分子杂交

nullnull转基因水稻外源基因拷贝数检测第二部分：分子杂交nullSouthern BlottingDNA抽提DNA酶切酶切产物电泳转膜烘膜预杂交探针准备及标记杂交洗膜/显影1212345679(kb)12335转基因植物拷贝数检测nullnull实验原理Hind IIIprobe酶切、转膜不同的插入拷贝产生不同大小的杂交带HHHHnullnull植物总DNA的快速少量抽提（CTAB法）null保证核酸一级结构的完整性。（30－50KB） 排除其它分子的污染 不存在对工具酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子。 其它生物大分子的污染应降到最低程度。DNA纯化的要求分离纯化核酸总的原则nullCTAB是一种非离子去污剂，CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用70－75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。CTAB法原理：null操作步骤：采取新鲜幼嫩叶片在研钵中用液态氮冷冻，研磨成细粉； 取约0.4g左右细粉于1.5ml离心管，加入1ml预热至95ºC以上的1.5CTAB，混匀； 65ºC水浴中放置30分钟，每隔5分钟上下颠倒混合数次 (DNase变性，促进内溶物释放)； 12000g离心2分钟；   吸取600l上清于新的1.5ml离心管，加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），上下颠倒混合至下层有机相呈深绿色； null 12000g离心5-10分钟； 吸取450l上清于新的1.5ml离心管，加入两倍体积95％乙醇和1/10体积3M NaAc，轻轻的上下颠倒混匀至白色絮状沉淀出现 12000g离心10分钟； 弃去上清。用500l 75％乙醇浸洗沉淀5分钟，除去离子及CTAB残余，12000g离心5分钟，弃上清,自然干燥； 加入50lTE（含20g/ml RNaseA），放于4ºC溶解； 充分溶解后，测定并调整浓度 1．尽量取材幼嫩叶片，如太老，酚类物质多，必须用10mM的β-ME处理 2．研钵预冻，粉末转管前至加CTAB前不要融化 3．24:1的苯酚氯仿抽提时动作应轻柔，氯仿的操作要在通风柜中进行 4．实验操作戴手套 思考： （1）试分析DNA降解的可能原因 （2）提高DNA产量的措施本实验注意事项： null氯仿/异戊醇（24:1）：氯仿是有机溶剂，去除植物色素，蛋白质和多糖等，异戊醇可减少蛋白质变性过程中气泡的产生，配合使用两有机溶剂，比用单一有机溶剂去除蛋白质更有效。 DNA沉淀：无水或95％的乙醇，异丙醇 3M NaAC (或10M NH4AC） 协助乙醇沉淀DNA。 75% 乙醇去除微量Na+、K+、Mg2+等阳离子及小分子量的有机分子，洗脱CTAB所用到的试剂及作用nullTE（1mM EDTA，10mM Tris.HCl pH8.0）溶解并长期保存DNA。EDTA螯合Mg2+、Ca2+等二价阳离子，从而抑制DNase等的活性。 1.5 ×CTAB CTAB 15 g 1 M Tris·Cl (pH 8.0) 75 ml 0.5 M EDTA 30 ml NaCl 61.4 g Add ddH2O to 1000 ml 外环境条件： pH8.0防止脱氨作用； 65℃ CTAB中DNase变性，促进内溶物释放； 离心时>15℃以防CTAB沉淀而降低DNA量。nullDNA纯度：吸光值检测：检测260nm、280nm吸光值，紫外分光光度计A260/A280=1.8－1.9； 1.8最佳，低于1.8说明有蛋白质，大于1.8说明有RNA。 电泳检测DNA大小：琼脂糖凝胶电泳DNA质量检测nullHoechst33258:可与纳克级的DNA结合，而几乎没有RNA亲和性，激发波长365nm，发射波长460nm。0.1µg/ml Hoechst33258适用于检测500ng/ml的DNA浓度，染料增加到1µg/ml，分析范围可延至15µg/ml，但会降低一定的灵敏度。 缺点：更易于结合AT丰富区，对DNA组成敏感。 EB:与DNA组成无关，但不如Hoechst33258敏感，且能结合RNA，激发波长302nm，发射波长590nm。DNA的定量（1）荧光检测仪1 OD＝50 g/ml DS-DNA 或 1 OD＝ 40 g/ml RNA or SS－DNA （2.）