消癥散瘀方对子宫内膜异位症模型大鼠OPN表达的影响_赵蕾

收稿日期:2012 － 12 － 25 基金项目:浙江省教育厅资助项目(Y201121064) ;浙江省中医药科 技项目(2012ZB065) 作者简介:赵蕾(1977 －) ，女，讲师、主治医师，博士，研究方向:妇 科不孕症。 通讯作者:尹航(1976 －) ，男，讲师、主治医师，博士后，博士，研究 方向:骨与关节损伤疾病及骨组织学的研究。 性腺激素的合成，并能刺激细胞滋养层生成尿激酶型血浆素 原激活剂(uPA) ，有利于蜕膜细胞外基质降解及胎盘的植 入，与胎儿、胎盘分泌的其他多种性激素一起对正常妊娠的 维持和分娩的发动发挥作用。但妊娠期异常分泌的大量 TNF － α可能损害胎儿生长，引起流产和早产［7 －8］。国内外 的一些动物实验和临床研究均已证实自然流产者血清 TNF － α均有一定程度的升高，且难免或不全流产者 TNF － α升 高更加明显［8 －9］。高浓度的 TNF － α最终引起流产的发生， 其机制目前还不明确，可能是通过多方面多途径实现的。 该研究结果显示先兆流产患者经治疗病愈或病情好转 后，血清 TNF － α水平明显下降，与国内外有些学者的研究 是一致的，进一步说明 TNF － α 的异常达与先兆流产的 发病有关;良好妊娠结局者治疗后 TNF － α 的水平明显低 于不良妊娠结局者治疗后，说明先兆流产患者血清 TNF － α水平的变化与妊娠结局有一定的相关性。该研究为先兆 流产早期诊断、治疗提供一个新的依据，为我们预测早期妊 娠结局提供一个参考，也可能为该病的免疫治疗提供新的 领域。 另外，在实际临床检测当中，受样本大小限制，入选标 准及测定干扰因素等的影响，在不同个体中，TNF － α 的测 定值变异幅度较大，不同的实验室可能会得出不同的结果， 故将 TNF － α作为早期妊娠结局的预测标记物，尚需大量 的临床和实验研究。 参考文献 ［1］ 乐杰．妇产科学［M］． 7 版．北京:人民卫生出版社，2008:132． ［2］ 郑筱萸．中药新药临床研究指导原则(试行) ［S］．北京:中国 医药科技出版社，2002:253 － 256． ［3］ 张玉珍． 中医妇科学［M］． 北京:中国中医药出版社，2002: 208 － 213． ［4］ 余永邦，秦民坚，余国奠．太子参化学成分、药理作用及质量 评价研究进展［J］ ．中国野生植物资源，2003(4) :1 － 3． ［5］ 邵龙江，王红梅，祝诚，等．围植入期大鼠子宫中血管上皮因 子的表达与血管生成［J］ ． 科学通报，2001，46(5) :397 － 400． ［6］ Kingdom J，Huppertz B，Seaward G，et al． Development of the placental villous tree andits consequences for fetal growth［J］． Eur J Obstee Gynecol Reprod Biol，2000，92(1) :35 － 43． ［7］ 金伯泉主编．细胞和分子免疫学［M］．西安:世界图书出版公 司，1995:363 － 367． ［8］ 韩丽英，赵淑华，李荷莲，等．正常早孕及反复流产妇女血清 中 TNF － α、IL － 6 水平的检测［J］． 白求恩医科大学学报， 2000，26(3) :272 － 274． ［9］ Manjiri K，Catherine NP． Acquired thrombophilias and pregnancy ［J］． Best Practice ＆ Research Clinical Obstetrics ＆ Gynecology， 2003，17(3) :491 － 5071． 第 31 卷 第 5 期 2 0 1 3 年 5 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 31 No． 5 May 2 0 1 3 中 华 中 医 药 1090 学 刊 消癥散瘀方对子宫内膜异位症模型大鼠 OPN表达的影响 赵蕾1，尹航1，祝秀芝2，吕玲2 (1．浙江中医药大学，浙江 杭州 310053;2．浙江中医药大学附属第二医院，浙江 杭州 310003) 摘 要:目的:观察消癥散瘀方对子宫内膜异位症模型大鼠 OPN表达的影响，探讨其治疗子宫内膜异位症的 作用机理。