阿仑膦酸钠及仙灵骨葆对OPG基因敲除小鼠骨骼肌的影响_高利红

诊断学理论与实践 2013 年第 12 卷第 2 期 ·论著· T 阿仑膦酸钠及仙灵骨葆对 OPG基因 敲除小鼠骨骼肌的影响 高利红， 庞小芬， 王培霞 （上海交通大学医学院附属瑞金医院老年病科，上海 200025） [摘要] 目的：选用骨保护素（osteoprotegerin, OPG）基因敲除的骨质疏松小鼠模型，观察阿仑膦酸钠及仙灵骨葆 对其骨骼肌的作用。 方法：将 2 个月龄的 OPG 基因敲除小鼠及正常小鼠随机分为安慰剂（正常组）、阿仑膦酸钠及仙 灵骨葆组，予安慰剂或药物处理 12 周。 股直肌行 HE 染色后观察其形态，并采用实时 PCR 检测股直肌重链肌球蛋白 mRNA 的表达情况。 结果：OPG 基因敲除小鼠的股直肌单位面积骨骼肌纤维数目明显增加（+12.94%，P=0.028），肌纤 维横截面积明显减小（－23.0%，P=0.004），股直肌中肌球蛋白重链 mRNA 的表达水平显著降低（P＜0.01）；而阿仑膦酸 钠及仙灵骨葆处理后能明显减少单位面积骨骼肌纤维数目（－14.64%，P=0.022；－9.96%，P=0.014），增加骨骼肌纤维横 截面积（+24.45%，P=0.011；+23.3%，P=0.002），同时能够增加小鼠股直肌肌球蛋白重链 mRNA 的表达水平（P＜0.01）。 结论：阿仑膦酸钠及仙灵骨葆能明显改善 OPG 基因敲除所致骨质疏松小鼠骨骼肌的退化，其作用机制可能与改善骨 密度或中药的植物雌激素作用有关。 关键词：骨骼肌； 骨质疏松； 骨保护素 中图分类号：R589.5 文献标识码：A 文章编号：1671-2870（2013）02-0205-05 DOI:10.3969/j.issn.1671-2870.2013.02.020 Effect of alendronate and Xianlinggubao on skeletal muscle of osteoprotegerin gene knockout osteoporotic mice GAO Lihong, PANG Xiaofen, WANG Peixia. Department of Geriatrics, Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200025, China [Abstract] Objective To investigate the effect of alendronate (ALEN) and Xianlinggubao(XLGB) on skeletal muscle of osteoprotegerin (OPG) gene knockout mice. Methods 2-month-old wild type mice (WT) and OPG gene knockout mice (KO) were randomly divided into WT+NS (normal saline), KO+NS, KO+ALEN and KO+XLGB groups. Animals in KO+ALEN and KO+XLGB were treated with ALEN [injected subcutaneously, 0.2 mg/(kg·d)] and XLGB [injected intragastrically, 500 mg/(kg·d)] for 12 weeks, respectively. Histological morphology of rectus femoris was examined by HE staining, and mRNA of myosin heavy chain (Myh) of rectus femoris was determined