模式生物斑马鱼在中药研究中的应用

· 434 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (4): 434−439 模式生物斑马鱼在中药研究中的应用 陈 磊 1, 刘 怡 2*, 梁生旺 1 (1. 广东药学院中药学院, 广东 广州 510006; 2. 南方医科大学中医药学院, 广东 广州 510515) 摘要: 斑马鱼作为一种新的模式动物, 已经在生物医学的诸多研究领域得到了广泛的应用。近年来, 基于斑 马鱼的中药相关研究越来越多。本文重点综述了斑马鱼应用于中药药理、毒理研究方面的成果和前景。 关键词: 斑马鱼; 模式生物; 中药 中图分类号: R284 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870 (2012) 04-0434-06 Application of zebrafish model organism in the research of Chinese materia medica CHEN Lei1, LIU Yi2*, LIANG Sheng-wang1 (1. School of Chinese Pharmacy, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China; 2. College of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China) Abstract: Zebrafish has become an important model organism in many fields of biomedical studies and been increasingly used in Chinese materia medica studies in recent years. This article summarized the achievements and prospect for zebrafish as a pharmacological and toxicological tool in the study and development of Chinese materia medica. Key words: zebrafish; model organism; Chinese materia medica 模式生物是指那些由生物学家选定进行科学研 究, 用于揭示某种具有普遍规律生命现象的物种 [1], 现今应用较多的模式生物有真菌中的酵母、原核生物 中的大肠杆菌、昆虫纲的果蝇、鱼纲的斑马鱼及哺乳 纲的小鼠等。其中斑马鱼在 20世纪 70年代开始受到 科学家们的关注, 并因其具有繁殖能力强、体外受精 和发育、胚胎透明、性成熟周期短、个体小、易养殖 等诸多特点, 成为最重要的模式脊椎动物之一[2]。目 前在国际上, 模式生物斑马鱼的使用正逐渐拓展和 深入到生命体多个系统 (例如神经系统、免疫系统、 心血管系统、生殖系统等)的发育、功能和疾病 (例 如神经退行性疾病、遗传性心血管疾病、糖尿病等) 收稿日期: 2011-10-27; 修回日期: 2011-12-30. 基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (81050019); 广东高校优秀青 年创新人才培养计划资助项目 (LYM10095). *通讯作者 Tel: 86-20-39352995, Fax: 86-20-39352997, E-mail: liuyi099@163.com 的研究中, 并已应用于小分子化合物的大规模新药 筛选。 虽然我国开展斑马鱼相关的研究较晚, 但近年 来在医学、生物学、药物研发中发展很快, 基于模式 生物斑马鱼的中药相关研究不断见于报道, 对中药 有效成分的筛选、中药作用机制的阐明产生了巨大的 促进作用。总结国内外研究发现, 目前斑马鱼在中药 中的应用主要集中在中药毒理研究和重大疾病中药 成分活性筛选两方面, 本文将重点对其应用情况进 行综述。 1 斑马鱼在中药毒理研究中的应用 尽管目前细胞培养是一种重要而有效的获得药 物毒理信息的途径, 但其缺点在于不能反映体内细 胞的整体环境; 对哺乳动物进行研究本应是发现药 物毒理最灵敏和最有价值的方式, 但在目前的技术 条件下该方式既昂贵又费时费力, 同时存在伦理道 德问题。与之相比, 斑马鱼作为整体动物模型, 其胚 陈 磊等: 模式生物斑马鱼在中药研究中的应用 · 435 · 胎一开始就在宫外发育的特点使之成为了药物毒理 研究一个经济而有效的选择。 20世纪 70 年代末期, 国外开始运用斑马鱼进行 化合物的急性毒性研究[3]。在毒性评价实验中, 依据 斑马鱼在受试药物作用下表现出的各种特征, 包括 IC50、死亡、发育异常、形态改变、色素消失等, 可 知测试药物的毒性及其对哪些组织、器官存在毒性作 用[4]。