4种美白剂对B_16细胞内酪氨酸酶活性抑制的研究

文章编号: 1005- 8486(2006)01- 0010- 03 �论著� 4种美白剂对 B- 16细胞内酪氨酸酶活性抑制的研究 李 � 玲1, � 宋伟民2, � 周 � 华2 ( 1� 宁夏医学院公共卫生学院,银川 � 750004; � 2� 复旦大学公共卫生学院,上海 � 200032) 摘要 :目的 � 探讨 4 种常用皮肤美白剂(熊果苷、曲酸衍生物、BL- 99 和氢醌酯)对皮肤黑素细胞内酪氨酸酶 活性的抑制作用。方法 � 选用 B- 16 小鼠黑素瘤细胞株,分别加入不同剂量美白剂( BL- 99和曲酸衍生物的 实验终浓度分别为 0�5、1�0、5�0、10�0、50�0 �g/ mL; 熊果苷为 10、30、50、70、100 �g/ mL; 氢醌酯为 0�1、0�5、1�0、 5�0、10�0 �g/ mL) 3d 后,采用台盼蓝排斥法计数活细胞数,参照 Hideya Ando等的方法测定酪氨酸酶活性, 探讨 美白剂对培养细胞内酪氨酸酶活性的影响。结果 � 4 种美白剂均可抑制 B- 16 细胞生长,以氢醌酯对细胞生 长数量的作用最大,熊果苷对细胞生长的抑制作用最弱。熊果苷对酪氨酸酶活性具有抑制作用; 氢醌酯虽可 导致 B- 16细胞的酪氨酸酶活性呈下降趋势,但与对照组相比, 差异无统计学意义( P > 0�05) ; 曲酸衍生物和 BL- 99 均可致 B16 细胞中酪氨酸酶活性呈波动性变化。结论 � 4 种皮肤美白剂中除了熊果苷对酪氨酸酶的 活性具有抑制作用外,其它 3 种美白剂均对酪氨酸酶抑制不明显, 提示美白剂的美白机制是多方面的,可能不 仅仅与酪氨酸酶的活性有关。 关键词:皮肤美白剂; 皮肤黑素瘤细胞;酪氨酸酶活性 中图分类号:R114� � � 文献标识码:A 收稿日期: 2005- 05- 20 作者简介:李玲( 1973- ) ,女( 回族) ,宁夏人,讲师, 硕士,从事环境 卫生教学工作。 � � 随着生活水平和审美标准的提高, 光洁和白皙的肌肤 越来越被东方女性所推崇, 而欧洲消费者主要利用功能性 美白化妆品来减轻和消除老年斑、黄褐斑等色素沉积。因 此,近年来皮肤美白类化妆品市场日趋活跃, 产品销售与日 俱增,已成为护肤类化妆品的主流品种之一。美白剂作为 美白化妆品的功能性原料因此受到极大关注, 它的开发和 应用研究不断深入,市场上新的功效高、易于配伍的原料不 断推出。皮肤美白剂种类很多, 其中一大类是通过抑制酪 氨酸酶活性或阻断从酪氨酸生成黑素的氧化反应, 从而减 少黑素的生成而达到美白皮肤的效果。因此该类美白剂对 酪氨酸酶活性抑制率的高低成为衡量该类物质美白效果的 重要指标[1]。本文通过建立体外培养 B- 16 黑素瘤细胞模 型,研究几种常用皮肤美白剂对细胞内酪氨酸酶的作用及 其对细胞黑素生成的影响, 为化妆品添加美白剂提供实验 依据。 1 � 材料与方法 1�1 � 试剂与仪器 1�1� 1� 试剂: 0�5%脱氧胆酸钠溶液; 0�1% L- DOPA 溶液 (每次用 0�1M磷酸缓冲液新鲜配置) ; 0�25%胰酶溶液; 1N 氢氧化钠溶液; 1640 培养液; 熊果苷溶液、BL- 99 溶液、曲 酸衍生物溶液和氢醌酯溶(北京贝丽莱日用化工厂赠送)。 1�1� 2� 仪器: 普通离心机( 1000~ 10000rpm/ min) ; 分光光度 计(尤尼柯上海仪器有限公司) ; 37 电热恒温水浴锅。 1�2 � 方法 1�2�1 � 细胞培养: B- 16 黑素瘤细胞株购于上海市中科院 细胞所。待细胞生长至近融合状态, 经 0�25% 胰蛋白酶消 化,用含有 10% 小牛血清的 RPMI 1640 培养液传代, 置于 CO2培养箱 37 , 5% CO2饱和湿度环境中进行培养。每一 次实验 取自同一 传代细胞, 初始接种 细胞浓度 为 5000 个/ cm2左右。细胞接种 24h 后, 用添加受试美白剂的 新鲜培养基换液 1 次(各设 5 个剂量组: BL- 99 和曲酸衍 生物的实验终浓度分别为 0� 5、1�0、5�0、10� 0、50�0 �g/ mL; 熊果苷终浓度为 10、30、50、70、100�g/ mL ; 氢醌酯终浓度为 0�1、0�5、1� 0、5�0、10�0 �g/ mL)。继续孵育 72h后收获细胞, 用台盼蓝排斥法计数活细胞数后进行酪氨酸酶活性测定。 1�2�2 � 酪氨酸酶活性的测定[ 2] :将培养到期的各组细胞经 0�25%胰蛋白酶消化离心后,用 PBS 缓冲液清洗两次,再用 PBS缓冲液将沉淀细胞吹打成悬液记数后备用。 酪氨酸酶活性是根据将多巴氧化为多巴醌的速度来确 定的。参照 Ando等报道的方法[ 2] , 进行酪氨酸酶活性的测 定。取备用细胞悬液加 PBS 缓冲液, 调节细胞密度至 105/ mL 左右, 各吸取 1mL 细胞悬液分别置于 3 个平行管 中, 离心后弃去上清液, 加入1mL 0� 5%脱氧胆酸钠溶液, 并 充分振摇使细胞溶解, 制备含有活性酪氨酸酶的细胞裂解 物。