方法:采用手术移植法建立大鼠子宫内膜异位症模型，随机分为正常对照组、模型组、消癥散瘀方组、 丹那唑组。造模成功各组给药 3 周后，ELISA法检测各组大鼠血清 OPN 水平;免疫组化检测各组大鼠在位及异 位内膜 OPN蛋白表达。结果: 模型组与正常对照组比较，血清 OPN 水平及内膜 OPN 蛋白表达明显升高( P ＜ 0． 01) ;消癥散瘀方组与模型组比较，血清 OPN水平及内膜 OPN蛋白表达明显降低( P ＜ 0． 01) 。结论:消癥散瘀 方通过降低子宫内膜异位症模型大鼠血清 OPN 水平及内膜 OPN 蛋白表达，抑制异位内膜生长，降低其侵袭、转 移、种植的能力，从而达到治疗内异症的目的。 关键词:子宫内膜异位症;骨桥蛋白;消癥散瘀方;实验研究 中图分类号:R －332 文献标志码:A 文章编号:1673 － 7717( 2013) 05 － 1090 － 03 Effects of Xiaozheng Sanyu Formula on OPN of Rats with Endometriosis ZHAO Lei1，YIN Hang1，ZHU Xiuzhi2，LU Ling2 (1． ZheJiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，Zhejiang，China; 2． The Secound Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，Zhejiang，China) 0901 第 31 卷 第 5 期 2 0 1 3 年 5 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 31 No． 5 May 2 0 1 3 中 华 中 医 药 1091 学 刊 Abstract:Objective:To observe the effects of Xiaozheng Sanyu Formula on OPN of endometriosis model，and to inves- tigate its mechanism in the treatment of endometriosis． Methods:Rats model of endometriosis were built by surgical trans- plant，and we randomly divided them into normal control group，model group，Xiaozheng Sanyu Formula group and Danazol group． After successful modeling，each group was given medicine for 3 weeks． The serum level of OPN in each group was determined by ELISA;and the positive expression of OPN protein in the focal tissue tested with immunohistochical meth- od． Results:The model group compared with the normal control group，showing the level of OPN in serum and the positive expressions of OPN protein in the focal tissue was evidently higher(P ＜ 0． 01)． Conclusion:Xiaozheng Sanyu Formula can decrease the level of OPN in serum and the positive expression of OPN protein in the focal tissue，therefore it can inhibit growthing of heterotopic membrane and decrease the ability of invading，transferring and implanting，so as to achieve the goals of treatment． Key words:endometriosis;OPN;Xiaozheng Sanyu Formula;experimental research 子宫内膜异位症(简称内异症，endometriosis EMs)是育 龄女性的常见病、多发病和疑难病，近年来该病发病率明显 升高。