例如: 很多药物具有心脏毒性, 从而引起服用 者心率失常。斑马鱼早期胚胎透明, 发育 24 h时已出 现心跳, 发育 48 h时已形成功能化的心脏[5], 借助显 微镜可方便观察药物对心脏的毒性作用, 因此可通 过斑马鱼对药物心脏毒性进行早期评估[6]。 研究人员采用模式生物斑马鱼评价了 3 种中药 成分雷公藤甲素、苦参碱和大黄素 (1～3, 图 1) 的 急性毒性 [7], 将药物加到斑马鱼生活的水中, 观察 给药后 24 h 的死亡情况, 从而判断待测药物毒性的 大小。经计算, 雷公藤甲素、苦参碱和大黄素这 3种 化合物对斑马鱼的毒性从高到低依次为雷公藤甲 素 > 苦参碱 > 大黄素, 用 Bliss 法计算各药物对斑马 鱼的半数致死浓度 (LC50), 雷公藤甲素、苦参碱和 大黄素对于斑马鱼的 LC50值依次为 5.02×10−3、113.2 和 1.18×103 μg·mL−1, 并认为该结果与这 3 种成分小 鼠口服 LD50毒性大小测定结果基本一致。 中药雷公藤中三萜化合物雷公藤红素是具有多 种生物活性的天然产物, 有很强的抗氧化、抗肿瘤新 生血管生成及抗类风湿作用。在雷公藤红素 (4, 图 1) 对斑马鱼胚胎心脏毒性的研究中发现[8]: 只有在 雷公藤红素 1 μmol·L−1 浓度以下才不会出现心瓣膜 出血、血循环异常等中毒症状, 而 2、3和 4 μmol·L−1 雷公藤红素均导致胚胎心脏中毒, 出现心脏线性化、 心膜出血、血细胞在心区堆积等现象, 而且心率也随 着浓度的升高和作用时间的延长而明显下降, 并得 出雷公藤红素引起斑马鱼胚胎心率下降的 EC50 为 1.78 μmol·L−1。 飞机草既是中草药又是外来入侵物种, 张孝敏 等[9]将飞机草 95%乙醇提取物冻干粉对斑马鱼进行 水浴染毒, 结果发现其对斑马鱼的心、脑具有较大的 毒性作用, 可导致斑马鱼心肌细胞溶解、萎缩, 严重 时坏死, 脑组织局灶性炎性细胞浸润、血栓形成和各 细胞层结构变化, 并随着提取物冻干粉含量的增大, 斑马鱼心、脑的病理组织学改变更加明显。 黄惠琳等[10, 11]观察了不同浓度的氯化两面针碱 (5, 图 1) 对斑马鱼心脏及胚胎的影响, 发现各给药 组在受精后 60 h和 72 h时均出现胚胎心脏中毒现象, 并推测其机制可能在于不同浓度的氯化两面针碱对 斑马鱼机体中的 SOD 活力及 MDA 含量产生不同的 影响。 王稼农等[12]以斑马鱼的 SOD 和 Na+-K+-ATPase 活性作为观测指标, 考察了秋水仙碱的毒性。得出秋 水仙碱 (6, 图 1) 对斑马鱼的 LC50为 16.90 mg·L−1, 并发现随秋水仙碱浓度增大和染毒时间延长, 斑马 鱼鳃中 SOD和Na+-K+-ATPase活性均受到显著抑制; 而肝脏 SOD活性增加, Na+-K+-ATPase活性总体呈现 抑制的趋势。 某些药物可能会造成斑马鱼的发育畸形, 如四 肢短小、色素消失、尾巴消失等。如田丽莉等[13]发 现莪术醇 (7, 图 1) 可致斑马鱼身体弯曲, EC50 (96 hpf) 为 51.17 mg·L−1, 并能明显降低胚胎孵化率, 使 心率显著降低, 且呈现剂量依赖性。同时低浓度莪术 醇可显著促进斑马鱼自主运动, 明显降低仔鱼的泳 速。 2 斑马鱼在中药成分筛选中的应用 随着高通量筛选技术的发展, 使得体外筛选可 获得包括中药成分在内的大量活性化合物, 但由于 很多药物往往存在吸收、分布、代谢、排泄及毒性等 方面的问题, 对这些活性化合物进行动物实验鉴定 就显得非常必要。目前用于药物筛选的动物模型主要 有线虫、果蝇、小鼠、斑马鱼等, 其中线虫、果蝇可 用于大规模筛选, 但并不能阐明脊椎动物特异的组 织如肾、心脏、脊索、神经脊细胞和血细胞的发育和 功能; 小鼠作为哺乳动物, 基因和人类基因高度同源, 是目前应用最广泛的药物筛选动物模型, 但其繁育 周期长且使用成本高昂; 斑马鱼由于基因与人类基 因的相似度达到 87%, 且在遗传、生理和药理反应方 面与人类存在高度的相似性, 具有与哺乳动物相似 的心血管、造血、神经及代谢等系统, 在药物筛选方 面具有相当大的潜能。 目前利用基因突变方法, 建立了各种斑马鱼疾 病模型[14], 如: 肿瘤[15]、造血系统疾病[15]、肌萎缩[16]、 心血管疾病[17]、感染和免疫疾病[18]、心律失常[19]、 耳听力疾病[20]、药物成瘾[21]等, 其中有些斑马鱼突变 系具有与人类疾病相似的症状, 这对新药筛选和内 脏特异性毒理学研究起着至关重要的作用。此外利用 斑马鱼进行活体药物筛选可以克服体外细胞和化学 筛选模型的局限性——即只能观察化合物对某一特 定生理过程的效果, 而无法从整体水平直观地评估 药物的治疗作用、不良反应及毒性作用等[4]。 