牛体细胞核移植技术_董雅娟

牛 体细 胞 核移 植 技术 董雅娟1 ,柏学进1,李建栋1, M . D. Varisanga2, N . R. M tango2 ,李云龙1 ,铃木达行2 　( 1. 莱阳农学院 动物胚胎工程中心,山东 莱阳 265200; 2. 日本山口大学 家畜临床繁殖学研究室) 摘要: 对牛体细胞核移植技术中核供体细胞周期同期化处理、电融合条件及去核等进行了研究。结果表明, 血清- 饥饿组(细胞周期同期化处理组)的移核重构胚细胞融合率( 83. 3% )、卵裂率( 70% )和囊胚发育率 ( 33. 8% )与血清-选 择组对应指标间无显著性差异 ( 82. 3%、69. 2%、32. 4% , P > 0. 05) ; 但上述 2 组分别极显著高于血清-随机组 ( 64. 8%、33. 8%、4. 35% , P < 0. 01)。试验确立了场强 1. 025 kV / cm、脉冲宽度 50 Ls、连续 2 次电脉冲为最佳电融合 条件。摸索出的点击去核法, 对卵母细胞进行去核,去核成功率达 90% ,极显著高于吸引法的 68. 3% ( P < 0. 01) ; 其 囊胚发育率为 34. 1% , 显著高于吸引法的 18. 0% ( P < 0. 05) , 与挤压法( 20. 9% )相比差异不显著 (P > 0. 05)。移核 重构胚胎移植后, 产 2 头成活的体细胞克隆牛。 关键词: 牛;体细胞; 细胞周期;点击法; 核移植;电融合 中图分类号: S823. 36　　　文献标识码: A　　　文章编号: 1005-4545( 2002) 04-0347-04 　　哺乳动物体细胞克隆技术 ( mammalian somatic cell cloning)又称体细胞核移植( somatic cell nuclear transfer ) , 是 指通过特殊的人工手段, 即以显微操作、电融合、复合活性化 处理等技术为主线, 将 2 倍体的体细胞作为核供体,移入到除 去单倍体核的成熟卵母细胞中,进行体外重构、体外培养、胚 胎移植,从而达到扩繁同基因型哺乳动物种群的目的。自从 Wilmut等[ 1]的成体乳腺上皮细胞克隆绵羊“Do lly”诞生以 来, 证明了高度分化的体细胞, 在卵母细胞质中具有去分化、 重获全能性的能力,从而否定了只有早期受精卵的卵裂球具 有发育全能性的学说。在此之后,胎儿成纤维细胞的克隆绵 羊[ 2]、克隆山羊[ 3]和克隆牛[ 4] , 卵丘细胞的克隆鼠[ 5]、克隆 牛[ 6, 7] ,耳皮肤细胞的克隆牛[ 8, 9]等体细胞克隆动物也相继诞 生。尽管如此,体细胞核移植技术尚存在产仔率低、胎仔过大、 流产、死胎、畸胎等问题。 　　本研究在 M cGrath 等[ 10]于小鼠去核移核上建立的一步 法 (即在注入核供体的同时吸引除掉原有卵母细胞核 ) , Willadsen 等[11]发明的二步法吸引除核法[11]和 Shig a 等[12]建 立的一步挤压除核法的基础上, 对显微去核法进行了改进, 即 应用点击法进行去核操作。同时对细胞周期同期化、移核重构 　　收稿日期: 2002-02-25 　　基金项目:山东省重点科技攻关资助项目( J01H06) 　　作者简介:董雅娟( 1964- ) ,女,副教授,博士。 胚的电融合条件进行了研究。 1　材料与方法 1. 1　核供体细胞的准备　从屠宰场取来的胎儿皮肤上皮细 胞,用 DM SO 液在- 35℃的低温冰箱中保存 3个月。解冻后, 于含有 10% FCS 的 DM EM 细胞培养液中, 3 000 r / min 离心 5 min。清洗 2 次,去上清, 沉淀物用含有 10% FCS 的 DMEM 细胞培养液吹打分散,稀释后接种到直径 35 mm 的小平皿中 进行增殖培养。当细胞长满皿底后进行细胞传代,筛选皮肤上 皮细胞。于 2. 5 g / L 胰蛋白酶+ 0. 1%EDTA-Na2 的 Hank′s 液中静置 5 min 进行消化处理, 后用细胞培养液离心洗涤 2 次,去上清液,加培养液,吹打分散细胞块, 稀释后接种。经 5 ～6 代传代筛选培养, 在使用前,Ⅰ组进行 5～6 d 的血清-饥 饿培养, 做细胞周期同期化处理; Ⅱ组常规培养,使用时的处 理方法与细胞传代培养处理方法相同。 1. 