将试管置于 0 15min, 再置于 37 10min, 即刻加入 0�1% L- DOPA溶液, 振摇后在分光光度计 475nm 波长, 分 别于 0min和 10min时读取吸光度值, 计算两个时段吸光度 值的差值, 并除以细胞数。酪氨酸酶活性用处理组 A475值 占空白对照组A475值的百分率来示。 1�3 � 统计学 �10� 宁夏医学院学报 Journal of Ningxia Medical College 第 28卷 � 1期 � 2006年 2月 实验结果以 �x ! s 表示,两组间比较采用 t 检验, 使用 Excel软件对数据进行统计分析。 2 � 结果 2�1 � 4种美白剂对 B- 16细胞数量的影响 � 由表 1 可见, 4 种美白剂均可明显抑制细胞生长, 以氢醌酯对细胞生长数 量的作用最大,浓度为 10 �g/ mL时已基本上看不到存活细 胞。熊果苷对细胞生长的抑制作用最弱, 浓度大于 70 �g/ mL才可明显抑制细胞生长。 表 1� 4种美白剂对 B- 16细胞生长的影响(细胞数量∀ 104) 组别(�g/mL) 数量 曲酸衍生物 BL- 99 熊果苷 氢醌酯 对照组 3 17�25 ! 0�5 17�75 ! 0�62 17�75 ! 0�48 17�25 ! 0�5 0�5( 10/0�1) 3 13�75 ! 0�96 16�25 ! 3�30 13�00 ! 0�82 9�75 ! 0�96* * 1�0( 30/0�5) 3 11�75 ! 3�78 15�75 ! 3�09 11�50 ! 2�08 5�00 ! 0�82* * 5�0( 50/1�0) 3 4�75 ! 1�26* * 7�25 ! 1�5* 9�50 ! 1�29 3�50 ! 1�29* * 10�0( 70/ 5�0) 3 1�75 ! 0�96* * 2�75 ! 0�5* 7�00 ! 1�83* 1�25 ! 0�50* * 50�0( 100/ 10�0) 3 1�25 ! 0�50* * 1�00 ! 0�001* * 6�00 ! 1�41* 0�25 ! 0�50* * � 括号内浓度分别为熊果苷和氢醌酯实验浓度;与对照组相比* P< 0�05, * * P < 0�01 2�2 � 4种美白剂对 B- 16细胞内酪氨酸酶活性的影响 从表 2可见, 熊果苷对酪氨酸酶活性具有显著抑制作 用;氢醌酯虽可导致 B- 16 细胞的酪氨酸酶活性呈下降趋 势, 但与对照组相比, 差异无统计学意义( P < 0�05) ; 曲酸 衍生物和 BL- 99 均可致 B- 16 细胞中酪氨酸酶活性呈波 动性变化。 表 2� 4种美白剂对 B- 16细胞酪氨酸酶活性的影响(�x ! s , % ) 组别(�g/mL) 数量 曲酸衍生物 BL- 99 熊果苷 氢醌酯 对照组 3 100�00 100�00 100�00 100�00 0�5( 10/0�1) 3 69�23 ! 0�13 95�16 ! 0�04 101�71 ! 0�05 103�26 ! 0�13 1�0( 30/0�5) 3 84�38 ! 0�13 83�04 ! 0�16 97�44 ! 0�32 95�24 ! 0�17 5�0( 50/1�0) 3 115�03 ! 0�21 141�44 ! 0�02 57�27 ! 0�02* 78�28 ! 0�19 10�0( 70/ 5�0) 3 58�33 ! 0�46 34�54 ! 0�05 81�19 ! 0�01* 99�00 ! 0�09 50�0( 100/ 10�0) 3 79�86 ! 0�06 54�22 ! 0�04 47�44 ! 0�19* 59�94 ! 0�26 � 括号内浓度分别为熊果苷和氢醌酯实验浓度;与对照组相比* P< 0�05 3 � 讨论 B- 16黑素瘤细胞是由正常黑素细胞突变所致, 其生 化代谢与正常黑素细胞相似,在人体皮肤黑素细胞的原代 培养较为复杂的情况下, B- 16 黑素瘤细胞成为医药部门 进行色素病变研究广泛使用的细胞 ,国外化妆品生产企业 的科研部门,在筛选美白剂的过程中, 广泛采用该细胞作为 化妆品美白剂功效测定的受试细胞。这种利用离体细胞培 养来筛选美白剂的细胞生物学方法,比体外生化法更直观, 同时较人体实验更快速、简便, 已成为美白化妆品添加剂功 效的重要手段。为此我们采用 B- 16 黑素瘤细胞, 对 几种常用皮肤美白剂的功效进行检测, 以了解几种美白剂 对黑素合成的影响,为我国美白剂的研究生产以及功效评 价程序的建立提供一些参考信息。 从 4种美白剂作用于 B- 16 黑素瘤细胞的结果显示 (见表 1) :曲酸衍生物、BL - 99、熊果苷和氢醌酯可干扰细 胞增殖,使细胞增殖受到不同程度的抑制。随着剂量的增 加,细胞数量明显减少。 黑素的生物合成机制是人们研究的重点,同时也是美 白剂开发必须认识的。人们对黑素合成调控的认识经历了 酪氨酸酶单酶学说到多酶学说, 目前又发现酪氨酸酶呈现 多态性[3] ,至今没有定论。