2.1 抗/促血管生成 在血管增生药物的筛选方面, · 436 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (4): 434−439 斑马鱼最大的特点在于胚胎发育透明, 早期血管生 成的模式比较简单, 主要出现在头部和躯干部体节 间, 所以在斑马鱼胚胎的发育过程中, 可以在显微镜 下清晰地观察到心脏和血管的发生发展, 是一种理 想的血管生成活体动物模型[22]。 传统中药白花蛇舌草及其同属植物伞房花耳草 具有抗肝炎和治疗恶性肿瘤作用, Liang 等[23]采用模 式生物斑马鱼对其不同溶剂提取物进行了抗血管生 成实验, 同时对白花蛇舌草中主要成分 (熊果酸、齐 墩果酸、车叶草苷、6-O-p-香豆烯醛基鸡屎藤苷甲酯) 也进行了抑制血管生成作用分析。结果发现两种中 药的甲醇提取物都没有抑制血管生成作用, 氯仿提 取物仅有微弱的抑制血管生成作用; 各主要成分也 没有发现明显的抑制血管作用。作者推测, 上述两种 药物的药理作用可能是由其多糖成分通过免疫调节 产生。 Hong等[24]通过人脐静脉血管内皮细胞和斑马鱼 体内模型对三七总皂苷 (总皂苷含量 > 95%, 含 11种 皂苷成分) 提取物血管生成作用进行了考察。结果 发现三七总皂苷显著促进人脐静脉血管内皮细胞增 殖, 同时明显促进了斑马鱼肠下静脉 (sub-intestinal vessels) 再生。 中药雷公藤中含有大量萜类化合物, He 等[25]采 用斑马鱼胚胎模型首先考察了不同溶剂雷公藤提取 部位的抑制血管生成活性, 并在活性指导下进一步 分离纯化出雷公藤甲素、雷公藤红素和 cangoronine (1、4、8, 图 1), 这 3 个化合物对抑制血管生成作用 强弱的研究结果显示: 雷公藤甲素活性最强, 浓度在 1.2 μmol·L−1时可显著下调胚胎 Ang-2/Tie2 mRNA表 达, 从而抑制斑马鱼血管生成 (约 50%)。 He等[26, 27]采用斑马鱼胚胎抑制血管生成模型对 中药大黄不同溶剂提取物及大黄主要蒽醌衍生物活 性及机制进行了研究。发现在大黄正己烷、乙酸乙 酯、正丁醇和水提取部位中乙酸乙酯部位抑制血管作 用最强 (52%), 大黄素、芦荟大黄素、大黄酸 (3、9、 10, 图 1) 具有明显的血管抑制作用。进一步对大黄酸 抑制血管作用机制考察发现, 20 μmol·L−1大黄酸基本 可以完全抑制 48、72 hpf斑马鱼节间血管生成, 其作 用主要通过下调胚胎的 Ang-2/Tie2 mRNA 表达及抑 制内皮细胞迁移实现。同时 He等[28]采用相同方法对 图 1 化合物 1～17 陈 磊等: 模式生物斑马鱼在中药研究中的应用 · 437 · 中药益智不同溶剂提取物抑制血管生成作用进行了 研究, 发现其正己烷和乙酸乙酯部位具有较强活性。 Liu 等[29]采用转基因斑马鱼 [TG (fli1: EGFP)y1/ + (AB) ] 胚胎血管生成模型对中药地黄水粗提取物不同 溶剂萃取部位进行了活性筛选, 并对活性部位主要 化学成分进行了血管药效学研究。结果显示地黄水粗 提取物质量浓度达 250 μg·mL−1时可明显增加斑马鱼 肠下静脉毛细血管形成数量; 进一步将水粗提取物 依次用二氯甲烷, 乙酸乙酯和正丁醇萃取后再进行 活性筛选, 发现二氯甲烷部位活性最强; 对二氯甲烷 部位进一步分离, 得到活性部位主要化学成分, 经鉴 定为咖啡酸 (11, 图 1), 其质量浓度为 50 μg·mL−1时 即有明显促血管生成作用 (P < 0.001)。 温郁金 (Curcuma wenyujin.) 为姜科植物温郁金 (温莪术、黑郁金) 的根茎, Zhong等[30]对其挥发油中 莪术呋喃二烯 (12, 图 1) 分别采用人脐静脉血管内 皮细胞和斑马鱼胚胎模型, 体内、体外考察了其抑制 血管生成作用。在体内斑马鱼胚胎模型实验中发现, 10 μmol·L−1 呋喃二烯即可抑制斑马鱼肠下静脉毛细 血管形成, 50 μmol·L−1呋喃二烯抑制肠下静脉毛细血 管形成效果 (72 h) 与 5 μmol·L−1血管内皮生长因子 受体抑制剂 SU5416 近似, 认为呋喃二烯为温郁金中 主要抗肿瘤活性成分。与以上研究相似, Alexa 等[31] 对青黛中靛玉红 (13, 图 1)、Chan 等[32]对七叶一枝 花中重楼皂苷 D (14, 图 1) 都采用了斑马鱼胚胎抑 制血管生成模型进行了活性筛选研究, 均发现有明 显的血管生成抑制作用。 与以上基于中药单味药及其成分的研究相比, 王思锋、刘可春等[33, 34]率先采用斑马鱼胚胎血管生 成模型对中药复方进行了考察, 发现中药复方制剂 西黄丸 25、50、100 mg·L−1甲醇浸提液可显著抑制斑 马鱼胚胎体节间血管生长, 半数抑制质量浓度 IC50 约为 29.6 mg·L−1; 对其拆方药味研究发现抑制作用主 要是其中乳香与人工牛黄药味, 人工牛黄组斑马鱼节 间血管 (inter-segmental vessel, IV) 数为 (22.67 ± 2.60), 抑制率为 17.3%; 乳香提取物组 IV数为 (17.2 ± 5.71), 抑制率为 37%; 与对照组比较, 人工牛黄、乳香提取 物具有显著的抑制斑马鱼节间血管生成的作用 (P < 0.05 或 0.01)。