长势变差，产量和品质降低。山东省每年大约有连作田 23万 ～ 27 万 hm2，由连作而造成的减产在 15 万 t 以 上［1］。因此，揭示花生连作障碍的成因非常重要。早期 研究表明，花生连作障碍与土壤的微生物区系、酶活性、 物理和化学性质等的变化相关［2 －4］。我们前期研究发现 花生根系分泌物的化感作用与花生连作障碍有着密切关 系，并且鉴定出了花生根系分泌物的主要成分［5 －8］。植 物的化感作用是释放的所有化感物质综合作用的结果。 Einhellig认为几乎所有植物的化感作用是至少两种或两 种以上物质相互作用的结果［9］。在本研究中，我们通过 培养皿培养的方法重点研究了花生根系分泌物中 3 种酚 酸类物质，即:苯甲酸、对羟基苯甲酸和邻苯二甲酸，对花 生种子发芽、土壤微生物的影响和互作效应，旨在探讨花 生连作后土壤中酚酸类物质的累积与花生连作障碍间的 关系，为花生连作障碍机理的研究提供一定的理论依据。 1 材料与方法 1． 1 3种酚酸对花生种子发芽的影响 将 3 种酚酸类 物质:苯甲酸(记为 1)、对羟基苯甲酸(记为 2)、邻苯二 甲酸(记为3)的分析纯品用无水乙醇配制成500 mmol /L 的溶液 5 mL。分别吸取上述配制好的溶液 5、10、15、20 μL于铺 2层滤纸的直径 9 cm的培养皿中，研究两种物 质的交互作用时，每种物质各取一半体积。待乙醇挥发 后在每个培养皿中整齐放入大小一致的花生种子 6 粒， 然后在每个培养皿中加入 10 mL 蒸馏水，配制成浓度分 别相当于 0． 25、0． 50、0． 75、1． 0 mmol /L 的溶液，对照只 用蒸馏水。盖好盖后于 25 ℃恒温培养箱中培养 60 h，期 间观察其长势，然后测定胚根的长度。所有处理均为 3 个重复。 1． 2 花生根系分泌物对土壤微生物的影响 供试菌种 2个，分别是:花生炭疽病菌和固氮菌，均购自中国农业 科学院农业资源与农业区划研究所菌种保藏中心。将两 个菌种分别接于灭完菌的液体土豆培养基和 YMA优化 培养基(不加琼脂)上摇床培养 4 d后备用。 分别吸取 500 mmol /L 苯甲酸、对羟基苯甲酸、邻苯 二甲酸的乙醇溶液 35、70、105、140 μL于 250 mL的锥形 瓶中，研究两种物质的交互作用时，每种物质各取一半体 积。待乙醇挥发后在每个锥形瓶中加入热的土豆培养基 或 YMA 优化培养基(加琼脂)70 mL，摇匀，配制成浓度 分别相当于 0． 25、0． 50、0． 75、1． 0 mmol /L 的培养基。灭 菌后分装至直径 9 cm的培养皿中。待培养基凝固后将 培养皿放在 28 ℃的恒温环境中检定 24 h，留待接菌用。 对照不加任何处理。 将摇床培养的菌种和倒好的平板于无菌工作台上， 每个培养皿中加入 5 μL摇床培养的菌液，使菌液呈大小 一致的圆形状，每皿接种 3个菌落。每种菌 4 个浓度，每 个处理 3个重复。注意 3 个菌圈的距离要适当，以免菌 落相互影响抑制各自的生长。将接好菌的培养皿在 28 ℃的恒温培养箱中观察培养，3 d后测定炭疽病菌菌落的 直径，5 d后测定固氮菌菌落的直径。 1． 3 统计分析与化感作用的评价方法 采用统计软件 SPSS(13． 0)进行处理间各指标的差异显著性检验，显著 性水平为 P ＜ 0． 05，LSD法进行多重比较。 化感作用效应敏感指数(RI)采用 Williamson 的方 法［10］，RI = 1 － C /T(T≥C) ，RI = T /C － 1(T ＜ C) ，C 为对照值，T为处理值。当 RI ＞ 0 时，表示促进作用，当 RI ＜ 0时，表示抑制作用。RI 绝对值的大小代表化感 (自毒)作用强度。 2 结果与分析 2． 1 3种酚酸对花生种子发芽的影响 2． 1． 1 酚酸类物质的独立作用 花生根系分泌物中 3 种酚酸类物质对花生种子发芽的影响见图 1。