by real-time PCR. Results OPG gene knockout mice had significant skeletal muscle degeneration manifested as increase in number of skeletal muscle fiber/unit area （+12.94% ，P=0.028）and reduction of cross-sectional area of skeletal muscle fiber （-23.0%，P=0.004), combined with significant decrease in mRNA expression of Myh (P＜0.01）. Both treatments of alendronate and XLGB could reduce the the number of skeletal muscle fiber/ unit area （-14.64%，P=0.022；-9.96%，P=0.014, respectively）, increase the cross-sectional area of fiber (+24.45%，P= 0.011； +23.3% ，P =0.002）, and increase the mRNA expression of Myh of rectus femoris (P ＜0.01）. Conclusions Both alendronate and XLGB could prevent the deterioration of skeletal muscle of osteoporotic mice induced by OPG gene knockout. Key s: Skeletal muscle; Osteoporosis; Osteoprotegerin 骨质疏松症、骨关节炎等骨关节疾病是老年人 群的常见病，同时随着年龄的增长，骨骼肌量、骨骼 肌质量及肌力均呈下降趋势。 最近研究表明，骨骼 肌的增龄性改变能够促使骨质疏松、骨关节炎的发 生，并可产生严重后果。 Dambacher 等 [1]发现，药物 治疗后骨密度的升高与骨折风险的下降并不成比 例关系， 原因可能是骨质疏松性骨折或脆性骨折 （尤其是髋关节发生的骨折） 受反复跌倒相关的骨 骼和非骨骼因素共同影响 。 因此，骨质疏松的治疗 和预防不仅应关注骨密度、骨强度的提高，还应重 视骨骼肌质量的改善 ， 提高肌力 。 骨保护素 （osteoprotegerin, OPG）是一种可抑制骨破坏和骨吸 收的分泌型糖蛋白，对维持骨代谢平衡具有重要作 通讯作者：庞小芬 E-mail:xiaofenpang@126.com 205· · J Diagn Concepts Pract 2013, Vol.12, No.2 基因 上游序列 下游序列 产物长度（bp） Myh1 5'-CTCTTCCCGCTTTGGTAAGTT-3' 5'-CAGGAGCATTTCGATTAGATCCG-3' 187 Myh2 5'-AGGCGGCTGAGGAGCACGTA-3' 5'-GCGGCACAAGCAGCGTTGG-3' 130 Myh4 5'-AGGACCAACTGAGTGAAGTGA-3' 5'-GGGAAAACTCGCCTGACTCTG-3' 108 Myh7 5'-ACTGTCAACACTAAGAGGGTCA-3' 5'-TTGGATGATTTGATCTTCCAGGG-3' 114 GAPDH 5'-CCTGCACCACCAACTGCTTA-3' 5'-AGGCCATGCCAGTGAGCTT-3' 178 表 1 实时 PCR 所需引物 用。 