分光光度计null琼脂糖凝胶电泳 带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。 null在pH值为8.0－8.3时，核酸分子带负电，在电泳时由负极向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构像不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。实验原理：null影响DNA迁移速率的因素 DNA分子大小：迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。分子越大，迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快（超螺旋>线性DNA） 琼脂糖浓度：logU=logU0 Kr 胶浓度，U为迁移率，U0 为DNA的自由电泳迁移率，为胶浓度，Kr为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNA Agarose： 0.5%： 1-30 kb； 0.7%： 0.8-12 kb 1.2%： 0.4-7 kb； 1.5%： 0.2-3 kb. nullDNA构象：一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环。当条件变化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。 所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm 碱基组成与温度：一般影响不大4 -30 ℃null嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率，(不提倡加在电泳液中) 电泳缓冲液的组成及其离子强度：影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用1×TAE，0.5×TBE，1×TPE（均含EDTA pH8.0） null实验步骤：用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上； 调整好梳子的高度； 称取0.24 g琼脂糖于30 ml 0.5×TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至温热时倒胶； 凝胶凝固后，小心拔去梳子，撕下胶带； null将电泳样品与上样缓冲液混合后将样品依次点入加样孔中； 将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动（注意点样孔在电泳槽的负极一端）； 电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5 µg/ml的溴化乙锭（EB）中浸泡10－15 min，在紫外透射仪上观察电泳结果并照相。null电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenol blue, Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。 1. 含甘油或蔗糖，利于DNA样品沉入点样孔中 2. 含有电泳指示剂，以指示电泳的进程上样缓冲液：实验室常用核酸染料实验室常用核酸染料EB Gel red（UniRed）/Gel green Sybr green I Sybr Green II（RNA） Gold View nullEB：溴化乙锭，可嵌入DNA分子中，受紫外光激发而发出荧光，利用它可检测DNA。是诱变剂，可引起插入突变，并有中度毒性，操作时应注意防护。操作时应戴手套，尽量减少台面污染。1000×贮存液(0.5mg/mL )，使用时按1：1000稀释配制染色液。 EB的去除null有特定的识别序列 ，通常为4－6碱基的回文对称序列。 切割位点位于识别序列内的固定位置上，切割后在5’末端有磷酸基团，3’末端有羟基。 切割后形成粘性末端或平末端，前者又分为3’突出端（如PstI）和5’突出端(如EcoRI)两种 其活性发挥只需Mg2＋作辅酶。II类限制性内切酶的特点null限制酶的一个活性单位（1U）：原则上指在50µl 反应体系中，37℃下，经过1小时的反应将1 µg的DNA完全分解所需要的酶量。 