从本次实验结果可以看出, 熊果 苷对酪氨酸酶活性具有抑制作用,但没有明显的剂量 # # # 效应关系,提示其在发挥美白作用的过程中, 除了通过抑制 酪氨酸酶活性外,可能还影响其它酶或途径, 而调节黑素合 成。曲酸衍生物、BL- 99对细胞中的酪氨酸酶活性抑制不 明显, 随剂量变化细胞内酪氨酸酶活性呈现波动性变化, 表 明这两种美白剂抑制黑素合成可能与影响黑素合成中的多 个酶有关, 也可能通过其它途径干预细胞黑素合成功能。 Seiberg[4]等报道熊果苷对酪氨酸酶有竞争性抑制作用, 认 为熊果苷是在转录后阶段抑制酪氨酸酶的活性。Nakajima 等研究发现 ,熊果苷抑制黑素细胞合成黑素, 对细胞酪氨酸 酶活性没有明显影响, 提出熊果苷可能是通过非酪氨酸酶 途径抑制黑素合成[ 5] ,显示出美白剂作用机制的复杂性。 氢醌又名对苯二酚,是一种传统且有效的美白祛斑成 分。但氢醌性质极不稳定,很容易在空气中氧化变色, 且有 引起皮肤永久性白斑的报道[6] ,因此在皮肤美白剂中已禁 止使用, 仅在临床治疗色素沉着性疾病时仍可使用[ 7]。尽 管氢醌作为一种皮肤脱色剂在临床使用已久,但其确切的 脱色机制至今仍不清楚。一种观点认为氢醌作为酪氨酸酶 的底物较酪氨酸本身更为合适, 其脱色机制可能与竞争抑 制酪氨酸酶活性有关; 另一观点认为氢醌脱色实质上是一 酪氨酸酶介导的细胞毒作用。氢醌分子易扩散进入黑素细 胞的黑素小体,阻断黑素生成途径的一个或多个步骤, 同时 氢醌在酪氨酸酶作用下被氧化生成有毒性的半醌基物质, 后者使细胞膜脂质发生过氧化,破坏细胞膜性结构, 最终导 致细胞死亡[ 8]。氢醌酯的有效成分是氢醌, 但性质比氢醌 稳定, 本实验结果显示氢醌酯在低浓度时下调酪氨酸酶活 性和黑素含量,高浓度时则呈现明显细胞毒性, 表明不同浓 度的氢醌酯其脱色机制可能不同, 低浓度时以抑制酪氨酸 酶活性为主 ,高浓度时主要是细胞毒作用。 �11�1 期 李玲,等. 4种美白剂对 B- 16细胞内酪氨酸酶活性抑制的研究 本次研究结果显示, 4 种皮肤美白剂中除了熊果苷对 调控黑素合成的关键酶之一 # # # 酪氨酸酶的活性具有抑制 作用外,其它 3 种美白剂均对酪氨酸酶抑制不明显,提示影 响黑素合成的因素是多方面的, 可能不仅与酪氨酸酶活性 有关。 参考文献: [ 1] � Del Giudice P, Yves P� Thewidespread use of skin lighten ing creams in Senegal: a persistent public health problem in west Africa[ J]� Int J Dermatol, 2002, 41( 2) : 69- 72� [ 2] � Ando H, Itoh A, Mishima Y, et al� Correlation between the number of melanosomes, tyrosinase mRNA levels, and tyrosinase activity in cultured murine melanoma cells in re sponse to various melanogenesis regulatory agents[ J]� J Cell Physiol, 1995, 163: 608 - 614� [ 3] � Phillips J, Grwkrodger DJ, Caddy CM , et al� Keratinocytes suppress TRP - 1 expression and reduce cell number of co- cultured melanocytes- inplications for grafting of patients with vitiligo[ J] � Pigment Cell Res, 2001, 14( 2) : 116- 125� [ 4] � Seiberg M, Paine C, Sharlow E, et al� The protease- acti vated receptor 2 regulates pigmentation via keratinocyte- melanocyte interactions[ J]� Exp Cell Res, 2000, 254 ( 1) : 25- 32� [ 5] � Nakajima M, Shinoda I, Fukuwatari Y, et al� Arbutin in creases the pigmentation of cultured human melanocytes through mechanisms other than the induction of tyrosinase activity[ J]� Pigment Cell Res, 1998, 11 ( 1) : 12- 17� [ 6] � 雷铁池, 朱文元� 皮肤脱色剂的分子机制及其相关 研究[ J] � 