实验观察发现，OPG 基因敲除（OPG-/-）小鼠在 出生后早期即发生骨质疏松， 且随着月龄增加，骨 量丢失亦逐渐加剧，且有 50%以上的纯合子小鼠在 早期即出现动脉中层钙化[2]。 阿仑膦酸钠能显著改 善应用者的骨质疏松症状，增加其腰椎及股骨骨密 度[3]。 仙灵骨葆胶囊是我国第一个按照国际通行药 品验证和美国食品药品管理局（FDA）标准 [4]， 通过全面循证医学临床疗效及安全性验证的传统 中药。 多中心随机临床试验结果表明，中药仙灵骨 葆治疗 6 个月能够明显改善绝经后妇女的骨质疏 松，提高骨密度，且具有较高的安全性[5]。 本研究选用 OPG基因敲除骨质疏松小鼠模型， 观察抗骨质疏松 药物阿仑膦酸钠及仙灵骨葆对其骨骼肌的影响。 材料与方法 一、 材料 1. 药物： 阿仑膦酸钠购自默沙东制药有限公 司，仙灵骨葆胶囊（粉剂，成分为淫羊藿 70%、续断 10%、丹参 5%、补骨脂 5%、地黄 5%、知母 5%）购 自贵州同济堂制药有限公司。 同时，以生理盐水作 为安慰剂。 2.小鼠：选取 2个月龄的 OPG 基因敲除小鼠及 具有同等遗传背景的正常 S129 小鼠 ， 体重为 （20.0±1.2） g， 均由上海南方模式生物研究中心提 供 [生产许可证号 SCXK（沪）2003-0003，使用许可 证号 SYXK（沪）2003-0026]。 3. 试剂及仪器 ： 实时 PCR 试剂盒 SYBR誖 Premix Ex TaqTM Ⅱ （Perfect Real Time）购自宝生 物工程（大连）有限公司（Takara Code：DRR081A）。 RNA 反转录试剂盒 PrimeScript誖 RT Master Mix Perfect Real Time 购自宝生物工程（大连）有限公司 （Takara Code：DRR036A）。 实时 PCR 引物通过 Primer Primier 5.0 软件，由上海桑尼生物合成 部合成。 二、实验方法 1. 实验动物分组及处理：实验小鼠分为正常对 照+安慰剂组（WT+NS）、OPG 基因敲除+安慰剂组 （KO+NS）、OPG 基因敲除+阿仑膦酸钠组 （KO+ ALEN）、OPG 基因敲除+仙灵骨葆组 （KO+XLGB）， 每组 6只，雌雄各半。将阿仑膦酸钠片剂及仙灵骨 葆粉剂均溶于生理盐水中 ，WT+NS 组 、KO+NS 组 、KO+XLGB 组予生理盐水或仙灵骨葆溶液灌 胃 ， 剂量分别为 0.2 mL/d、500 mg/（kg·d），KO+ ALEN 组予阿仑膦酸钠溶液皮下注射 0.2 mg/（kg· d）（药物剂量分别由大鼠或人用药剂量按照体表 面积换算而得 [6-7]）。药物处理 12周后，将所有小鼠 麻醉、处死，行相关指标检测。 2. 骨骼肌形态检测： 取小鼠的左侧股直肌，放 入 4％的中性甲醛磷酸缓冲液中固定 24 h，用 70% ~100％各级酒精脱水，二甲苯透明 2 次，浸蜡，石蜡 包埋、切片(厚约 5 μm)、HE 染色，将封固好的切片 置于 100×、200×、400×倍镜下， 观察小鼠骨骼肌组 织形态变化并摄像。利用 Image Pro Plus 6.0 软件测 量骨骼肌纤维平均面积及单位面积下骨骼肌纤维 数量。 由于均采用了 200×图像，各图像均有同样放 大率及标尺，其数值结果即能进行比较分析，所以 未进行实际单位换算。 3． 髋部肌肉肌球蛋白重链（myosin heavy chain, Myh）mRNA表达：在小鼠右侧股直肌处取约 1.5 mm3 的肌肉样本，置于液氮中，随即在－80 ℃冰箱内储 存。用 TRIzol分别提取总 RNA ,然后用 PrimeScript誖 RT Master Mix 与 SYBR誖 Premix Ex TaqTM Ⅱ进 行实时 PCR反应，操作过程遵照，所需引物序 列见表 1。 扩增反应条件为 95℃ 3 s； 95℃ 5 s，60℃ 30 s，共 38 个循环； 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。 