该病是一种具有增生、浸润、扩散、反复发作等特征 的良性疾病，其某些生物学行为类似恶性肿瘤［1］。消癥散 瘀方是医院协定方，已经在临床应用 10 余年，治疗效果显 著。为了进一步探讨消癥散瘀方对 EMs的药理作用，本实 验采用改良子宫内膜自体移植法建立 EMs大鼠模型，用消 癥散瘀方灌胃提前干预治疗，检测使用该药后骨桥蛋白 (osteopontin，OPN)在模型大鼠体内水平表达的变化情况， 从而探讨消癥散瘀方治疗 EMs的作用机制，为中医药治疗 子宫内膜异症提供更多的实验依据。 1 材料与方法 1． 1 实验动物 Wistar雌性未孕大鼠，体重(200 ± 20)g，鼠龄 8 ～ 12 周。浙江中医药大学实验动物中心提供，微生物控制等级 为一级。在通风、湿度、温度适宜的动物室内常规饲养。动 物实验条件合格证 SYXK(浙)2008 － 0116。实验动物 合格证 x0902021。 1． 2 药物与试剂 消癥散瘀方由三棱、莪术、丹参、当归、牡丹皮、赤芍、刘 寄奴诸药构成，购自浙江中医药大学附属第二医院中药房， 将上药煎煮浓缩制备成含生药 2 g / mL的癥散瘀悬浊液塑 封储于 4 ℃冰箱。丹那唑(上海华联制药有限公司生产， 国药准字 H31021681) ，用 1%的甲基纤维素纳溶解成 8 mg / mL的溶液。大鼠 OPN酶联免疫吸附试验试剂盒购自 北京冬歌生物科技有限公司。兔抗大鼠 OPN 单克隆抗体 购自武汉博士德生物工程有限公司。两步法 S － P 免疫组 化染色试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。 1． 3 实验方法 1． 3． 1 造模方法 大鼠 EM模型的建立是根据 Vernon采 用自体子宫内膜盆腔移植法，改进建立 EM 动物模型。每 日定时进行阴道涂片检查，选择动情周期 4 ～ 5 天并连续有 两个正常动情周期的大鼠，在第 3 个动情周期实施移植手 术。术后饲养 3 周后，随机抽取 10 只造模鼠二次开腹。观 察到移植的子宫内膜体积增大，部分增大物内含液性物体， 包裹于结缔组织中，甚至大网、肠管与腹壁广泛粘连。依据 《实验动物学》大鼠用药换算:每 200 g 大鼠药物剂量 为 60 kg成人药物剂量的 0． 018 倍，换算大鼠的药物剂量。 正常对照组:12 只同龄同种在相同条件下饲养的正常雌性 大鼠;模型对照组:15 只模型大鼠术后 3 周，每日给予 2 mL 生理盐水灌胃 1 次，连续 3 周;消癥散瘀方组:14 只模型大 鼠术后 3 周，每日以 5． 4 g /100 g 消癥散瘀悬浊液灌胃 1 次，连续 3 周;丹那唑组:14 只模型大鼠术后 3 周，每日以 3. 6 mg /100 g丹那唑悬浊液灌胃 1 次，连续 3 周。 1． 3． 2 LEISE检测方法 上述各组灌胃给药 3 周后，无菌 摘取大鼠眼球取血，每只大鼠取血约 3 mL，置入含 0． 2 mL 2% EDTA － Na2抗凝剂塑料试管内混匀，以 4 ℃、3000 r / min离心 15 min，取血清分装，于 － 30 ℃保存待用。之后断 头处死，剖取大鼠在位及异位子宫内膜组织(尽量选取含 有新鲜出血及血管丰富处)放入 4%多聚甲醛溶液中。 1． 3． 3 免疫组化 S － P 检测方法 石蜡包块切片后置于 60 ～ 65 ℃温箱烘烤 30 ～ 60 min，切片脱蜡至水→加蒸馏水 新鲜配制的 3%H2O2，室温 10 min以灭活内源性过氧化物 酶，蒸馏水洗涤 3 次→热修复抗原:将切片浸入 0． 1 M枸橼 酸盐缓冲液，微波炉加热至沸腾后断电，间隔 10 min 后，反 复 2 次，冷却后 PBS洗涤 2 次→滴加正常山羊血清封闭液， 以减少非特异性染色，室温 20 min，甩去多余液体，不洗→ 滴加效价 1 ∶ 80 的一抗 37 ℃，60 min。PBS 洗 2 min × 3 次 →滴加生物素化山羊抗兔 IgG(二抗)37 ℃ 20 min。PBS洗 2 min × 3 次→滴加试剂 SABC37 ℃，20 min。