在中药复方中的研究扩展了斑马鱼在 中药中的应用。 2.2 抗神经毒性、耳毒性等 与斑马鱼用于中药血 管生成活性方面的筛选相比, 目前应用于其他疾病 的中药筛选还比较少。 Richetti等[35]考察了槲皮素和芦丁 (15、16, 图 1) 对东莨菪碱致记忆障碍斑马鱼模型的防治作用。将经 过记忆训练的斑马鱼置于分散有 200 μmol·L−1东莨菪 碱的玻璃箱内 (18 cm × 9 cm × 7 cm, L × W × H), 1 h后 向鱼体注射槲皮素和芦丁药物 (50 mg·kg−1), 经与空 白组 (Tween-20, 盐水溶液) 对照发现, 槲皮素和芦 丁药物都可在不影响鱼体正常运动的情况下预防由 东莨菪碱导致的记忆障碍, 同时作者提出槲皮素和 芦丁等植物成分可能成为神经系统疾病 (如阿尔茨 海默症) 的治疗药物。王言、杨中林等[36]对续断总皂 苷对斑马鱼空间认知能力的影响进行了研究, 将斑 马鱼连续暴露于续断总皂苷溶液中 120 h, 考察药物 对斑马鱼认知行为和对 Na+-K+-ATP酶的影响, 在体 实验结果表明, 高剂量的续断总皂苷可以显著提高 斑马鱼的认知和记忆能力及 Na+-K+-ATP酶的活力。 从耳的结构来看, 虽然斑马鱼没有中耳和外耳, 但具有脊椎动物典型的内耳结构。从生理功能来看, 其内耳行使着前庭和听觉功能, 内耳的毛细胞在结 构功能及分子水平上与哺乳动物的内耳毛细胞非常 相似[20]。Pyun 等[37]考察了绿茶中微量成分表儿茶精 (17, 图 1) 通过抑制活性氧防止辐射诱发的斑马鱼听 细胞死亡作用。研究发现表儿茶精可明显减弱辐射诱 发的胚胎毒性, 防止辐射诱发的神经丘毛细胞减少, 认为其是防治辐射诱发耳毒性的安全有效候选药物。 3 结语 1981年 George Streisinger[38]首次在《Nature》发 表关于斑马鱼的研究论文, 在过去的 20 年里, 斑马 鱼作为一种模式生物已被广泛应用到生命科学的发 育、遗传、免疫、毒理等众多研究领域。近年来, 模 式生物斑马鱼在药物筛选、毒理研究、疾病模型和作 用机制等方面发挥着越来越重要的作用, 甚至改变 了新药发现的策略[39]。 但需要说明的是, 由于与人物种间的差异, 斑马 鱼模型在药物研究中也必然存在局限性, 如斑马鱼 最大的血管直径只有 30～50 μm, 且整体血液量少, 难以直接检测血压和取血, 斑马鱼缺少与哺乳动物 类似的呼吸系统, 对该系统的药物筛选困难; 斑马鱼 的内脏在体节发育中期形成, 比哺乳动物晚, 不同的 消化器官由各自不同的始基发育而成, 而哺乳动物 由单一始基发育形成, 斑马鱼基因虽然与人类基因 有高度相似性, 但也存在差异, 其不少基因的功能与 人体差异明显, 因此与药物结合位点和效应可能也 不同[4]; 虽然可以对斑马鱼进行大规模随机诱变筛选 隐性突变体, 但对其基因组中特定基因的定向突变 非常繁琐和困难[40, 41]等。 · 438 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (4): 434−439 同时, 结合笔者实验室开展的工作, 认为斑马鱼 用于中药研究还存在以下需要注意的问题: ① 目前 采用斑马鱼进行中药药效学研究和毒性筛选的报道 较少, 其可靠性和适用性都还需要进一步的评价; ② 斑马鱼实验动物未实现化, 没有统一的规格和 质控方法, 需要考虑药物研究结果的稳定性和重复 性; ③ 在斑马鱼实验之后, 应当再搭配使用其他动 物模型, 特别是哺乳动物 (如小鼠等) 模型进行进一 步的验证; ④ 在中药复方相关研究中, 需要考虑如 何实现斑马鱼疾病模型的代表性和指标的针对性。 总的来看, 目前斑马鱼用于中药的研究还处于 探索阶段, 并主要用于中药毒理和肿瘤等重大疾病 药效成分筛选上。但根据已取得研究结果可以肯定, 模式生物斑马鱼在解决中药及其复方研究中的几个 关键问题——是否有效、什么成分有效、为什么有效 上都可以发挥重要的作用, 并将有助于解决中药及 其复方制剂的复杂性和安全性问题。展望未来, 模式 生物斑马鱼以与人类基因高度相似、活体模型为优势 必将在中药及其复方物质基础研究、代谢研究、药效 成分快速发现、药理机制研究上取得重大突破。 