结核病的实验室诊断与结核菌耐药性检测方法研究进展

山西医药杂志2012年 11月第41卷第 11期上半月 Shanxi Med J，November 2012，Vo1．41，No．11 the First 结核病的实验室诊断与结核菌耐药性检测研究进展 内蒙古 自治区人 民医院(010017) 曹银 芳 赵建 平 丁海涛 结核菌的耐 多药 问 和人类 免疫 缺陷 病毒 (HIV)／结 核双重感染是当今全球结核病控制的主要难题之一。早 期、有效的结核病诊断，对结核、非结核分枝杆菌的鉴别，对 耐多 药结 核菌的发现 和治疗 ，是全世 界结 核病 控制工 作 的 重点。随着分子生物学技术的发展，结核病在传统诊断方 法的基础上，又提供了许多新 的途径。结核病的实验室诊 断方法有 如下几种 。 1 传统的诊断方法 1．1 涂片镜检：随机痰涂片：以清晨第一口痰为佳，取干酪 样或脓样痰于玻片中央，自然干燥固定后抗酸染色镜检。 24 h痰涂片：取深咳痰约 1o mL于消毒处理过的广 口 瓶中，加 5倍量蒸馏水，经 121℃高压蒸汽灭菌 20 rain，冷 却后 3 000 r／rain离心 30 rain，取沉淀物涂片，自然干燥固 定后抗酸染色镜检 _1]。 痰涂片作为传统的检查方法有着简便、经济的特点，但 其灵敏度和特异性达不到要求 ，尤其无法与其他分枝杆菌 相区别，但其仍没有被任何方法所取代[ 。 1．2 痰培养：①L-J培养：将经 NALC—NaOH消化液处理 过的痰标本接种于 L-J培养基 ，每天 观察细 菌生长情 况 ，若 见有可疑菌落出现经涂片抗酸染色镜检见抗酸杆菌，为阳 性。②快速培养：目前常见的分枝杆菌快速培养系统有法 国梅里埃 的 BACTEC460系统 、BacT／Alert 3D系统 和美 国 BD公司的 BACTECMGIT960系统，这些快速检测系统在 培养时间和阳性率方面均优于传统的 L—J固体培养方法， 但由于仪器和试剂 比较昂贵，在临床实验室难以广泛应 用 Ⅲ 。 结核菌培养仍是诊断结核病的金，但培养时间较 长，难以满足临床需要 ，因此人们不断在利用新的科技手段 来寻找更快速准确的方法 ，而分子生物学的出现为人们研 究 结核病带来新的思路 。 2 分子生物学诊 断方 法 2．1 血清学诊断 ：通过基因测序、高通量筛选技术等各种 方 法 ，分离 出具有诊断价值 的结 核分枝杆 菌抗 原 ，通 过多种 抗原的相关使用，或抗原特异性表位的筛选，不但可以对血 清样 本进行检测 ，还可 以对 非血 清样本 进行 检测 。血 清学 诊断方法虽然快速，但其敏感度和特异度却有待提高，因 此 ，并没有在临床广泛应用 _5]。 2．2 噬菌体生物扩增法：噬菌体生物扩增法是根据噬菌体 能感染裂解活的结核分枝杆菌，而进入宿主菌体的噬菌体 可以免受噬菌体杀灭剂灭活这一原理发明的。噬菌体生物 扩增法依然需要结核菌的前期培养，其后期操作复杂、仪器 · 1113 · 座 · 昂贵等特点无法广泛适用于临床 ，只在部分实验室做科学 研究使用l6]。 2．3 结核抗原特异性干扰素释放实验：结核抗原特异性干 扰 素释放 实验是 采用 酶联免 疫斑 点技术 (ELISpot)来 定量 检测 HIV感染者外周血单核细胞(PBMC)结核分枝杆菌特 异性 干扰素释放反应(IGRA)以诊断结核菌潜伏感染，可 减少 HIV感染人群的病死率，适于在 HIV感染人群中广 泛开展_7]。其避免了常用的TST(或者 PPD)在检测时由于 HIV感染人群免疫抑制而敏感度不高的应用限制，在临床 上有一定的推广应用价值[ 。 2．4 高效液相色谱(HPLC)诊断法：将结核分枝杆菌纯培 养后 ，经过核酸序列鉴定 ，聚合 酶链 反应 (PCR)后 用 HPI C 鉴定分枝杆 菌具 有准 确 、特异 和快 速 的特点 _9“ 。是 国际 上鉴定分枝杆菌的新的“标准”[1 ，可以作为对硝基苯甲酸 (PNB)的初筛鉴定分枝杆菌 的补充验证 。HPLC分枝菌 酸 的检测可作为处置应急和突发事件中的分枝杆菌 鉴定的优先使用方法l】 。 2．5 恒 温扩增一防污染核 酸试纸 技术 ：恒 温扩增一防污染 核 酸试纸技术是在环介导等 温(LAMP)技术 的基础 上同 时结 合封闭式防污染核酸的快速检测系统，它将病原体 DNA扩 增、核酸杂交和核酸试纸条检测技术有机地融为一体 ，同时 防止了扩增物外泄而造成 的实验室交叉污染和假阳性问 题。该技术操作简便，无需特殊设备，尤其适用于基层医疗 机构 ” 。 2．6 基 因芯 片技术 ：基 因芯 片技术 是 以 PCR和 分子 杂交 为基 础 ，通过 固定在 载体 上 的分子探 针 以检测 目的基 因的 方法，它是集生物、电子、物理等多项技术为一体的综合技 术。在微生物的检测准确性和效率方面有显著优势。但其 制备过程复杂，操作繁琐 ，难以在常规实验室开展[1 。 以上方法除痰涂片和痰培养在临床实验室常规开展 外 ，其余多为科研实验室研究使用 ，因此筛选出适合临床实 验室 诊断的最佳方法 ，仍需进 一步的研究 、评估和验证 。 