PBS 洗 5 min × 4 次→DAB显色:取 1 mL蒸馏水，加试剂盒中 A、B、C试 剂各 1 滴，混匀后加至玻片，室温显色，镜下控制反应时间， 一般在 5 ～ 10 min之间，蒸馏水洗涤→苏木素轻度复染、脱 水、透明、封片，显微镜观察，IPP 软件计算积分吸光度值 (IOD值)。 1． 4 疗效判断 1． 4． 1 EMs模型建模成功肉眼观察标准 可见移植物有 一定的体积，并有液体积聚，透明呈囊状，表面有血管攀附， 质地软，此是判定移植物存活的指标［2］。 1． 4． 2 免疫组化判断标准 根据阳性细胞所占比例和染 色强度进行半定量判定［3］。阳性染色为胞浆内出现棕黄 色颗粒，随机选择 5 个不同的高倍视野，按细胞染色程度: 未见染色为 0 分，细胞轻度染色呈浅黄色为 1 分，中度染色 呈棕黄色为 2 分，深度染色呈棕褐色为 3 分;按染色的阳性 细胞百分比:阳性细胞数 ＜ 5%为 0 分;5% ～ 25%为 1 分; 26% ～50%为 2 分;＞ 50%为 3 分。两种评分相乘，即为其 1901 第 31 卷 第 5 期 2 0 1 3 年 5 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 31 No． 5 May 2 0 1 3 中 华 中 医 药 1092 学 刊 阳性积分。累积 0 ～ 1 分为阴性(－) ，2 ～ 3 分为弱阳性 (+) ，4 ～ 6 分为阳性(++) ，＞ 6 分为强阳性(+++)。结果 判定在双盲下进行，每张切片由两位病理科医师分别计数。 1． 5 统计学处理 所有数据均采用 SPSS 16． 0 软件进行 统计学分析，计数资料用均数 ±标准差表示(珋x ± s) ，治疗前 后的比较采用 t检验。P ＜ 0． 01 认为差别有高度统计学意 义。 2 结 果 2． 1 ELISE法检测各组大鼠血清 OPN水平 见表 1。实验结果:模型组血清 OPN 水平明显高于正 常对照组，其差异有显著性意义(P ＜ 0． 01) ;消癥散瘀方组 血清 OPN水平明显低于模型对照组，其差异有显著性意义 (P ＜ 0． 01)。 表 1 各组大鼠血清 OPN水平测定结果(珋x ± s) 组别 n OPN(pg / mL) 正常对照组 12 145． 58 ± 18． 09 模型组 12 501． 67 ± 39． 16△ 消散瘀方癥组 12 239． 25 ± 14． 94* 丹那唑组 12 246． 17 ± 16． 69 注:与正常对照组比，△P ＜ 0． 01;与模型组比，* P ＜ 0． 01。 2． 2 各组大鼠在位及异位内膜 OPN蛋白表达 见表 2。实验结果显示:模型组在位及异位内膜 OPN蛋 白阳性表达与正常对照组相比显著增高，差异有显著性意义 (P ＜0． 01)。消癥散瘀方组在位及异位内膜 OPN蛋白阳性 表达低于模型对照组，其差异有显著性意义(P ＜0． 01)。 表 2 各组大鼠在位及异位内膜 OPN蛋白表达(珋x ± s) 组别 n OPN表达强度 — + + + 阳性 + + + 百分率 (%) IOD值 (珋x ± s) 正常对照组 12 3 7 2 0 75． 00 1． 83 ± 1． 34 模型组 12 1 3 2 6 91． 76 6． 33 ± 3． 08△ 消散瘀方癥组 12 2 7 2 1 83． 33 3． 33 ± 2． 31* 丹那唑组 12 4 4 3 1 66． 67 2． 75 ± 2． 70 注:与正常对照组比，△P ＜ 0． 01;与模型组比，* P ＜ 0． 01。 3 讨 论 子宫内膜异位症具有盆腔内种植、多部位发病和易于 复发等类似恶性肿瘤的生物学行为，针对其类似恶性肿瘤 的生物学特质，OPN引起我们的关注。OPN 是一种新的肿 瘤标志物［4］，近年国内外不少研究指出，OPN 参与细胞信 号转导，促进细胞黏附和迁移，并与肿瘤细胞的生长、侵袭、 转移等恶性行为密切相关［5］，Odagiri 等［6］发现 OPN 与 EMs亦有着密切的关系，EMs在位及异位内膜 OPN的表达 均高于正常子宫内膜。因此本研究以 OPN为切入点，通过 研究发现消癥散瘀方作用于 EMs模型大鼠后，其血清 OPN 水平及在位、异位内膜 OPN蛋白表达均呈明显下降表现(P ＜ 0． 01) ，推测消癥散瘀方治疗子宫内膜异位症的作用机理 是通过抑制 OPN的表达实现的。 