SNT 0174-2011 出口食品小肠结肠炎耶尔森氏菌检验方法

书书书 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛犖／犜０１７４—２０１１ 代替ＳＮ０１７４—１９９２ 出口食品小肠结肠炎耶尔森氏菌 检验方法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犢犲狉狊犻狀犻犪犲狀狋犲狉狅犮狅犾犻狋犻犮犪犻狀犳狅狅犱犳狅狉犲狓狆狅狉狋 ２０１１０５３１发布 ２０１１１２０１实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局 发 布 书书书 前　　言 　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。 本标准代替ＳＮ０１７４—１９９２《出口食品小肠结肠炎耶尔森氏菌检验方法》。 本标准与ＳＮ０１７４—１９９２相比，主要技术变化如下： ———适用范围由出口冷冻和生鲜的猪肉、猪舌、鸡肉、虾和虾仁扩大至食品； ———样品增菌培养方法：由改良磷酸盐缓冲液培养、氢氧化钾处理、改良酵母浸汁孟加拉红肉汤培 养改为蛋白胨山梨醇胆盐肉汤及氯苯酚替卡西林氯酸钾肉汤分别培养； ———分离培养：使用的培养基由含吐温８０的亚硫酸铋琼脂平板及麦康凯琼脂平板改为头孢磺啶 氯苯酚新生霉素琼脂和沙门氏菌志贺氏菌琼脂（含脱氧胆盐氯化钠）； ———鉴定：对小肠结肠炎耶尔森氏菌鉴定的生化试验增加了吲哚、氧化酶、海藻糖、木糖及吐温酯酶 试验，去除了山梨醇、Ｌ阿拉伯糖试验； ———在附录Ｂ、Ｃ、Ｄ中增加小肠结肠炎耶尔森氏菌与其他菌的生化区别、小肠结肠炎耶尔森菌生物 型、致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌生化检测方法。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：张霞、张宏伟、张海英、刘培、吴冬雪、高旗利、郑文杰、曲鹏。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： ———ＺＢＸ０４００３—１９８６，ＳＮ０１７４—１９９２。 Ⅰ 犛犖／犜０１７４—２０１１ 出口食品小肠结肠炎耶尔森氏菌 检验方法 １　范围 本标准了食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的检验方法。 本标准适用于食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌检验，动物饲料及食品生产和处理领域的环境样本可 参照使用。 ２　性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 ＧＢ４７８９．１　食品安全国家标准　食品卫生微生物学检验　总则 ＧＢ４７８９．２　食品安全国家标准　食品卫生微生物学检验　菌落总数测定 ＧＢ／Ｔ４７８９．１７　食品卫生微生物学检验　肉与肉制品检验 ＧＢ４７８９．１８　食品安全国家标准　食品卫生微生物学检验　乳与乳制品检验 ＧＢ／Ｔ４７８９．１９　食品卫生微生物学检验　蛋与蛋制品检验 ＧＢ／Ｔ４７８９．２０　食品卫生微生物学检验　水产食品检验 ＧＢ／Ｔ４７８９．２２　食品卫生微生物学检验　调味品检验 ＧＢ／Ｔ４７８９．２４　食品卫生微生物学检验　糖果、糕点、蜜饯检验 ＳＮ／Ｔ１５３８．１　培养基制备指南　第１部分：实验室培养基制备质量保证通则 ＳＮ／Ｔ１５３８．