实验重复 3 次以上。 三、统计学处理 所有实验数据至少重复 3 次，全部计量资料采 用x±s表示，用 SPSS 15.0软件进行统计分析，组间比 较采用 t检验，P＜0.05时认为差异有统计学意义。 结 果 一、小鼠骨骼肌形态学变化 1.肉眼检查：各组小鼠股直肌大小、形状均正 206· · 诊断学理论与实践 2013 年第 12 卷第 2 期 常，外膜光滑，未见渗出物，表面及切面未见出血点 及坏死灶。 2.镜下观察：各组小鼠骨骼肌组织排列结构未 见异常， 间质未见明显炎性细胞浸润和血管增生。 在 100×及 400×镜下观察，可见 OPG 基因敲除小鼠 的骨骼肌纤维间隙较野生型小鼠增大，而阿仑膦酸 钠及仙灵骨葆作用后，各组小鼠骨骼肌纤维间隙减 小（见图 1）。 各组小鼠骨骼肌形态学指标比较结果如表 2 所示。 OPG基因敲除与正常组小鼠比较，镜下单位 面积内骨骼肌纤维数目明显增加 （+12.94%，P= 0.028）， 肌纤维横截面积明显减少 （－23.0%，P= 0.004），表明骨质疏松模型小鼠的骨骼肌存在较明 显的退变。阿仑膦酸钠能明显减少各组小鼠单位面 积骨骼肌纤维数目（－14.64%，P=0.022），增加骨骼 肌纤维的横截面积（+24.45%，P=0.011）；而仙灵骨 葆作用后，小鼠股直肌单位面积骨骼肌纤维数目亦 明显减少（－9.96%，P=0.014），骨骼肌纤维的横截面 积增加（+23.3%，P=0.002）。 二、骨骼肌肌球蛋白重链基因表达变化 与 WT+NS 组小鼠相比，OPG 基因敲除组小鼠 的肌球蛋白重链 mRNA 表达水平明显下调， 肌球 蛋白重链基因 Myh1 （MHC-Ⅱx）、 Myh2（MHC-Ⅱ a）、Myh4（MHC-Ⅱb）和 Myh7（MHC-Ⅰ）表达分别降 低 77.54% 、88.69% 、20.6% 、71.26% （P ＜0.01）。 与 KO+NS 组相比，KO+ALEN 组小鼠的重链肌球蛋白 基因 mRNA 表达出现明显上调，Myh1、 Myh2、Myh4 和 Myh7 基因表达分别升高 269.84% 、291.07% 、 33.44%、207.43%，（P＜0.01）。KO+XLGB组小鼠股直 肌肌球蛋白重链 mRNA 表达出现明显上调，Myh1、 Myh2、 Myh4 和 Myh7 基因分别升高 427.18% 、 755.72%、46.68%、429.29%（P＜0.01）（见图 2）。 A，a：WT+NS；B，b：KO+NS；C，c：KO+ALEN；D，d：KO+XLGB 图 1 各组小鼠骨骼肌形态学比较 组别 肌纤维数目 P 值 横截面积 P 值 WT+NS 113.33±6.43 14 664.27±890.67 KO+NS 128.00±4.0 0.028a) 11 291.18±384.10 0.004a） KO+ALEN 109.25±6.08 0.022b) 14 052.18±740.56 0.011b） KO+XLGB 115.25±2.5 0.014c) 13 922.54±257.28 0.002c) 表 2 药物作用后各实验组小鼠骨骼肌纤维的变化 （x±s，×200） a）：KO+NS 组与 WT+NS 组比较 ；b）：KO+ALEN 组与 KO+NS 组比 较；c）： KO+XLGB 组与 KO+NS 组比较 *：P＜0.01 图 2 药物治疗后各组小鼠股直肌肌球蛋白重链基因表达 207· · J Diagn Concepts Pract 2013, Vol.12, No.2 讨 论 OPG是维持骨代谢平衡的重要因子，可作为诱 饵受体竞争性地与成骨细胞/基质细胞表面表达的 NF-κB 受 体 活 化 因 子 配 体 （ligand of receptor activator of NF-κB，RANKL）结合，阻断破骨细胞前 体细胞向破骨细胞转化， 使破骨细胞数量减少，骨 吸收下降， 骨量增加。 