国外医学皮肤性病学分册, 2001, 31( 2) : 45- 45� [ 7] � 鲁严, 朱文元� 黄褐斑的现代诊治 [ J] � 中华皮肤科 杂志, 2002, 35( 4) : 321- 323� [ 8] � Grimes PE� Melasma etiologic and therapeutic considera tions[ J] � Arch Dermatol, 1995, 131( 12) : 1453- 1457� (责任编辑:路锦绣) Inhibitory Activity of Four Lighteners Against Tyrosinase in B- 16 cells LI Ling 1, SONG Wei - min2, ZHOU Hua 2 ( 1�School of Public Health, Ningxia Medical College, Yinchuan 750004; 2� School of Public Health, Fudan University, Shanghai 200032) Abstract : Objective � To investigate the inhibition of tyrosinase activity in murine melenoma cells by four skin lighteners, such as arbutin, kojic acid derivatives, BL - 99 and hydroquinone dipropionate� Methods � After B- 16 murine melanoma cells were treated with BL- 99 and kojic acid derivatives in contents 0�5, 1�0, 5�0, 10�0, 50�0�g/ mL, arbutin 10, 30, 50, 70, 100 �g/ mL in contents, hydroquinone dipropionate 0�1, 0�5, 1�0, 5�0, 10�0 �g/ mL in contents respectively , for three days, trypan blue exclusion test was used to determine the condi tion of cell growth, Hideya Ando technique were applied to measure the tyrosinase activity and determine the ef fect of the four skin lighteners in cultured murine melenoma cells� Results � The four skin lighteners signif icant ly inhibited the melanoma cell proliferat ion, hydroquinone dipropionate had the strongest effect, arbutin had the weakest ef fect� Arbut in inhibited the tyrosinase activity of cultured B- 16 murine melanoma cells� Although hy droquinone dipropionate can lead the tyrosinase activity to the downward trend, compared with the control group, there was no difference� Both kojic acid derivatives and BL - 99 can lead the tyrosinase act ivity to undulated changes� Conclusion� Arbutin inhibited the tyrosinase activity of cultured B- 16 murine melanoma cells, but hydroquinone dipropionate, kojic acid derivatives and BL- 99 couldn∃ t inhibit the tyrosinase activity signif icant ly. It hints the mechanism of the four lighteners are complex, may be not only related to the inhibition of tyrosi nase activity� Key words: skin lighteners; skin melamona cell; tyrosinase activity �12� 宁夏医学院学报 28 卷