限制酶的star活性：限制酶在某些极端非条件下对底物DNA的特异性可能降低，即可将与原来识别的特定DNA序列不同的碱基序列切断，这种现象叫限制酶的star活性。它的出现的频率与酶、底物及反应条件有关。 null引起星星活性的主要因素： 高浓度的甘油（>5％）； 酶过量（>100U/ µg）； 低离子强度（<25mM）； 高pH(>pH8.0)； 有机溶剂（DMSO，乙醇，乙二醇，二甲基乙酰胺； 用其他二价阳离子代替Mg2+(Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+) 不同的酶对上述因素的敏感程度不同null氯化镁、氯化钠/钾、Tris盐酸盐、 β－巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT） 牛血清白蛋白（BSA）典型的限制性内切酶作用的缓冲体系成分包括：null注意注意阅读商家提供的产品说明书，了解所使用工具酶的浓度和最适作用条件，不要用错了buffer和作用的温度等 涉及到酶的操作时,一律在冰上操作 使用移液器吸取酶时，tip头只能刚刚插入液面吸取 如果有多个反应，酶、buffer、水等应配制成mixture再分装 各种成分加完后应混匀，然后在离心机上短暂离心null检测DNA质量 测量DNA浓度 所有DNA样品的浓度调整到大致相同限制性内切酶操作准备：nullDNA (５ g) 10 l 10*buffer reaction 2 l Enzyme (10U) 1l (10U/l ) H2O 7 l 20 l酶切体系：注意：冰上操作null 1 × 5× DNA 10 l (ddH2O) Hind (10U/µl) 1 l 5 l 10×buffer 2 l 10l ddH2O 7 l 35 l Total 20 l 37°C 酶切过夜酶切体系混匀分装null电泳检测酶切效率：每样品1/10量上样，电泳检测。 若呈现均匀连续分布的一片，则酶切效果好，否则重做 。 出现切烂：DNA降解，重新提DNA； 切不动：杂质多（多糖，蛋白质，酚类，有机溶剂等），重新纯化。 酶切效果检测：nullnull总DNA酶切电泳检测nullnull酶切反应的终止加入终浓度为12.5m mol/L的EDTA以鳌合镁离子而终止酶的反应 多数酶在65°C 10分钟可被不可逆灭活，少数65°C不失活的酶在75 °C 15分钟也能失活 若酶对热具完全抗性，可通过酚抽提乙醇沉淀来纯化null造成DNA酶切不完全的主要原因有：操作不当，酶或DNA加至管壁上，反应体系没完全混合；混和后应短暂离心； 反应条件不合适，用错了缓冲液或温度不合适； 酶的活力不够 DNA不干净，反应体系中存在酶的抑制剂； nullDNA样品中抑制酶活的污染物主要有：DNA 样品中的蛋白质、多糖、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高浓度的盐等均能抑制酶切活性解决办法：增加酶作用的单位数（10-20U/µg DNA) 增大反应体积以稀释可能的抑制剂 延长反应时间 消化基因组DNA时，加入终浓度1-2.5m mol/L多聚阳离子亚精胺可改善酶切效果，其作用是结合带负电荷的污染物。 纯化DNAnull胶浓度0.7-0.8%。 胶厚度 <5mm (<250ml胶)。 胶的均一性(不同样品的迁移率一致)。 样品DNA量 指示剂量稍大，长时间指示。 点样顺序：marker，阳性对照，阴性对照，本组样品 电泳电压：大电泳槽40V，12小时，1-1.5V/cm。 电泳结束，指示剂约移动10-11cm。电泳null转膜的方式： 1. Upward Capillary Transfer (Figure 1) 2. Downward Capillary Transfer (Figure 2) 3.Simultaneous Transfer to Two Membranes 4. Electrophoretic Transfer 5.Vacuum Transfer 转膜nullUpward Capillary TransferUpward Capillary TransfernullDownward Capillary Transfernull尼龙膜：高强度，不易破损，与DNA共价结合，反复使用10次以上不破损，不丢失DNA，吸附DNA每cm2比硝酸膜多5倍，50bp有效杂交。 