常见革兰阳性细菌鉴定与耐药检测基因芯片的临床应用

!""# 年 $ 月% % % % 第 !& 卷% 第 ! 期% % % 首 都 医 科 大 学 学 报 ’()*+,- (. /,012,- 34516,- 7+184*912: % % % ;0*< !""# =(-< !&% >(< ! ·专报道· 常见革兰阳性细菌鉴定与耐药检测基因芯片的临床应用 王雅杰? % 王% 璨!，@ % 方% 芳? % 史从宁? % 蒋% 迪! % 张国军? % 吕% 虹? % 杨华卫! % 常% 铮? 韩金利? % 赵传赞!，@ % 耿慧娟? % 唐明忠? % 王美容? % 张% 艳? % 刘亚楠? % 康熙雄?! %高华方!! （?<首都医科大学附属北京天坛医院实验诊断中心；!<博奥生物有限公司暨生物芯片北京国家工程研究中心； @<清华大学医学院） 【摘要】! 目的! 利用基因芯片技术进行常见革兰阳性细菌的细菌鉴定和耐药性检测。方法! 用生理生化鉴定和药敏纸片法确 定 $$A 份革兰阳性细菌菌株的细菌种类和耐药性，盲法进行革兰阳性细菌鉴定与耐药检测基因芯片的检测，用 BCBB ?"< " .(* D1+5(E9软件统计分析。结果! 与临床常规方法相比，耐药检测基因芯片鉴定指标的灵敏度均 F GHI，特异度均 F G&I；耐药检 测指标的灵敏度均 F G$I，特异度均 F G"I。!! 检验结果 !值均 F "< "A，基因芯片检测结果与临床常用方法检测结果差异无统 计学意义。J,00,值均 F "< #A，! 种方法一致性较好。结论! 基因芯片技术对细菌鉴定和耐药检测有一定的临床应用价值。 【关键词】! 细菌鉴定；耐药；基因芯片 【中图分类号】! K $$H< A !"# $%&’&()% *++%&(),&-’ -. /0* $"&+ .-1 $-22-’ 31)24+-5&,&6# 7)(,#1&) 89#’,&.&(),&-’ )’9 /1:; <#5&5,)’(# /#,#(,&-’ D,+L M,N14?，D,+L /,+!，@，O,+L O,+L?，BP1 /(+L+1+L?，’1,+L Q1!，RP,+L S)(N)+?，TU V(+L?， M,+L V),E41!，/P,+L RP4+L?，V,+ ’1+-1?，RP,( /P),+W,+!，@，S4+L V)1N),+?，X,+L 31+LWP(+L?， D,+L 341*(+L?，RP,+L M,+?，T1) M,+,+?，J,+L Y1Z1(+L?!，S,( V),.,+L!! （?< "#$%&#’%&( )*#+,%-*- ./,’/&，0/*1*,+ 2*#,’#, 3%-4*’#5，.#4*’#5 6/7*8#5 9,*:/&-*’(；!< .#4*’#5 0*% .%&4%&#’*%, ;#’*%,#5 <,+*,//&*,+ =/-/#&8> ./,’/& ?%& 0/*1*,+ 0*%8>*4 2/8>,%5%+(；@< @8>%%5 %? 6/7*8*,/，2-*,+>A# 9,*:/&-*’(） 【*7=!<*$!】> ?@A#(,&6#> X( 92)5: 2P4 6-1+16,- ,00-16,21(+ (. Q>; 6P10 .(* 6([[(+ S*,[\0(912184 ],624*1, 154+21.16,21(+ ,+5 5*)L *49192,+64 5424621(+< B#,"-95> $$A S*,[\0(912184 92*,1+9 E4*4 154+21.145 E12P 0P:91(-(L16,- ,+5 ]1(6P4[16,- [42P(59，,+5 E4*4 54246245 (. 5*)L *49192,+64 E12P 51..)91(+ 519^ [42P(5 .(* 9)964021]1-12: 2492< XP4+ 2P4 92*,1+9 E4*4 ]-1+5-: 54246245 E12P )91+L Q>; 6P10 .(* 154+21.16,21(+ ,+5 5*)L *49192,+64< XP4 5,2, E4*4 ,+,-:W45 )91+L BCBB ?"< " .(* D1+5(E9 9(.2E,*4< <#5:%,5 > XP4 94+9121812: (. ,-- 154+21.16,21(+ 1+54Z49 (. Q>; 6P10 E4*4 P1LP4* 2P,+ GHI，,+5 ,-- (. 