2　卵母细胞成熟培养　将采集的卵巢从灭菌的 35℃生理 盐水中取出, 放在持有灭菌纸巾的左手上 , 选择直径 2～6 mm 的卵泡,用接有 18G 针头的 5 mL 注射器吸取卵泡液。将 抽取的含有卵母细胞的卵泡液注入 15 mL 的离心管中,置于 35℃保温水浴槽内,待沉淀后弃掉上清液,洗涤 2 次。将沉淀 物移入到中央划有方格的平皿中, 在实体显微镜下,选择有卵 丘细胞附着、细胞质亮度均一、形态良好的卵母细胞, 用成熟 Isolation and Cloning of Goat ES-like Cells from PGCs HAN Jian-yong , SANG Run-zi, SUN Guo-jie, WANG Zhi-gang , LI Jun-jie　( Col lege of A nimal Science 　and T echnology , A gricultural University of H ebei , Baod ing, H ebei 071001, China) 　　Abstract: ES-like cells of g oat w ere iso lat ed by the t raditional met hod o f iso la tion and cloning o f pr imordial g erm cells ( PGCs) and the method of co-culture o f PGCs and the cells sur r ounding the gonadal anlage, fr om day 44 fetuses of healthy lo- ca l white g oat after natur al estrus and ma ting . T hese ES-like cells wer e cultured on different feeder s. The r esults indicat ed that ES-like cells wer e both der ived fr om the tr adit ional method and co-culture in medium w ith cell g r ow th factor s. The ES- like cells on pr ima ry homolo gous( go at) embryonic fibr oblasts( PGEF ) feeder gr ew better than t ho se on pr imary mouse embry- onic fibr oblast ( PM EF ) , which were obser ved fo r 4-5 pa ssages and 3 pa ssages r espectiv ely . How ever , only one ES -like cell colony w as deriv ed by co-cultur e in medium w ithout cell g r ow th factor and w as lost after passage. 　　Key words: go at; embryonic stem cells; primordial g erm cells; ES-like cells 347中 国 兽 医 学 报　2002年 7月　第 22 卷　第 4 期　Chin J V et S ci　July 2002　Vo l. 22　No. 4 培养液洗涤 2 次后, 移入 4 孔培养皿中进行 18～24 h 的成熟 培养。卵母细胞成熟培养液采用 CR2aa[ 13] + 10% SCS( super- ovulated cow serum) + 0. 01 g / L FSH+ 100 IU / mL 青霉素+ 100 mg / L 链霉素。将成熟后的一部分卵母细胞用 0. 1%透明 质酸酶-HSOF( - Ca2+ 、- Mg 2+ )除去卵丘细胞后, 用 2 mg/ L Hoechlst 33342( Calbiochem 制)染色, 观察卵母细胞核的成 熟情况。 1. 3　受体胞质的准备　将经过成熟培养的卵母细胞,在含有 0. 1%透明质酸酶 ( Sigma 制 ) , 不含 Ca2+ 、Mg 2+ 的 HSOF 液 中, 吹打除掉卵丘细胞,裸卵以放出第 1极体的位置作为显微 操作去核的标志。