四氯化碳诱导大鼠急性肝功能衰竭动物模型的建立

第 15卷第 11期 中国现代医学杂志 !!!!!!"#$ %& ’"$ %% 2005年 6月 ! !!!!! !!!!!!!!!!!()*+, -"./+,# "0 1"23/+ 132*4*+3 !! !-.+$ 566& 肝脏损害因损害程度不同可以有不同的临床表 现!诸如急性无黄疸肝炎"急性肝炎"慢性活动性肝 炎" 重型肝炎! 重型肝炎又可以分为急性肝功能衰 竭"亚急性肝功能衰竭"慢性肝功能衰竭# 急性肝功能衰竭起病急"进展快"并发症多"治 疗难度大"死亡率高"预后极差!是当前研究的热点 和难点$ 关于四氯化碳制造肝损伤动物模型的报道 已不鲜见! 但是四氯化碳诱导动物急性肝功能衰竭 文章编号% 1005-8982& 2005’ 11-1655-03 (论著( 四氯化碳诱导大鼠急性肝功能 衰竭动物模型的建立 赖力英 1!杨 旭 1!许向青 2!蒋永芳 1!童 敏 3 & 中南大学湘雅二医院 1.肝病研究中心!2.肾病实验室! 3.医学动物实验室!湖南 长沙 7%66%%’ 摘要% 目的 不同剂量的四氯化碳可以引起不同的肝脏损害!本试验用四氯化碳灌服制造急性肝功能衰 竭的动物模型$方法 SD 大鼠 35只!分 5组!1个对照组!4个实验组!实验组四氯化碳灌胃剂量依次为每公斤 体重 1"3"4和 5m L$ 观察动物的精神状况"食欲"运动情况"毛发"尿的颜色!检测血清谷丙转氨酶"总胆红素! 数据 !! s表示!实验组和对照组的动物存活率用 χ2检验)各组肝功能指标用单因素方差分析$ 肝脏组织 H E 染色后观察病理学改变$结果 各组间肝功能损害的差异及动物存活率的差异在统计学上均有极显著性$每公 斤体重 4m L四氯化碳组出现急性肝功能衰竭的临床表现以及肝脏病理改变$ 结论 每公斤体重 4m L四氯化 碳灌胃可用于 SD 大鼠急性肝功能衰竭模型的建立$ 关键词% 肝功能衰竭)急性)疾病模型)动物)大鼠 中图分类号% R 575.3 文献标识码% A !"#$%&’"()*+# ,- $+’)$& ),.*& /’#( 012#* (*30#’1 -0’&24* 102"*. %5 &0607* 104%,+ #*#401(&,4’.* 89: 8*;<*+=%? @9’A B.%? BC B*D+E;F*+=5? -:9’A @"+=;0,+=%? GH’A 1*+I J"# $%&’( )%*’+*’ ,’*’+(-. /’01’(2 3# )’4+(15’01 67 8’4.(696:;2 <# $+=6( 67 >0%5+9 ?!4’(%5’01@ A%0:;+ B’-60C D6*4%1+9@ /’01(+9 B6E1. F0%&’(*%1;@ /.+0:*.+@ DE0+0 G"HH""@ I#,#/.%0+K 8%"#401#9 !:%;*1#’6*" G" LMN,OP*M) ,+ ,+*Q,P Q"23P RSNT ,4.N3 T3U,NS4 0,SP./3 O< 0332S+= 4,/O"+ N3N/,4TP"/S23$ !<*#(,."" I& VW R3/3 *+4P.232 *+ NT3 3XU3/SQ3+N? ,+2 Y R3/3 S+ 3,4T =/".UZ GT3 4"+N/"P =/".U R,M 032 RSNT +"/! Q,P 0""2$ ["./ 3XU3/*Q3+N,P =/".UM R3/3 032 4,/O"+ N3N/,4TP"/*23 %? I? 7 ,+2 & Q8 U3/ \SP"=/,Q O"2< R3S=TN S+ N./+ 0/"Q NT3 0S/MN =/".U N" NT3 0"./NT =/".U$ 9+SQ,PM" MN,N.M "0 MUS/SN? ,UU3NSN3? UP,,+1&2"’,+" [332S+= 4,/O"+ N3N/,4TP"/S23 7 Q8 U3/ \SP"=/,Q O"2< R3S=TN S+ VW 4,+ 3MN,OPSMT ,+ ,+SQ,P Q"23P RSNT ,4.N3 T3U,NS4 0,SP./3$ ?