硝酸纤维素膜：非共价结合，易脆，易丢失DNA，<500bp的DNA无效，不适用于RFLP。    固相支持物的种类及选择：null带正电荷的尼龙膜：可用高盐离子强度（SSC），也可选择0.4N NaOH 硝酸纤维膜：高盐离子强度促进ＤＮＡ与膜结合（２０×ＳＳＣ），低盐离子强度导致小片段ＤＮＡ在转移过程中丢失, pＨ>９，ＤＮＡ不能与膜结合。转移缓冲液（transfer buffer）nullDNA转移的效率较难判断，只有在转膜结束后，通过EB染胶，及分子杂交才可以鉴别效率高低，但已无补救措施，因此，每一步应严格操作 转膜时间（duration of transfer，12hrs）取决于毛细吸附系统 胶厚度(<5mm)及浓度(<1%) ＤＮＡ大小：ＤＮＡ分子量大小决定时间长短，部分去嘌呤减小ＤＮＡ，碱转２hrs大部分结合到膜。null尼龙膜（带正电荷的）具有较大的DNA结合容量，它能够吸附变性DNA，核酸能够不可逆结合在尼龙膜上。尼龙膜两边均有同样吸附DNA功能(无论用哪边均可以经久耐用，可反复利用10次以上次），经毛细吸附作用，把DNA从凝胶上转到膜上。DNA转到膜上是复制胶上的带型，再在80-100℃真空干燥2 hrs，即可固定DNA。 null操作步骤制胶：注意琼脂糖的质量，胶的浓度，厚度（<5mm）及均一性。一般大电泳槽配制250ml 0.8%琼脂糖凝胶； 制样，点样：DNA样品中指示剂量稍多 电泳：一般1-1.5V/cm的电压， 使DNA迁移到适当距离，一般指示剂约移动10-11cm (大电泳槽：40V×12-15hrs，小电泳槽30V×4-5 hrs)（一）0.8%琼脂糖电泳null（二）转膜前的准备 每组2个合适大小的水盘 1根玻璃棒，1块铲胶板，1个切胶刀 2张搭盐桥的滤纸（13cm×35cm) 1张合适大小的尼龙膜(7.5cm×10.2cm) 2张比尼龙膜稍大的滤纸(8cm×10.8cm) 一叠5cm左右厚的吸水纸(8cm×11cm) 1大1小2块玻璃板 试剂：碱转移：0.4M NaOH, 0.2N HCl 盐转移：0.125M HCl; 1.5M NaCl/ 0.5M NaOH 1.5M NaCl/0.5M Tris; 20×SSC null盐转移1 凝胶的预处理: 电泳槽中移出凝胶置于塑料板上，用切胶板把胶切成适当大小，切去右上角（最后一个样品的最前端）作为电泳方向记号 把凝胶翻面，放入加有足量的0.125M的 HCl玻璃盘中，轻轻摇动约10min，使电泳指示剂溴酚蓝变为黄色为止（脱嘌呤）。倒去HCl溶液，加蒸馏水漂洗凝胶 倒去蒸馏水，加入足量变性缓冲液（NaOH/NaCl）淹没凝胶，轻轻摇动变性30min。倒去变性缓冲液，加蒸馏水漂洗 倒去蒸馏水，加入足量的中和缓冲液（Tris/NaCl）淹没凝胶，轻轻摇动30min中和。倒去中和液，蒸馏水漂洗 20×SSC 中平衡10 min以上 null2 另一玻璃盘中加入足量的转膜缓冲液(20×SSC)，放上洗净的玻璃板，用2-3张滤纸放在玻璃板上，两端浸入转膜液中搭制盐桥（注意滤纸之间不能有气泡） 3 在盐桥滤纸上洒些转膜液，立即将胶放在盐桥上（注意凝胶与盐桥之间不要有气泡），胶的四周用塑料片与胶紧紧相连，防止短路（即放置吸水纸与盐桥相接） 4 小心将膜覆盖在凝胶上（膜可以先用H2O浸湿，再放到20×SSC中平衡，膜与凝胶之间不要有气泡，要求一次成功，膜一旦贴到凝胶不能移动） 5 膜上放2张滤纸，滤纸上放不少于5cm厚的吸水纸，放上玻板，其上压约350g的重物，转膜过夜null转膜完毕，将膜小心取下，2×SSC 短暂漂洗，用两张滤纸包住膜，置于真空干燥箱中， 80℃固定2 h或120℃ 30min 用EB染胶以检测转移效果 （四）烘膜注意： 注意： 电泳时最好点上约5µl的地高辛标记的marker 电泳时DNA 的量不要过大，否则部分降解的DNA 片段就会与探针杂交引起背景很深 电泳时不要将EB 加到凝胶或缓冲液中 变性和中和步骤中的处理30min可以分成2×15min 任何时候操作尼龙膜时都要戴着无尘手套用镊子接触膜的边缘null转膜时严禁防短路，不要让吸水纸全部湿透，重物根据膜的大小从200g-500g 不等 面积较小的膜可直接放到胶上，如果尼龙膜较大，可以先在水中浸湿再放入20×SSC平衡， 转膜后2×SSC 短暂漂洗尼龙膜以免杂交时有背景 预杂交及杂交时保证buffer覆盖膜 如果尼龙膜要多次探测，务必保证在任何时候都不要让尼龙膜干燥null试剂1        脱嘌呤试剂（0.125M