References [1] Zhao XY, Liang SF, Yao SH, et al. Identification and preliminary function study of Xenopus laevis DRR1 gene [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2007, 361: 74−78. [2] Liu CS, Mu Y, Du JL. Application of the zebrafish in the research of life sciences [J]. Chin Bull Life Sci (生命科学), 2007, 19: 382−386. [3] Wang JJ, Xu C, Tu Y, et al. Experimental research and application of zebrafish and embryos in toxicology [J]. Asian J Ecotoxicol (生态毒理学报), 2007, 2: 123−135. [4] Li YY, Huang WJ, Huang C. Zebrafish in drug discovery [J]. Chin Bull Life Sci (生命科学), 2011, 23: 273−379. [5] Westerfield M. The Zebrafish Book [M]. Eugene: University of Oregon Press, 1995: 16−21. [6] Ensenbach U, Nagel R. Toxicity of complex chemical mixtures: acute and long term effects on different life stages zebrafish (Brachydanio rerio) ecotoxicology and environmental [J]. Ecotoxicol Environ Safety, 1995, 30: 151−157. [7] Shu B, Wei Y, Zhang LY, et al. Acute toxicity of triptolide, matrine and emodin on zebrafish [J]. J Yunnan Coll Tradit Chin Med (云南中医学院学报), 2010, 33: 35−38. [8] Wang SF, Liu KC, Wang XM, et al. Preliminary study on cardiotoxicity of celastrol to zebrafish embryo [J]. Chin Pharmacol Bull (中国药理学通报), 2009, 25: 634−636. [9] Zhang XM, Chen LH, Zheng RK, et al. Histopathological changes of heart and brain in zebrafish exposure to Eupatorium odoratum extract [J]. J Guangdong Ocean Univ (广东海洋大 学学报), 2010, 30: 27−32. [10] Huang HL, Liu HG, Meng Y, et al. The effect of nitidine chloride on SOD activity and MDA content of zebrafish embryo [J]. J Toxicol (毒理学杂志), 2011, 25: 243−246. [11] Huang HL, Liu HG, Meng Y, et al. Effect of nitidine chloride on the heart development of zebrafish embryos [J]. Guangxi Med J (广西医学), 2011, 33: 546−548. [12] Wang JN, Huang J, Huang RB, et al. Effects of colchicine on the activities of SOD and Na+-K+-ATPase in Brachyclanio rerio (Zebrafish) [J]. Chin J New Drugs (中国新药杂志), 2010, 19: 1247−1252. [13] Tian LL, Dong JY, Huang CJ. Effect of curcumol on embryo-larval stages of zebrafish [J]. J Wenzhou Med Coll (温州医学院学报), 2010, 40: 557−561. [14] Lieschke GJ, Currie PD. Animal models of human disease: zebrafish swim into view [J]. Nat Rev Genet, 2007, 8: 353− 367. [15] Langenau DM, Traver D, Ferrando AA, et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish [J]. Science, 2003, 299: 887−890. [16] Langheinrich U. Zebrafish: a new model on the pharmaceutical catwalk [J]. Bioessays, 2003, 25:904−912. [17] Catherine TN, Qing L, Wang YB, et al. Zebrafish as a model for cardiovascular development and disease [J]. Drug Discov Today, 2008, 5: 135−141. [18] Sullivan C, Kim CH. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function [J]. Fish Shellfish Immun, 2008, 8: 341−350. [19] Milan DJ, MacRae CA. Zebrafish genetic models for arrhythmia [J]. Prog Biophys Mol Biol, 2008, 98: 301−308. [20] Ton C, Parng C. The use of zebrafish for assessing ototoxic and otoprotective agents [J]. Hear Res, 2005, 208: 79−88. [21] Levin ED, Lmipuangthip J, Rachakonda T, et al. Timing of nicotine effects on learning in zebrafish [J]. Psychopharma- cology (Berl), 2006, 184: 547−552. [22] Raghunath M, Sy Wong Y, Farooq M, et al. Pharmacologically induced angiogenesis in transgenic zebrafish [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2009, 378: 766−771. [23] Liang ZT, He MF, Fong WF. A comparable, chemical and pharmacological analysis of the traditional Chinese medicinal herbs Oldenlandia diffusa and O. corymbosa and a new valuation of their biological potential [J]. Phytomedicine, 2008, 15: 259−267. 陈 磊等: 模式生物斑马鱼在中药研究中的应用 · 439 · [24] Hong SJ, Wan JB, Zhang Y. Angiogenic effect of saponin extract from Panax notoginseng on HUVECs in vitro and zebrafish in vivo [J]. Phytother Res, 2009, 23: 677−686. [25] He MF, Lin L, Ge W, et al. Antiangiogenic activity of Tripterygium wilfordii and its terpenoids [J]. J Ethnopharmacol, 2009, 121: 61−68. [26] He ZH, Zhou R, He MF, et al. Anti-angiogenic effect and mechanism of rhei from Rhizoma Rhei [J]. Phytomedicine, 2011, 18: 470−478. [27] He ZH, He MF, Ma SC. Anti-angiogenic effects of rhubarb and its anthraquinone derivatives [J]. J Ethnopharmacol, 2009, 121: 313−317. [28] He ZH, Ge W, Yue GG, et al. Anti-angiogenic effects of the fruit of Alpinia oxyphylla [J]. J Ethnopharmacol, 2010, 132: 443−449. [29] Liu CL, Cheng L, Kwok HF, et al. Bioassay-guided isolation of norviburtinal from the root of Rehmannia glutinosa, exhibited