采用点击去核法,见图 1。将洗净的卵母细 胞按 20 个/组移入7. 5 mg / L 细胞松弛素B( CB)的 100 LL 微 滴中, 以显微操作仪的左手油压侧控制显微固定细管, 右手侧 控制显微切割针,在第 1 极体附近, 将卵母细胞透明带切开 1/ 3。调准切口 ,使其与切割针成垂直方向, 固定卵母细胞, 用 显微针点击透明带,除去第 1 极体连同下面的一小部分细胞 质。将除掉的这一小部分细胞质, 放入载有 2. 5 mg/ L Hoechlst 33342 液滴的载玻片上, 10 min 后压片,在荧光显微 镜下观察, 发蓝色荧光的为去掉的 DNA 核。同时采用挤压法 和吸引法去核作对照。 1. 4　移核　配制 5% 蔗糖 HSOF ( - Ca2+ 、- Mg 2+ )液体, 制 成 100 LL 的微滴, 将除核后的受体胞质( 20 个/组)移入微滴 中, 静置 5 min 后,再将其移到同种显微操作液微滴 ( 100 LL ) 中, 同时将洗涤好的核供体细胞也移到此液滴中。此时, 核供 体细胞和受核卵母细胞质均处于脱水状态, 体积变小。将核供 体细胞用微细吸管经切口处注入受核卵母细胞卵周隙 ,抽出 显微移核细管,轻压透明带 ,使其切口闭合。 1. 5　电融合及复合活性化处理　将移核重构胚移入 0. 25% 蔗糖 HSOF ( - Ca2+ 、- Mg 2+ )液中,静置 5 min 使其复水,然 后用 HSOF ( - Ca2+ 、- Mg 2+ ) + 10% FCS 液洗涤 2 次, 使其 核质完全复原之后,用 ECM2001( BTX )融合仪、1 mm 间隔的 融合室、含有 0. 05%BSA 的融合液, 分别采用 0. 50、0. 75、 1. 025、1. 25、1. 50、1. 75、2. 00、2. 25、2. 50 kV / cm 的场强进 行直流电脉冲处理, 脉冲宽度 50 Ls,连续 2 次的融合条件进 行电融合。将电融合处理后的移核重构胚洗涤 2 次, 移入 HSOF( - Ca2+ 、- Mg 2+ ) + 10% FCS 液中, 放入 38. 5℃、5% CO 2、100%湿度的常压 CO 2培养箱中, 2 h 后观察融合状态。 选择融合的重构胚,置于 10 mL HSOF ( + Ca2+ 、+ Mg 2+ ) + 5 LLCa-离子载体液中, 避光下处理 4 min,然后移入 6-二甲氨 基嘌呤( 6-DMAP) SOF( + Ca2+ 、+ M g2+ )液中, 于上述环境下 培养 4 h, 进行复合活性化处理。 1. 6　移核重构胚的体外发育培养　将复合活性化处理的移 核重构胚洗涤 2 次,采用 CR2aa+ 10% FCS + 10 LL Insulin+ 100 IU / mL 青霉素+ 100 mg / L 链霉素培养液进行发育培 养, 168 h 后观察移核重构胚的囊胚发育情况。 1. 7　移核重构胚的移植　选受体母牛 5头, 每头移植移核重 构胚 2～3枚。 1. 8　统计处理　采用 t 检验。 图 1　采用点击去核法的核移植操作程序　A. 固定除去卵丘细胞 18 h 成熟培养的卵母细胞,将显微针插入第 1极体附近的透明带,切开透 明带; B. 点击透明带一点,除去第 1 极体连同其下的少量细胞质; C. 顺着切口,将核供体注入受体胞质的卵周隙; D . 经 168 h 发育培 养的移核重构胚的囊胚发育形态 2　结果 2. 1　核供体细胞同期化处理对牛移核重构胚发育的影响　 见表 1。血清-饥饿组(即细胞周期同期化处理组)的移核重构 胚的细胞融合率 ( 83. 3% )、卵裂率 ( 70% ) 和囊胚发育率 ( 33. 8% ) ,与血清-选择组对应指标间无显著性差异 ( 82. 3%、 69. 2%、32. 4% , P > 0. 05) ; 但上述 2 组分别极显著高于血 清-随机组( 64. 8%、33. 8%、4. 35% , P < 0. 01) 。 2. 2　不同电激条件对牛移核重构胚的电融合率和囊胚发育 348 中 国 兽 医 学 报　2002 年 7 月　第 22 卷　第 4 期　Chin J Vet S ci　July 2002　Vol. 22　No. 4 率的影响　见表 2。选择电场强度 1. 