3 结核病 的耐药性诊 断方法 当前对耐药结核病的分类一般分为以下几类：①单一 耐药结核病：指结核病患者排出的结核菌(MTB)对 1种抗 结核药物耐药。②多耐药结核病 ：指结核病患者排出的结 核菌对至少 2种抗结核药物耐药，但不包括同时对异烟肼 和利福平耐药者。③耐多药结核病(MDR—TB)：指结核病 患者排出的结核菌至少对包括异烟肼和利福平耐药者。④ 严重耐多药结核病(XDR—TB)：指在 MDR—TB的基础上还 对喹诺酮类药物中的 1种以及至少对卷曲霉素、卡那霉素 ·1114 · 山西医药杂志2012年 i1月第 41卷第11期上半月 Shanxi Med J，November 2012，Vo1．41，No．11 the First 和丁胺卡那 3种注射药物中的 1种产生耐药的结核病。 目前对耐药结核病的诊断大多建立在结 核病 的诊 断基 础之上 ，常见有 以下几种方法 。 3．1 常规检测方法：绝对浓度法、比例法和抗性比率法。 比例法是世界卫生组织(WHO)规定的结核分枝杆菌药物 敏感性检测的“金标准”，而绝对浓度法却由于其操作简单 为各级实验室所使用[1 。 3．2 快速液体 培养 与药 敏检测法 ：包括 BACTEC、Etest和 MB-BacT等方法 ，是建立在结 核菌培养 基础之 上 的药 敏检 测方法 。 3．3 噬菌体生物扩增还原法：同样建立在结核菌的诊断基 础之上 ，其敏感性高但特异性有待进一步研究。 3．4 基因学诊断方法：包括基因分型技术、锁定的核酸探 针实时 PCR及基因芯片技术。基因学技术对不 同的抗菌 药物有不同的敏感性和特异性 ，仍需进一步的研究和综合 评估 。 综上所述 ，结核菌 由于生长缓慢 ，使得 细菌学检测受 到 很大限制，且结核菌的复制速度与人体免疫状况相关_1 ]， 应用新的科学技术研究结核菌在人群与易感人群(如 HIV 感染患者)中的潜伏与繁殖机制有助于实验室诊断找到新 的思路和研究方向，尽管近年来出现了许多新的诊断技术， 然而对于结核病的实验室诊断及可行性方向仍然需要做进 一 步的研究和改进，以利于普通实验室的使用。 参 考 文 献 [1] 中华人民共和国卫生部医政司．全国l临床检验#操作#．3 版．南京：东南大学出版社，2006：206—208． [2]Sajduda A，Martin A，Portaele F．Hsp65 PCR—restriction a— nalysis(PRA)with capillary electroph0resis in comparison to three other methods for identification of Mycobacterium spe— cies．J Microbiol Methods，2010，80：190-197． E33 Steingart KR，Dendukuri N，Henry M，et a1．Performance of purified antigens for serodiagnosis of pulmonary tuberculo sis：a meta—analysis． Clin Vaccine Immonol，2009，16；260— 276． [4] 李静 ，桂晓红，孙丕，等．MGIT液体培养基检测分枝杆菌效果 的评价．中华检验医学杂志，2011，34(2)：111-114． [5] 沈国妙，高谦．结核病血清学诊断研究进展．中华检验医学杂 志，2011，34(2)：100—104． [6] 谭耀驹。蔡杏珊，吴幸怡，等．噬菌体生物扩增法检测痰液结 核分枝杆菌的临床应用．中华检验医学杂志，2011，34(5)： 448—450． [7] 张洁云，彭巧丽，朱秀云，等．焦磷酸测序技术检测结核分枝 杆菌四种药物耐药性．中华检验医学杂志，2011，34(2)：115— 12O． [8] Ireton GC，Greenwald R，Liang H，et a1．Identification of mycobacterium tuberculosis antigens of high ser0diagnostic value．Clin Vaccine Immunol，2010，17：1539-1547． [9]赵凤仪。王巨存，王撷秀，等．18种分枝杆菌标准菌株的分枝 菌酸指纹谱 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青藤的干燥藤茎，昧苦，性平，归肝、脾经，具有祛风湿、通经 络、镇痛之功效，用于治疗风湿痹痛、关节肿痛等。早在明 代 ，李时珍的《本草纲 目》中就有“青风藤治风湿流注，历节 鹤膝，麻痹瘙痒，损伤疮肿”的记载。盐酸青藤碱是从 中药 青风藤中提取的生物碱单体，先前实验证明青藤碱具有肯 定的镇痛镇静、抗炎、免疫抑制、抑制软骨破坏等作用 ，为植 物中很强的组织胺释放剂_1]，临床中广泛地应用于治疗类 风湿关节炎(RA)和神经痛等。RA是一种以慢性、对称性、 多关节滑膜炎为主要临床表现的全身性 自身免疫疾病，其 主要病理改变为关节滑膜明显增厚并有大量炎症细胞浸 润，血管翳生成等L2]。本文对青藤碱对 RA中免疫细胞及 滑膜病理改变的影响进行综述。 1 免疫细胞