*5 /,4."9 ,4.N3 T3U,NS4 0,SP./3f 2SM3,M3 Q"23Pf 4,/O"+ N3N/,4TP"/S23 收稿日期%2004-07-20 !"#$( ( 中国现代医学杂志 第 15卷 的方法尚需探讨! 本实验旨在用四氯化碳灌胃建立 SD 大鼠急性肝功能衰竭动物模型"实验结果报道如 下# 1 及方法 1.1 动物 健康 SD 大鼠 35只!体重 250~320 g!分为 5个 组!4个实验组!1个对照组!每组 7只!给予正常饮 食" 1.2 肝损伤的制造 四氯化碳$ CCl4!分析纯!湖南师大化学试剂厂! 批号 990607% 用麻油稀释后灌服& 从第 1到第 4实 验组 CCl4灌服的剂量依次为每公斤体重 1’3’4和 5 mL" 急性肝衰竭的判断参照 2000年病毒性 肝炎防治[1]制定的标准" 1.3 观察项目 1.3.1 一般情况 毛发色泽’精神状况’运动情况’ 食欲’尿液色泽’皮下出血情况" 1.3.2 血液生化指标 血清丙氨酸氨基转氨酶 ( alanineaminotransferase, ALT% ’ 总胆红素( total bilirubin,TBIL% !数据用 !! s表示 !用 SPSS 10.0 统计软件进行检验& 1.3.3 肝脏病理检查 肝脏组织用 10% 甲醛固定! 梯度乙醇脱水!二甲苯透明!常规石蜡包埋切片!HE 染色!光学树脂封片!光镜下观察肝脏组织学病理改 变& 1.4 数据处理 实验组和对照组的动物存活率用卡方( χ2% 检 验)各组肝功能指标用单因素方差分析& 2 结果 2.1 一般情况 CCl4灌胃后 12’24’36和 48h!观察毛发色泽’ 精神状况’运动情况’食欲’尿液色泽’皮下出血情 况& 每公斤体重 1 mL CCl4组在 CCl4灌胃后 24 h 左右出现活动减少’精神较差!毛发色泽’尿液颜色 无明显变化!无出血现象!之后一般情况逐渐恢复如 正常对照组!动物全部存活& 每公斤体重 3mL CCl4 组在 CCl4灌胃后 12h左右出现活动减少’ 精神差! 24h后上述症状加重!进食减少!被抓取时反抗能力 弱&毛发粗糙不整!尿色黄&48h死亡 1只!存活者精 神’食欲逐渐好转& 72 h时精神好!爱活动!死亡 1 只& 96h剩余 5只( 28% %一般情况如正常组& 每公 斤体重 5 mL CCl4组 1只大鼠在 CCl4灌胃后 0.5 h 死亡!其余在灌胃后 12h精神萎靡’个别的有躁动’ 不进食! 不饮水!3只死亡!24h内剩余 3只全部死 亡& 每公斤体重 4mL CCl4组在 CCl4灌胃后 12h左 右出现活动明显减少!精神差!24h时出现精神极度 萎靡’不饮食!被抓取时无反抗!毛发粗糙不整!尿 黄!1只有便血!3只有眼眶皮下出血!死亡 2只& 48 h死亡 3只!存活者出血情况无加重!精神稍好转& 72h精神逐渐好转!活动增加!死亡 1只& 96h存活 者( 1/7=15% % 活动能力明显好转& 动物存活率用 χ2检验!χ2=60.6667!P <0.005& 因此!不同药物剂 量组中动物存活率的差异有统计学意义& 2.2 生化指标检测 灌服 CCl4后 24 h时各组的 ALT’TBIL检测结 果见附表& 附表 各组的 ALT’TBIL检测结果 ( !! s% 注#经 ONEW AY ANONY 分析,对于 ALT#"=65.195!" <0.001) 对于 TBIL#"=18.5777!" <0.001& 2.3 病理检查 与正常对照组比较! 