2P41* 90461.1612: E4*4 P1LP4* 2P,+ G&I < XP4 94+9121812: (. ,-- 5*)L *49192,+64 1+54Z49 (. Q>; 6P10 E4*4 P1LP4* 2P,+ G$I，,+5 ,-- (. 2P41* 90461.1612: E4*4 P1LP4* 2P,+ G"I < XP4 6P1 9_),*4 2492 8,-)49 (. ,-- 1+54Z49 E4*4 P1LP4* 2P,+ "< "A，9P(E1+L 2P,2 2P4*4 E,9 +( 91L+1.16,+2 51..4*4+64 ]42E44+ Q>; 6P10 ,+5 2P4 6-1+16,- *()21+4 [42P(59< XP4 J,00, 8,-)49 (. ,-- 1+54Z49 E4*4 P1LP4* 2P,+ "< #A，1+516,21+L 2P,2 2P4 6(1+6154+64 ]42E44+ 2P4 2E( ^1+59 (. [42P(59 E,9 L((5< $-’(%:5&-’> XP4*4 19 6-1+16,- 0(24+21,- (. L4+4 6P10 246P+(-(L: .(* ],624*1, 154+21.16,21(+ ,+5 5*)L *49192,+64 5424621(+< 【CDE F? ],624*1, 154+21.16,21(+；5*)L *49192,+64；L4+4 6P10 基金项目：&H@（!""!;;!R!"??）资助项目 ! 通讯作者（/(**490(+51+L ,)2P(*） % % 随着感染性疾病发病率的升高，临床对细菌的鉴 定和耐药检测的要求越来越高［?，!］。目前从标本采集 到得出明确的细菌学鉴定和耐药检测结果往往需要 @ ‘$ 5甚至更长时间，给临床及时诊治带来了一定的 困难。目前临床上对细菌的常规检验手段包括形态学 检查、分离培养鉴定和药敏实验等，但这些方法操作繁 琐、分段进行、耗时长且准确性不十分理想。为了更好 地为临床提供细菌鉴定和耐药检测结果，本研究利用 基因芯片技术，对常见革兰阳性（S*,[ 0(912184，S a） 细菌的细菌鉴定和耐药检测进行了尝试［@］。 "! 和方法 "# "! 材料 ?）菌株来源：临床分离的 $$A 株 S a细菌，北京天 坛医院分离并保存。 !）仪器和试剂：316*(B6,+ D,-^,E,:\$" 型全自动 万方数据 第 ! 期 王雅杰等：常见革兰阳性细菌鉴定与耐药检测基因芯片的临床应用 微生物鉴定仪及 "#$ %&’(& )*+, !- 检测板购自美国 ./.0公司。药敏纸片购自北京天坛生物技术开发 公司。1 2细菌鉴定与耐药检测基因芯片试剂盒、3456 $789): -;<6=微阵列芯片扫描仪和基因芯片杂交盒 由博奥生物有限公司提供。 芯片的检测指标包括细菌鉴定和耐药检测指标。 细菌鉴定指标的选择：根据临床上细菌的分离率以及 引起临床感染的严重性，选择的细菌鉴定种类有：金 黄色葡萄球菌（$/）、凝固酶阴性葡萄球菌（%>$）、粪 肠球菌（0?@）和屎肠球菌（0?’），其中选择 -A$ BC>/ 基因作为金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、粪 肠球菌鉴定基因；而对于根据 -A$ BC>/ 基因难以与 其他细菌分开的菌种，则选择其特异基因设计探针， 如屎肠球菌，选用其特异基因 !"#$ 进行鉴定。耐药 检测指标的选择：根据临床葡萄球菌和肠球菌中常见 的抗生素耐药性的种类、严重程度和给临床治疗带来 的不利影响，选择了提示甲氧西林耐药性的 ’,7/ 基 因［D，E"、提示庆大霉素耐药性的 887（AF）8+G（!H）基 因［A"、提示大环内酯类耐药性的 %#!&、%#!$ 及 !"#& 基因进行检测。采用基因芯片微量点样技术，将检测 上述基因的特异探针与各种对照探针固定在经过醛 基修饰的玻璃基片上，检测探针各重复 D 个点，对照 探针各重复 D I J 个点，形成点间距为 D;; !’、点直径 为 -E; !’的 K L J 的微阵列。每张芯片上有 D 个同 样的微阵列，每一个微阵列可以检测一份样品。 !" #$ 方法 -）常规方法进行细菌种类及耐药性的确定：1 2 菌株 DDE 份利用生理生化鉴定以及药敏纸片法确定 细菌种类及耐药性。