采用置换型载体替换小鼠 OPG基因第二外显子的绝大多数序列，导致无法编 码完整的 OPG，以建立 OPG基因敲除小鼠。前期研 究结果发现，OPG 基因敲除小鼠的骨密度明显下 降[8]。OPG基因敲除小鼠表现为高转换型骨质疏松， 可模拟绝经后骨质疏松症用于抗骨质疏松症药物 筛查和药物作用机制的研究。 除性别、年龄、身高等个体差异外，局部骨骼肌 强度对骨骼强度具有重要的影响作用。在日常活动 中， 人体骨骼最大的负荷来自于骨骼肌的主动收 缩。 相关研究表明，骨骼肌强度及骨骼肌含量与其 附着骨骼的骨量呈正相关，肌力对骨结构和骨量具 有重要的影响[9]。因此，保持肌肉强度对控制后天的 骨强度和骨量具有重要意义。作为一个完整的运动 功能单位，骨骼与肌肉是紧密联系在一起的，肌力、 肌肉组织质量与骨密度间密切相关，通过改善肌肉 收缩对骨产生应力负荷，也是改善骨质疏松症的有 效方法。此外，骨骼肌强度的增加，不仅能改善患者 的平衡能力、活动的灵活性，预防跌倒，还能为骨骼 系统提供强有力的动力支持，防止骨关节系统的有 害运动损伤。骨骼肌衰弱是老年人常见的增龄性疾 病。许多研究从不同角度探索了老年性骨骼肌衰弱 的发病机制。 绝大多数研究证实，年龄的增加对老 年人骨骼肌的运动单位募集水平、结构及代谢功能 都产生了很大的影响。骨骼肌纤维蛋白含量可在一 定程度反映骨骼肌纤维面积和肌肉力量。形态学研 究指出，老年人骨骼肌肌力下降与肌肉体积萎缩呈 正相关。 肌肉的组织学检查能对肌肉的形状、功能 状态作基本了解。 本研究结果显示， 镜下观察 OPG 基因敲除小 鼠股直肌肌纤维横截面积减小，单位面积内骨骼肌 纤维数目明显增加， 骨骼肌纤维间隙明显增宽，骨 骼肌纤维肌球蛋白重链 mRNA 表达明显降低，表 明 OPG 基因敲除小鼠发生了骨骼肌的萎缩退化。 阿仑膦酸钠及仙灵骨葆药物干预后，OPG 基因敲除 引起的肌球蛋白重链基因 mRNA 的下调又出现了 上调，单位面积骨骼肌纤维数目明显减少，肌纤维 横截增加， 肌肉萎缩得到改善。 骨密度检查发现， OPG基因敲除小鼠骨密度明显下降，其股骨及腰椎 Micro-CT 三维立体成像出现明显的骨质疏松表现。 阿仑膦酸钠药物治疗后，小鼠腰椎及股骨骨密度显 著增加， 其骨小梁厚度及连续性明显增加 （P＜ 0.05），而仙灵骨葆药物处理后，小鼠骨密度无明显 增加，骨质疏松表现未见明显改善（P＞0.05）。 因此， 阿仑膦酸钠改善骨骼肌功能其潜在的机制可能与 药物治疗后骨密度的增加及骨质疏松症状改善有 关[7]。 此外，仙灵骨葆中含有黄酮类物质，具有植物 雌激素的特点，也可能与骨骼肌纤维中的雌激素受 体相关[10]。 关于抗骨质疏松药物阿仑膦酸钠及仙灵 骨葆改善小鼠骨骼肌功能的具体作用机制，仍需进 行更深入的研究以明确。 本研究仍存在不足之处，首先，实验未测定实 验小鼠肌肉收缩功能、活动能力或者步态等，这些 都是与肌肉功能、机体平衡、姿势维持、跌倒及脆性 骨折发生有较好相关性的决定性参数。 其次，本实 验样本量较小，需扩大样本量进一步实验，通过多 种指标观察抗骨质疏松药物对骨质疏松小鼠骨骼 肌的影响，评估小鼠骨骼肌功能的变化，并进一步 探讨抗骨质疏松药物阿仑膦酸钠及仙灵骨葆对 OPG 基因敲除引起的骨骼肌退化的保护性效应是 否归因于骨密度改善或药物的植物雌激素作用。 [参考文献] [1] Dambacher M, Ito M, Müller R, et al. 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Am J Physiol Endocrinol Metab, 2004,287(6):E1125-E1131. （收稿日期：2013-01-10） （本文编辑：褚敬申） 由上海市长宁区妇幼保健院主办的 “2013 年国家级妇 产科超声新进展学习班暨 ISUOG 中国学习班”将于 2013 年 7 月 26 日～27 日在上海举办。 