HCl）： 11ml HCl 989ml 蒸馏水混匀 （室温下可放置1个月） 2        变性缓冲液 (1.5M NaCl, 0.5M NaOH)： 87.66g NaCl 20 g NaOH 加800ml 蒸馏水溶解后，定容至1000ml. （室温下可放置3个月）    null3 中和缓冲液（1.5M NaCl, 0.5M Tris）： 87.66g NaCl 60.5 g Trizma base 800ml 蒸馏水溶解后，用HCl调pH至7.5，定容至 1000ml（室温下可放置3个月） 4   转膜缓冲液：20×SSC 88.23g Tri-sodium citrate 175.32g NaCl 加800ml 蒸馏水溶解，检查pH在7-8之间，定容至 1000ml.(室温下可放置3个月)null1组, 9组 ： 1500ml 脱嘌呤试剂（0.125M HCl）, 3 组, 11组：各2000ml变性缓冲液 (1.5M NaCl, 0.5M NaOH) 5组, 13组：2000ml 中和缓冲液（1.5M NaCl, 0.5M Tris） 7组,15组：各4000ml 转膜缓冲液 (20×SSC)Southern hybridization对于大的基因组，DNA酶切图谱凭肉眼是分辨不开的（EB染色），因为大小不等的分子在琼脂糖凝胶上呈现弥散分布，只有借助标记了放射性同位素或其它标记的特定的探针与在凝胶上（膜上）的靶DNA杂交，将DNA 带型直接显色或转换成X光片（或磷屏）上直观的带型，从而检测到目标DNA片段的位置和大小。Southern hybridizationnullnull实验原理Hind III不同的插入拷贝产生不同大小的杂交带HHHHnullnull膜上许多没有DNA分子的地方，存在DNA结合点，若不在预杂交时用一些封闭剂结合在这些位点上，加入探针后，探针DNA分子将会结合在这些位点上，导致杂交背景深。预杂交的目的是用非特异性DNA分子（鲑精DNA）及其它高分子化合物（封闭剂）将待杂交膜中的非特异性位点封闭，从而减少杂交背景。（Denharts，鲑精DNA含在杂交液中）。预杂交null5×SSC (NaCl，柠檬酸钠) 50mM PB (NaH2PO4，Na2HPO4) 5×Denhardt (多聚蔗糖，聚乙烯比咯烷酮，BSA) 2.5mmEDTA （有/无） 100ug/ml SS DNA (鲑精DNA) 0.1%SDS 10%硫酸葡聚糖（dextran sulfate）杂交液组成：null体外标记DNA或RNA的方法有多种，如：末端标记，随机引物标记，缺刻平移（nick translation），体外转录（in vitro transcription）及各类PCR等。 这些方法有的是在特定位置标记核酸（5’或3’末端），有的标记核酸分子内部的多个位点。有的产物是标记单链，有的产物是标记双链。有的方法产生一定长度的标记产物，有的得到的是长短不一的标记产物。探针的标记方法：null在DNA聚合酶的作用下，寡核苷酸通过与单链的模板配对可以启动DNA的合成。如果寡核苷酸序列是不同的（heterogeneous），引物中包含所有可能的随机序列(如6碱基引物可有46 = 4096种)，则可以与任意模板序列相配对在许多位置形成杂交链，若四种核苷酸底物中有一种是用放射性同位素标记的，可产生均匀一致高比活放射性探针；如果用DIG标记的dUTP代替dTTP，则产生DIG标记的探针。同位素标记的探针DNA 的平均长度与引物的浓度成反比。随机引物标记：nullnullThe Klenow fragment 去除了E. coli DNA polymerase I 的5’→3’的外切酶活性，具有5’→3’的聚合酶活性及3’ →5’ 外切酶活性。在pH 6.6的条件下， 3’ →5’ 外切酶活性被大大降低（有的公司提供无3’ →5’ 外切酶活性的酶） Primer：可通过用DNase I 消化牛胸腺DNA，DNA合成仪合成或直接从公司购买。同位素标记的探针DNA的平均长度与引物的浓度成反比[=k/(lnPc)1/2, Pc 是引物的浓度]，一般可产生~400-600 bp 的标记产物。随机引物标记体系：null模板DNA：一般为线状双链DNA α-32P-d CTP： (放射性比活>3000Ci/mmol) ,半衰期14.3天，最大能量1.71 Mev，最大辐射范围：空气中610cm，水中0.8cm，有机玻璃中0.76cm. 或 DIG-11-dUTP