025、1. 25 kV / cm, 50 Ls 的电脉冲对牛移核重构胚具有最佳的激活效果。2. 25、2. 5 kV / cm , 虽然获得了较高的融合率,但囊胚发育率较低, 故试 验中均采用 1. 025 kV / cm 进行电融合。 2. 3　不同去核方法对卵母细胞去核率及囊胚发育率的影响 　见表 3。结果表明, 点击法的去核成功率最高, 并获得了较 高的囊胚发育率。 2. 4　移核重构胚的移植　移植 5头受体母牛 ,结果有 2 头妊 娠并分别于 2001 年 11 月 3 日和 6 日顺产 1 头“康康”, 剖腹 产 1 头“双双”(图 2,见封底)。 表 1　核供体细胞同期化处理对牛移核重构胚发育的影响 组　别 卵母细胞/个 去核卵及( % ) 重　　　构　　　胚融合卵及( % ) 卵裂卵及( % ) 囊胚及( %) 血清-饥饿 150* * * 132( 88. 0) 110( 83. 3) a 77( 70. 0) a 26( 33. 8) a 血清-选择* 150 130( 86. 7) 107( 82. 3) a 74( 69. 2) a 24( 32. 4) a 血清-随机* * 120 105( 87. 5) 68( 64. 8) b 23(33. 8) b 1( 4. 35) b 　　注: a、b示 P < 0. 01; * 移核时选择相对体积较小的细胞作核供体; * * 移核时随机采用任意细胞作核供体; * * * 18 h 成熟培养的卵母 细胞作核受体胞质 表 2　不同电激活条件对牛移核重构胚囊胚发育率的影响 场强/ ( kV·cm- 1) 脉冲宽 度/ Ls 处理卵 /个 融合卵 及( % ) 卵裂卵 及( %) 囊胚及 ( % ) 0. 50 50 30 8( 26. 7) 7(87. 5) 1( 14. 3) 0. 75 50 30 10( 33. 3) 8 ( 80. 0) 1( 12. 5) 1. 025 50 30 25( 83. 3) 18( 72. 0) 6( 33. 3) 1. 25 50 30 25( 83. 3) 17( 68. 0) 5( 29. 4) 1. 50 50 30 21( 70. 0) 14( 66. 7) 3( 21. 4) 1. 75 50 30 19( 63. 3) 13( 68. 4) 3( 23. 1) 2. 00 50 30 20( 66. 6) 14( 70. 0) 3( 21. 4) 2. 25 50 30 24( 80. 0) 16( 66. 6) 4( 25. 0) 2. 50 50 30 25( 83. 3) 9(36. 0) 1( 11. 1) 　　表 3　不同去核方法对牛卵母细胞的去核率及囊胚 发育率的影响 去核法 供试卵/个 去核卵及( % ) 融合卵 及( % ) 卵裂卵 及( %) 囊　胚 及( % ) 点击法 120* 108( 90. 0) b 91( 84. 4) b 63( 69. 3) 31( 34. 1) c 挤压法 120* 106( 88. 0) b 86( 81. 1) b 53( 61. 6) 18( 20. 9) ac 吸引法 120* 82( 68. 3) a 50( 61. 0) a 30( 60. 0) 9( 18. 0) a 　　注: a、b 示P < 0. 01; a、c 示P < 0. 05; * 试验重复 3次 3　讨论 　　影响细胞核移植的因素很多。本试验结果表明, 血清-饥 饿组经过 5～6 d 血清饥饿处理的核供体细胞大部分控制在 细胞周期的 G 0期(静止期) ,将其移植入 MⅡ期受体胞质所构 成的移核重构胚的电融合率、卵裂率和囊胚发育率较高, 与 Wilmut 等[1]的血清饥饿处理的细胞周期同期化和 Shig a 等[ 12]的移核时选择细胞体积相对较小的核供体细胞的移核 重构胚的囊胚发育率较高的报道相符。而不作同期化处理, 并 不加选择地进行体细胞核移植的效率极低, 不利于移核重构 胚的发育。因为血清-饥饿处理时,细胞在低营养状态下, 细胞 内的蛋白质合成和 DNA 复制均处于停止状态, 与“休眠”状态 的卵母细胞相遇, 经电脉冲处理后,如同精子入卵, 启动肌醇 脂信号通路, 使细胞质内质网中的钙释放到胞质中, 发生 Ca 2+ 波动, 诱导核浆-胞质发生细胞融合, 引起激活卵的代谢, Na+ -H+ 反向交换, 胞质的 pH 值升高, DNA 开始复制。