第 1组肝脏外观无明显异 常!镜下肝细胞有散在的空泡变性及点状坏死)第 2 组肝脏体积稍增大!显微镜下可见空泡变性及点片 状坏死! 少量中性粒细胞浸润! 肝小叶结构基本完 整)第 3组肝脏体积明显增大!个别的体积缩小!色 黄!易脆!镜下有大片状坏死!坏死区有少量中性粒 细胞浸润!大部分小叶结构消失!无纤维增生!无肝 细胞再生结节& 第 4组与第 1组改变类似& 3 讨论 肝功能衰竭的治疗是目前研究的热点和难点! 尤其是急性肝功能衰竭!治疗难度大’病死率高’预 后极差& 为了更好的研究急性肝衰竭的治疗! 建立 合适的急性肝衰竭动物模型至关重要& 目前用于肝 损伤动物模型的动物有猪’犬’鼠’兔等& 大鼠繁殖 能力强’生命力旺盛[2]’价格低廉!已经被广泛应用 组别 ALT(U/L) TBIL(μmol/L) 对照组 112.5429! 30.4449 0.2571! 0.1902 第 1组 304.4143! 78.4492 0.9429! 0.4429 第 2组 1889.280! 220.97 6.7! 4.7138 第 3组 2919.140! 854.7477 22.22! 11.4951 !"#"* * 第 11期 赖力英!等"四氯化碳诱导大鼠急性肝功能衰竭动物模型的建立 于动物实验! 因此笔者也选用了这种动物作为实验 对象# 四氯化碳是经典的药物性肝损害造模药物!它 进入机体后!在肝脏经细胞色素 P450激活!生成三 氯甲基自由基和三氯甲基过氧自由基!攻击肝脏细 胞膜上的磷脂分子! 再与膜脂质和蛋白质大分子进 行共价结合!影响蛋白质代谢!并且破坏膜结构和功 能的完整性!钙离子内流增加!最终导致肝细胞胞浆 中的可溶性酶渗出! 引起一系列血液生化指标的改 变[3!4]# 四氯化碳不同的给药方法可以制造不同的肝损 伤模型!比如急性肝损伤$慢性肝损伤$肝硬化[5~7]等 等# 急性肝损伤因损伤的程度不同又可以分为急性 肝炎$急性肝功能衰竭!笔者的目的是建立急性肝衰 竭动物模型!急性肝衰竭的判断标准参照 2000年病 毒性肝炎防治方案[1]制定的标准#CCl4用于肝损伤模 型制造时可以有几种给药途径! 包括灌胃$ 腹腔注 射$尾静脉注射$皮下注射[8]!其中 CCl4灌胃后经过 门静脉系统吸收,直接进入肝脏,模型制备理想[9!10]! 因此笔者选用了灌胃途径# 为了寻找 CCl4能引起急性肝衰竭的灌胃剂量! 笔者设立了 4个不同的 CCl4剂量实验组!4个组之 间的临床表现有差异!ALT和 TBIL的差异均有明 显的统计学意义#具体情况是!低剂量组% 每公斤体 重 1 mL$3 mL组& 有肝损害产生!但是未出现急性 肝衰竭的临床表现和病理改变’ 最大剂量组的动物 在 24h内全部死亡!未能检查肝功能!本组动物生 存时间太短!而且未形成急性肝衰竭的损害!不适合 实验性肝衰竭动物模型的建立的要求’ 第 3实验组 % 每公斤体重 4mL CCl4& 动物出现精神极度萎靡$ 被抓取时无抵抗$不饮食$尿黄!有皮肤黏膜出血现 象!肝功能损伤严重# 病理检查肝脏肿大或者缩小! 色黄$易脆!显微镜下肝细胞大片坏死$中性粒细胞 浸润$无纤维增生$无肝细胞再生!死亡率 85% !因 此本组动物的表现符合急性肝功能衰竭的诊断# 笔者的实验显示! 每公斤体重 4mL CCl4灌胃 可以建立 SD 大鼠急性肝功能衰竭动物模型# [1]中华医学会.病毒性肝炎防治方案[J].中华肝脏病杂志,2000,8(6): 324-329. 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