本届学习班由上海市长宁区妇幼保健院超声科周毓青 主任负责组织[项目编号：2013-09-02-037 (国)]、国际妇产科 超声学会（ISUOG）教育培训部委员、新加坡 KK 妇儿医院杨 秀雄（George SH Yeo）教授协助，并邀请了 ISUOG 教育培训 部委员 Janathan Hyett 教授 （澳大利亚悉尼大学皇家 Alfred 王子医院）、复旦大学附属肿瘤医院常才教授、上海交通大 学附属国际和平妇幼保健院李丽蟾教授和牛建梅教授、复 旦大学附属妇产科医院严英榴教授、 上海交通大学附属第 六人民医院沈国芳教授、 上海市长宁区妇幼保健院崔爱平 主任等国内外著名的专家担任主讲。 国际妇产科超声学会（ISUOG）是国际上妇产科超声、超 声产前诊断的重要学术团体和权威机构， 不但引领妇产科 超声学术的研究和发展、承担规范的制定、召开每年的国际 会议，还为全球的同行提供教育和培训。 项目负责人与国际 及国内学界均建立了长期的、良好的合作关系。 此次很荣幸 又得到了 ISUOG 的大力支持， 再次请到了该学会的专家前 来授课。 本项目重点介绍早孕期筛查的新指标及质量控制、单胎 及双胎在早孕期的咨询与处理、 早孕期胎儿心脏及中枢神 经系统筛查、中孕期超声筛查、胎儿中枢神经系统超声基础 及畸形诊断、胎儿骨骼系统畸形的超声诊断，同时也将针对 目前产前诊断中的医疗安全问题、 超声造影在生殖领域的 应用、三维超声在妇科及子宫畸形诊断中的应用、子宫肉瘤 的鉴别诊断等难点热点问题作专题报告。 主办单位： 上海市长宁区妇幼保健院于 2012 年 5 月承 办 ISUOG 授权学习班暨国家级继续教育学习班 《第十二届 妇产科超声新进展》[项目编号：2012-09-02-005(国)]。 注意事项： 一、 办班时间及地点 1. 报到时间：2013 年 7 月 25 日 8∶30～16∶00。2.办班时间：2013年 7月 26日～7月 27日。3.办班 及注册地点：上海市中山西路 555号（绿洲大厦商务酒店）。 二、学习班收费：800 元/人（含会务费、资料费、国家级继 续教育 I 类学分证书、ISUOG 认证证书），开具发票。 不含差 旅费、食宿费。 三、住宿：6 月 30 日之前报名的学员，主办单位可代为 安排住宿。 四、日程安排：以学习班日程表为准。 五、学分认定：按规定完成学习后，授予国家级继续 教育 I 类学分 6 分及 ISUOG 认证证书。 六、报名方式 1. 有意参加者请填写“报名回执表”（至 网站下载）或 E-mail 回执，于 2013 年 6 月 30 日之前邮寄至 上海市武夷路 773 号长宁区妇幼保健院（200051）科教科刘 瑞林、 刘英姿收。 回执中请务必填写电话号码和 E-mail 地 址，报到通知将以 E-mail 形式发出 ！如开班前一周仍未接 到报到通知 E-mail，请尽快电话联系。 2. 7 月 25 日周四全 天免费开放科室参观与示教，有意者请与刘瑞林老师联系。 七、 其他联系方式： 传真：021- 62287785； 电话：021- 62287785。 E-mail：yiwukecn@163.com（标题请注明：超声学 习班报名）。 下载会议通知网站 ：http://www.isoug.org，http:// www.shcnfb.com。 2013年妇产科超声新进展学习班暨 ISUOG中国学习班国家级继续医学教育项目 影像医学学科/超声诊断学国家级 I类学分(6分)招生通知（第一轮） !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ·简讯· 209· ·