但是, 对未进行同期化处理的核供体细胞, 在显微操作过程中,移核 时选择体积相对较小的细胞作为核供体细胞, 同样得到较高 的融合率和囊胚发育率,与血清-饥饿组间无显著差异。这一 结果与 Shig a等[ 12]的报道相符。可能体积较小的细胞处于 G0 期(静止期) , 蛋白质合成和基因活动停止。而血清-随机组在 显微操作过程中, 随机选用细胞作核供体, 导致融合率 ( 64. 8% )、分裂率 ( 33. 8% )和囊胚发育率( 4. 35% )极显著低 于血清-饥饿组和血清-选择组。因为移核时不经选择的细胞 所处的细胞周期是不同的, 既有 DNA 复制期的 S 期, 也有处 于细胞周期有丝分裂期的 M 期、G1 期( M 期结束到 S 期之间 的间隙)、G2 期( S 期结束到 M 期之间的间隙)和 G0 期(休止 期)的细胞, 而移核重构胚的DNA 复制,是受核质所处的细胞 周期阶段决定的。Co llas 等[ 14]报道, G 0/ G 1期的核移入 MⅡ期 的胞质后, 在较短的时间内就形成正常的中期赤道板与纺锤 体;而 S 期的核移入 MⅡ期胞质后,中期赤道板发生大量的异 常现象。受体胞质环境, 决定移入核的 DNA 合成,当 S 期的核 移入 MⅡ期的胞质后, DNA 的正常合成受到干扰,发育潜能 性因而降低, 从而造成血清-选择组的移核重构胚的囊胚发育 率低下。可能与 Blow 等[ 15]提出的胞质中存在一种诱导DNA 复制的特许因子( licensing factor )的假说有关。在间期的胞质 中,这一因子无法穿过核膜进入核内。只有在有丝分裂时核膜 破裂,它才得以与 DNA 结合, 在特许因子结合的多个位点上, 同时开始 DNA 复制。 本试验结果表明 , 1. 025 kV / cm 的电场强度、50 Ls、连续 2 次电脉冲的电融合条件为最佳组合, 获得了较高的融合率 和囊胚发育率。细胞膜属于正常的生物膜,是由磷脂双分子层 和镶嵌其中或漂浮在其表面的膜蛋白构成。当 2 层膜融合时, 首先膜与膜之间要克服 2 者间的静电斥力和水合力而彼此靠 近,之后 2 层膜连接,局部的脂质双层构象破坏, 膜发生融合 形成新的双层结构。电脉冲的作用, 是在瞬时的电激下,细胞 膜产生微孔,并在数秒内可以恢复,此时核供体细胞与受体胞 质膜接触,可导致核浆与胞质间形成流通桥, 进而发生核质融 合。0. 50 kV / cm 组的电融合率仅为 26. 7% ,由于相同的作用 时间里,电场强度过低不足以使磷脂双层膜产生电微孔,故细 胞融合率极低。2. 50 kV / cm 组, 虽然获得较高的电融合率 349中 国 兽 医 学 报　2002年 7月　第 22 卷　第 4 期　Chin J V et S ci　July 2002　Vo l. 22　No. 4 ( 83. 3% ) ,但卵裂率( 36. 0% )和囊胚发育率( 11. 1% )较低。虽 然过高的电场强度, 能够介导细胞融合, 但却会导致细胞的活 力降低。电融合不仅使相邻的 2 细胞的质膜融合重组, 而且核 膜在融合过程中, 通透性也发生变化。按照Blow 的假说, 这会 导致特许因子进入核中, 引起 DNA 的合成。结果处于 S 期和 G 2期的核, 又重头开始复制。这样,除 G 1期的核进行正常的 DNA 合成外, 处于 S 期、G 2期的核,在特许因子的作用下, 染 色体将变为非整倍体或多倍体。 卵母细胞的去核方法是影响去核率和囊胚发育率的重要 因素。点击法的去核率 ( 90. 0% ) 极显著地高于吸引法 ( 68. 3% , P< 0. 01) ,但与挤压法( 88. 0% )无显著差异。点击法 移核重构胚的融合率 ( 84. 4% )和囊胚发育率( 34. 1% )分别极 显著和显著地高于吸引法的融合率( 61. 0% )和囊胚发育率 ( 18. 0% ) ,与挤压法无显著差异。因为点击法去核时, 只需要 点击透明带的一点,即可除去第 1 极体连同其下面的少量细 胞质, 对细胞质的损伤较小, 只是在瞬间, 使卵母细胞发生物 理性的胞质皮质波动, 因此可获得较高的去核率和囊胚发育 率(图 1)。 哺乳动物体细胞核移植技术, 是一项极为复杂的体外重 构胚胎的过程。