在 EMs治疗方面西医多采用激素和手术疗法，但其复 发率高，不良反应大。丹那唑(danazol)是 70 年代人工合成 的一种 17α －乙炔睾丸酮衍生物，80 年代即为治疗子宫内 膜异位症的首选药物，沿用至今。但由于雄激素升高和雌 激素不足可导致 80%的患者出现不同程度的副反应，如体 重增加、痤疮、多毛、潮热、乳房缩小和萎缩性阴道炎等。祖 国的传统医学在治疗 EMs 方面显示出了其优势。消癥散 瘀方是医院协定方，已经在临床应用 10 余年，治疗效果显 著。本方由三棱、莪术、丹参、当归、牡丹皮、赤芍、刘寄奴诸 药构成。三棱性平、味苦，可破血、逐瘀、行气，《本草纲目》 称三棱能“破气散结”。莪术性温、味苦辛，为破血之品，可 破血行气，软坚止痛，现代药理研究表明，莪术能明显提高 机体免疫功能，抑制肉芽组织增生，降低血液中纤维蛋白原 水平，增强纤维蛋白溶解酶活性，促进腹腔自体血液和血块 的吸收［7］。丹参性苦、微寒，归心、肝经，能活血化瘀、养血 止痛。现代药理研究表明丹参能够抑制组织异常增生，抑 制胶原合成，促进分解，使增生变性的结缔组织软化、吸收。 另外，丹参通过调整凝血 －纤溶 －血小板系统状态来增强 抗肿瘤能力［8］。当归性甘、辛、温，归心、肝、脾经，功能补 血、调经、活血、止痛、润肠通便。治月经不调、经闭腹痛、癥 瘕结聚、血虚头痛等。牡丹皮归心、肝、肾经，为牡丹的干燥 根皮，有清热凉血，活血散瘀之功效。牡丹皮始载于《神农 本草经》曰“主治寒热疭痉，除癥坚，瘀血”。现代药理学研 究表明，牡丹皮具有抗炎、抗肿瘤、降血糖、抗血栓和动脉粥 样硬化等药理作用［9］。赤芍清热祛瘀，行气止痛。《本经》 曰其“主邪气腹痛，除血痹，破坚积，寒热疝瘀，止痛，利小 便”。赤芍提取物赤芍 D 有直接抗癌作用，并能促进巨噬 细胞的吞噬功能。刘寄奴归心、肝经，有破血通经，散瘀止 痛之功，常用于血瘀痛经、经闭、产后瘀滞腹痛等证。由此 可见，消癥散瘀方的作用是多方面的，它可以通过改善血液 流变、提高机体免疫功能、促进局部粘连松解、抑制异常组 织增生、缓解疼痛等作用来治疗 EMs。 参考文献 ［1］ 郎景和．重视疑难性子宫内膜异位症的临床与研究基础［J］． 中国实用妇产科与产科杂志，2009，25(9) :641 － 642． ［2］ 肖成明，曹丹，张红，等．雌激素在大鼠子宫内膜异位症模型 建立中的作用［J］．宁夏医学杂志，2011，33(7) :582 － 584． ［3］ 杨鉴冰，姚飞，陈梅，等．祛异康对子宫内膜异位症大鼠模型 CD44 表达的影响［J］．现代中医药，2010，30(1) :43 － 45． ［4］ 罗安娜，关婷．骨桥蛋白与子宫内膜异位症的相关研究［J］． 中国综合临床，2010，26(2) :217 － 219． ［5］ Odagiti K． Konno B，Fujiwam H，et al． Immunohistochemical study of osteopontin and L － selectin in a rat endomettiosis model and in human endometrinsis［J］． Fertil Steril，2007，88(4 Sup- pl) :1207 － 1211． ［6］ Bukulmez O，Hardy DB，Cart BR，et al． Androstenedione up － regulation of endometrial aromatase expression via localconversion to estrogen:potential relevance to the pathogenesis of endometrio- sis［J］． J Clin Endocrinol Metab，2008，93:3471 － 3477． ［7］ 陆海英，刘克剑，张悦，等．中药抗纤灵方含药血清对 TGF － β1刺激的 HK －2 细胞 c － Met 及其下游 MAPK 信号分子的 调控作用［J］．中国病理生理杂志，2010，26(1) :154 － 157． ［8］ 国家药典委员会．中华人民共和国药典:1 部［S］．北京:中国 医药科技出版社，2010:61． ［9］ 姜萧．牡丹皮药理作用的研究进展［J］． 中国新医药，2004，3 (8) :1102 － 1111． 2901