angiogenesis effect in zebrafish embryo model [J]. J Ethnopharmacol, 2011, 137: 1323−1327. [30] Zhong ZF, Hoi PM, Wu GS, et al. Anti-angiogenic effect of furanodiene on HUVECs in vitro and on zebrafish in vivo [J]. J Ethnopharmacol, 2011, doi:10.1016/j.je p.2011.08.052. [31] Alexa D, Lam IK, Lin ZX. Indirubin shows anti-angiogenic activity in an in vivo zebrafish model and an in vitro HUVEC model [J]. J Ethnopharmacol, 2010, 131: 242−247. [32] Chan JYW, Koon JCM, Liu XZ, et al. Polyphyllin D, a steroidal saponin from Paris polyphylla, inhibits endothelial cell functions in vitro and angiogenesis in zebrafish embryos in vivo [J]. J Ethnopharmacol, 2011, 137: 64−69. [33] Wang SF, Liu KC, Wang XM, et al. Effect of Xihuang pill on angiogenesis in zebrafish embryo [J]. Chin J Hosp Pharm (中 国医院药学杂志), 2010, 30: 821−824. [34] Chen XQ, Hou HR, Liu KC, et al. Effect of Xihuang pills and its decomposed formula on zebrafish embryonic angiogenesis [J]. Drugs Clin (现代药物与临床), 2011, 26: 50−54. [35] Richetti SK, Blank M, Capiotti KM, et al. Quercetin and rutin prevent scopolamine-induced memory impairment in zebrafish [J]. Behav Brain Res, 2012, 17: 10−15. [36] Yan W, Yang ZL. Dipsacus saponins effect spatial learning ability in zebrafish [J]. Acta Chin Med Pharmacol (中医药学 报), 2010, 17: 22−24. [37] Pyun JH, Kang SU, Hwang HS, et al. Epicatechin inhibits radiation-induced auditory cell death by suppression of reactive oxygen species generation [J]. Neuroscience, 2011, 199: 410−420. [38] Streisinger G, Walker C, Dower N, et al. Production of clones of homozygous diploid zebrafish (Brachydanio rerio) [J]. Nature, 1981, 291: 293−296. [39] Bowman TV, Zon LI. Swimming into the future of drug discovery: in vivo chemical screens in zebrafish [J]. ACS Chem Biol, 2010, 5: 159−161. [40] Kitambi SS, McCulloch KJ, Peterson RT, et al. Small molecule screen for compounds that affect vascular development in the zebrafish retina [J]. Mech Dev, 2009, 126: 464−477. [41] Chen QX, Zeng S. Research progress of zebrafish used in drug metabolism [J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2011, 46: 1026−1031.