当 3 种物 质单独添加时，在较低添加浓度时(0． 25、0． 50 mmol /L) ， 苯甲酸、对羟基苯甲酸、邻苯二甲酸对花生种子根的生长 均表现出一定的促进作用，但是与对照的差别没有达到 显著水平。随着添加浓度的增加对根长的影响转为抑制 作用，并随添加浓度的增加抑制作用逐渐增强。3 种物 质对花生种子发芽的抑制作用由强到弱的顺序为:苯甲 酸 ＞对羟基苯甲酸 ＞邻苯二甲酸。 1:苯甲酸，2:对羟基苯甲酸，3:邻苯二甲酸。下同。 图 1 3种酚酸对花生种子发芽的化感作用及其互作效应 2． 1． 2 酚酸类物质的互作效应 当 3 种物质两两添加 时对种子发芽的化感效应表现出了与单独添加时相似的 趋势，低浓度促进高浓度时抑制，但苯甲酸与邻苯二甲酸 (1、3)共同作用时对种子胚根生长一直起抑制作用(图 1)。互作时与它们单独添加时的化感强度发生了变化。 当苯甲酸与对羟基苯甲酸(1、2)、邻苯二甲酸(1、3)共同 作用时，对种子发芽的化感效用均有增强的趋势。当对 羟基苯甲酸和邻苯二甲酸(2、3)互作时，当添加浓度为 0． 25、0． 50 mmol /L 时，化感效应介于两者之间，当添加 浓度为 0． 75、1． 00 mmol /L时，化感效应得到了增强。 2． 2 花生根系分泌物对花生炭疽病菌的影响 2． 2． 1 酚酸类物质的独立作用 花生根系分泌物中 3 种主要成分对花生炭疽病菌的影响见图 2。当 3 种物质 单独添加时，苯甲酸、邻苯二甲酸对炭疽病菌的生长均表 现出抑制作用，并随添加浓度的增加抑制作用逐渐增强， 各浓度处理与对照的差别大都达到了显著水平。对羟基 苯甲酸在低添加浓度时对炭疽病菌的生长起抑制作用， 随着添加浓度的增加转为微弱的促进作用。苯甲酸和邻 苯二甲酸对炭疽病菌的化感强度相似，对羟基苯甲酸对 炭疽病菌的化感强度相对较弱。 图 2 3种酚酸对炭疽病菌生长的化感作用及其互作效应 68 江 西 农 业 学 报 24卷 2． 2． 2 酚酸类物质的互作效应 当 3 种物质两两添加 时对炭疽病菌化感效应的性质和强度，与它们单独添加 时相比均发生了变化(图 2)。当苯甲酸与对羟基苯甲酸 (1、2)互作时，在低浓度处理下(0． 25 mmol /L)对炭疽病 菌的生长起促进作用，随浓度的增加转为抑制作用并逐 渐增强。当苯甲酸与邻苯二甲酸(1、3)、对羟基苯甲酸 和邻苯二甲酸(2、3)互作时，对炭疽病菌表现出低浓度 抑制、高浓度促进的趋势。当苯甲酸与对羟基苯甲酸 (1、2)、对羟基苯甲酸和邻苯二甲酸(2、3)互作时，在浓 度较低的情况下(0． 25、0． 50 mmol /L) ，对炭疽病菌生长 的化感强度减弱，在其他两个添加浓度处理下化感强度 介于两者之间。当苯甲酸与邻苯二甲酸(1、3)共同作用 时，在 4个浓度处理下对炭疽病菌的化感强度均变弱。 2． 3 花生根系分泌物对固氮菌的影响 2． 3． 1 酚酸类物质的独立作用 花生根系分泌物中 3 种主要成分对固氮菌的影响见图 3。当 3 种物质单独添 加时，对固氮菌的生长表现出相似的规律，即低浓度时促 进固氮菌的生长，高浓度时抑制固氮菌的生长，并随添加 浓度的增加抑制作用逐渐增强。当邻苯二甲酸的添加浓 度为 1 mmol /L时，完全抑制了固氮菌的生长。3 种物质 对固氮菌的抑制作用由强到弱的顺序为:邻苯二甲酸 ＞ 苯甲酸 ＞对羟基苯甲酸。 2． 3． 2 酚酸类物质的互作效应 当 3 种物质两两添加 时对固氮菌的化感作用规律与它们单独添加时相似(图 3) ，即低浓度时促进固氮菌的生长，高浓度时抑制固氮 菌的生长，但化感效应的强度发生了变化，低浓度时的促 进作用有增强的趋势，高浓度时的抑制作用有减弱的 趋势。 图 3 3种酚酸对固氮菌生长的化感作用及其互作效应 3 讨论与结论 花生根系分泌物中的苯甲酸、对羟基苯甲酸、邻苯 二甲酸等 3种成分在较高添加浓度时对花生种子的发芽 均产生了抑制作用，说明花生根系分泌物存在自毒作用。 