采用美国 ./.0 公司的 :M6 7B&$789 N8OP8Q8*6D; 型全自动微生物鉴定仪及其配 套的 "#$ %&’(& )*+, !- 检测板进行细菌鉴定。根据 美国临床实验室委员会（)G, >8RM&98O %&’’MRR,, ?&B %OM9M78O 38(&B8R&B* $R89S8BS@，>%%3$）推荐的纸片 法抗微生物药物敏感试验标准操作程序第 J 版（:!6 /J），通过纸片扩散法确定样本对各种药物的敏感性， 包括表 - 中各种药敏试验，以及纸片扩散法氯林可霉 素诱导耐药性药敏试验（距 -E!T 红霉素纸片边缘 -E I !A ’’处放置含 ! !T 氯林可霉素纸片检测，孵育 后氯林可霉素抑菌圈不出现“截平”现象，提示分离株 对其敏感；临近红霉素纸片侧氯林可霉素抑菌圈出现 “截平”现象，提示分离株对其耐药）。 !）基因芯片进行细菌菌种鉴定及耐药检测：1 2 表 !$ 药敏试验判断标准（%&&’(） )*+ !$ ,-./01023 43*2.*5. 67 .5-/ 4-48093:+:;:3< 3043（%&&’(） /9RM’M7B&(M8O SB4T .B4T 7&9R,9R&? @7BM+ U !T :M7B&&BT89M@’ .M8’,R,B &? M9GM(MRM&9 V&9, U ’’ C,@M@R89R W9R,B’,SM8O $,9@MRMX, %,?&5MRM9 Y; $/ #-K $!; %>$ #!D $!E 0B*RGB&’*7M9 -E $R8+G*O&7&77M #-Y -D I !! $!Y %GO&B&S,&5*OM97&’*7M9 ! $R8+G*O&7&77M #-D -E I !; $!- %MS&’*7M9 -; $R8+G*O&7&77M #-! -Y I -D $-E -!; 09R,B&7&774@ A Z I K $-; 菌株利用生理生化鉴定以及药敏纸片法确定细菌种 类及耐药性后，样本全部随机排列盲编。利用基因芯 片对样本进行细菌菌种鉴定及耐药检测，操作按试剂 盒说明进行，具体方法如下： 细菌核酸提取：挑取分离培养的细菌单菌落，加 入细菌核酸提取试剂管中，振荡 E ’M9，再置于 KE [ 水浴锅中水浴 E ’M9，取出，稍微离心将管壁液体收集 至管底。 核酸多重扩增：取扩增试剂混合物和扩增引物混 合物按试剂盒说明书中比例混合，再加入 !\ - 中提取 的细菌核酸 Y !3，混合均匀；同时按照试剂盒说明书 设置反应的阴阳性对照。配制好的 "%C 体系置于 "%C反应仪中反应。反应程序参照试剂盒说明书。 芯片杂交：取反应完成后的 "%C 产物 -; !3，加 入 -!\ E !3 杂交缓冲液，混合均匀后 KE [变性 E ’M9，置于冰水混合物中冷却 Y ’M9。取上述杂交液 -Y !3加入芯片点阵处，盖好杂交盒上盖，扣好芯片盒铁 扣，放入 A; [水浴锅中水浴反应 -\ E G。取出反应后 的芯片进行洗涤。使用软件扫描并判读结果。细菌 鉴定结果的判读见表 !，耐药探针与耐药基因的对应 关系见表 Y。 Y）结果分析：样本解盲后，对生化鉴定的结果、常 规药敏检测结果与芯片检测结果用 $"$$ -;\ ; ?&B NM9S&Q@软件进行比较和统计分析。 -D- 万方数据 首 都 医 科 大 学 学 报 第 !" 卷 表 !" 细菌鉴定结果的判读 #$% !" &’()*+*,- ./ %$0-*12$3 2(*,-2/20$-2., 1*4’3- #$%& ’( )*’+&, -&,./0 ’( )*’+&, 123 4 4 5 5 1$. 4 5 5 5 6#1 5 4 5 5 7#6 5 5 4 4 7(, 5 5 4 5 7(% 5 5 5 4 8.9:& ’( %;<*’’*:$=;,% 13 6#1 7(, 7(% 表 5" 耐药探针与耐药基因的对应关系 #$% 5" 6.11*47.,(2,) 1*3$-2.,48274 %*-9**, (1’) 1*424-$,0* (*-*0-2., 71.%*4 $,( (1’) 1*424-$,0* )*,*! #$%& ’( )*’+&, 6’**&,)’=9;=: :&=& %&<3 >&<3 :&=& &*%3 &*%3 :&=& &*%6 &*%6 :&=& %,*3 %,*3 :&=& $$方案