本试验虽然在核供体细胞的选择、成熟卵母细 胞的去核方法和电融合条件等方面取得了较好的效果,并获 得 2头体细胞克隆牛,但是还存在许多理论和实践上亟待解 决的问题。 　　 (东北农业大学秦鹏春教授在本研究完成过程中给予了热心帮 助和指导,特此表示诚挚的谢意) 参考文献: [ 1]　Wilmut I, Schnieke A E, Mcwh ir J , et al . 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T he United Graduate School of Veterinary S cience , 　Yamaguchi Univer sity , Jap an) 　　Abstract: Synchronizat ion of donor cells′cellular cy cle, fusion condition and enucleating m ethods of bov ine somatic cell nu- clear tr ansfer wer e studied. The results showed that t he per centag es of fusion ( 83. 3% ) , cleavage ( 70% ) and development to blasto cyst stag e ( 33. 8% ) in the gr oup of r econst ructed embryo s synchronized by serum depr iv ation were not significantly dif- ferent from those o f embryo s cultured in medium containing cert ain concent rat ion o f serum ( 82. 3% , 69. 2% and 32. 4% , r e- spectiv ely. P > 0. 05) , but significantly higher than those of embryos cultured in medium cont aining sto chastic concentrat ion of serum ( 64. 8% , 33. 8% and 4. 35% , respect ively . P < 0. 01) . It also show ed that the optim al fusion condit ion was tw o elect ric stimuli of 1. 025 kV / cm fo r 50 Ls. The enucleat ing rat e o f oo cytes enucleated by po int-hit method w as 90. 0% , significantly higher than that by sucking method ( 68. 3% , P < 0. 01) , the blasto cy st r ate o f o ocyt es enucleated by po int-hit method was 34. 1% , significantly higher t han t hat by sucking method ( 18. 0% , P < 0. 05) , not significantly different fr om that by squeez- ing m ethod ( 20. 9% , P > 0. 05) . A fter the blasto cy sts derived from somatic cells wer e tr ansfer red into r eceipt cow s, tw o sur- vival ca lv es w ere deliv ered. 　　Key words: bovine; somat ic cell, ; cellular cy cle ; po int-hit method; nuclear tr ansfer; fusion 350 中 国 兽 医 学 报　2002 年 7 月　第 22 卷　第 4 期　Chin J Vet S ci　July 2002　Vol. 22　No. 4