连作花生长势差、产量低，很可能与连作条件下花生根系 分泌物积累较多，对种子发芽、幼苗生长等产生了自毒作 用有关。许多研究发现，化感物质的化感作用存在浓度 效应，一般在低浓度下表现为化感促进作用，高浓度下表 现为化感抑制作用［11 －12］。张新慧等研究发现，2，4 －二 叔丁基苯酚在低浓度时对啤酒花的生长表现为促进作 用，而在高浓度时表现为抑制作用［13］。在本研究所采用 的浓度范围里，3 种物质对花生种子胚根生长的影响表 现出了相似的作用规律。 微生物与根系分泌物之间是相互影响的，根系分泌 物不仅为根际微生物提供所需的能源，而且不同根系分 泌物直接影响着根际微生物的数量和种群结构［14］。本 项研究发现，花生根系分泌物中的苯甲酸、对羟基苯甲酸 和邻苯二甲酸对炭疽病菌的生长主要表现为抑制作用， 对固氮菌的生长表现为低浓度促进、高浓度抑制。不同 根系分泌物成分对微生物的影响不同，其化感效应强度 也不同，可能与不同化感物质对微生物的贡献和作用机 理不同有关。 本研究中互作试验的研究结果初步表明，花生根系 分泌物中的两种或多种物质共同起作用时与它们单独作 用时相比，对花生种子发芽和土壤微生物化感效应的性 质和强度均有可能发生变化。总体来看，当 3 种酚酸类 物质互作时对花生种子发芽的化感效应有增强的趋势， 对炭疽病菌生长的化感效应有减弱的趋势，而对固氮菌 生长的化感效应表现出低浓度时增强、高浓度时减弱的 趋势。苯甲酸、对羟基苯甲酸、邻苯二甲酸两两互作时对 种子发芽的化感作用是增效的，可能与这 3 种物质化学 结构差别较大有关，它们对花生胚根细胞膜的作用位点 不同或者是两两反应产生一些新的物质而与受体细胞结 合产生新的作用位点［15］。3 种物质两两互作时对炭疽 病菌和固氮菌生长的化感效应在较高浓度时均表现出拮 抗作用，其作用机理有待于进一步研究。许多其他研究 也表明，化感物质之间存在互作效应。何华勤等研究了 5种常见的化感酚酸物质对稗草的互作效应，发现在所 考察的浓度范围内香草酸与肉桂酸的作用效果是增效 的［16］。孔垂华等的研究表明，胜红蓟各化感物质之间对 萝卜、番茄和绿豆幼苗的化感作用存在明显的协同作 用［17］。Lyu S W等在探讨阿魏酸、香草酸和对香豆酸间 的协同作用对黄瓜苗 P 吸收特性的影响时发现，当香草 酸和对香豆酸混合使用时，一种物质会降低另一种物质 的作用效果(即拮抗作用)［18］。 花生根系分泌物存在自毒作用，花生根系分泌物的 累积是导致连作花生田微生物区系发生变化的原因之 一，与花生的连作障碍有着密切关系。由于大田条件下 根际环境非常复杂，根系分泌物的化感物质之间又存在 着互作效应，因此有必要对田间条件下花生根系分泌物 的化感作用进行进一步的研究。 (下转第 93页) 788期 刘苹等:3种酚酸类物质对花生发芽和土壤微生物的互作效应研究 III Congerso Nacional Acuicultura，1990:349 －354． ［3］何吉祥，王志耕，梅林，等．克氏螯虾饲料中适宜的蛋白质含量 和能量蛋白比研究［J］． 水生态学杂志，2009(3) :77 －80． ［4］吕敏．盐度骤变南美白对虾肌肉中游离氨基酸的组成分析 ［J］．淡水渔业，2005(Z1) :40 －43． ［5］梁萌青，王士稳，王家林，等．不同盐度对凡纳滨对虾血淋巴及 肌肉游离氨基酸组成的影响［J］． 渔业科学进展，2009，30 (2) :34 －39． ［6］李二超，陈立侨，熊泽泉，等．盐度对凡纳滨对虾体组织蛋白质 积累、氨基酸组成和转氨酶活性的影响［J］． 水生生物学报， 2009，33(3) :532 －538． 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