２　培养基制备指南　第２部分：培养基性能测试实用指南 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 ３．１ 致病性小肠结肠炎耶尔森菌　狆狉犲狊狌犿狆狋犻狏犲狆犪狋犺狅犵犲狀犻犮犢犲狉狊犻狀犻犪犲狀狋犲狉狅犮狅犾犻狋犻犮犪 按照本标准进行检测，在固体选择性培养基上形成典型菌落，并具有致病性的生化特性的嗜冷细菌 推定为致病性小肠结肠炎耶尔森菌。 ３．２ 致病性小肠结肠炎耶尔森菌的检测　狆狉犲狊狌犿狆狋犻狏犲狆犪狋犺狅犵犲狀犻犮犢犲狉狊犻狀犻犪犲狀狋犲狉狅犮狅犾犻狋犻犮犪 按照本标准对样品进行检测，以确定样品中是否存在致病性小肠结肠炎耶尔森菌的检测步骤。 ４　设备和 ４．１　培养箱：２２℃±１℃，２５℃±１℃，３０℃±１℃，３７℃±１℃。 ４．２　水浴箱或培养箱：２２℃±１℃，２４℃±２℃，２５℃±１℃，３０℃±１℃最好有搅拌功能。 ４．３　吸管：１０ｍＬ及１ｍＬ，分刻度０．１ｍＬ。 １ 犛犖／犜０１７４—２０１１ ４．４　试管：１８ｍｍ×１８０ｍｍ，９ｍｍ×１８０ｍｍ，１２ｍｍ×５０ｍｍ。 ４．５　锥形瓶或烧瓶。 ４．６　灭菌平皿：直径９０ｍｍ～１００ｍｍ。 ４．７　接种环：３ｍｍ直径。 ４．８　ｐＨ计：２５℃精确度在±０．１ｐＨ单位。 ４．９　照明：斜射照明。 ４．１０　放大镜或立体显微镜。 ４．１１　蠕动搅拌机。 ５　培养基和试剂 除另有规定外，所用试剂均为纯，水为蒸馏水。为保证培养基的质量，应按ＳＮ／Ｔ１５３８．１和 ＳＮ／Ｔ１５３８．２进行培养基的制备与性能测试。 ５．１　蛋白胨山梨醇胆盐（ＰＳＢ）肉汤：见Ａ．１。 ５．２　氯苯酚替卡西林氯酸钾（ＩＴＣ）肉汤：见Ａ．２。 ５．３　头孢磺啶氯苯酚新生霉素（ＣＩＮ）琼脂：见Ａ．３。 ５．４　沙门氏菌志贺氏菌琼脂（含脱氧胆盐氯化钠）（ＳＳＤＣ琼脂）：见Ａ．４。 ５．５　营养琼脂：见Ａ．５。 ５．６　尿素吲哚培养基：见Ａ．６。 ５．７　科瓦奇试剂：见Ａ．７。 ５．８　双糖铁琼脂：见Ａ．８。 ５．９　氧化酶试剂：见Ａ．９。 ５．１０　赖氨酸脱羧培养基：见Ａ．１０。 ５．１１　鸟氨酸脱羧培养基：见Ａ．１１。 ５．１２　糖类发酵培养基：见Ａ．１２。 ５．１３　西蒙氏柠檬酸盐培养基：见Ａ．１３。 ５．１４　吐温酯酶培养基：见Ａ．１４。 ５．１５　胆汁七叶苷琼脂：见Ａ．１５。 ５．１６　酪蛋白大豆琼脂：见Ａ．１６。 ５．１７　吡嗪酰胺酶检测酪蛋白大豆琼脂：见Ａ．１７。 ５．１８　硫酸铁铵溶液：见Ａ．１８。 ５．１９　含镁和草酸的酪蛋白大豆琼脂：见Ａ．１９。 ５．２０　盐水：见Ａ．２０。 ５．２１　氢氧化钾盐溶液：见Ａ．２１。 ５．２２　牛肉浸膏：见Ａ．２２。 ５．２３　无菌甘油：见Ａ．２３。 ６　取样 保证实验室收到的样本真正具有代表性，在运输储存中没有损坏改变。虽然耶尔森氏菌是由冷冻 产品中复活的，但是不建议在试验分析前冷冻样品。取样不是本标准规定方法的一部分，样品采集和处 理见ＧＢ４７８９．１，样品采集后应尽快送检。 ２ 犛犖／犜０１７４—２０１１ ７　检测样品的制备 样品的制备要符合此类产品检验的国家标准。如果没有提供具体的标准，建议有关各方来就此问 达成协议。 ８　检验程序 小肠结肠炎耶尔森氏菌检验程序见图１。 图１　小肠结肠炎耶尔森氏菌的检验程序 ３ 犛犖／犜０１７４—２０１１ ９　操作步骤 ９．１　稀释液的制备 ９．１．１　不同类食品初始悬液的制备参见 ＧＢ４７８９．２、ＧＢ／Ｔ４７８９．１７、ＧＢ４７８９．１８、ＧＢ／Ｔ４７８９．１９、 ＧＢ／Ｔ４７８９．２０、ＧＢ／Ｔ４７８９．２２、ＧＢ／Ｔ４７８９．２４。 ９．１．２　一般情况下按无菌操作称取２５ｇ（或２５ｍＬ）样品加入２２５ｍＬＰＳＢ肉汤中，用蠕动搅拌器对悬 液均质２ｍｉｎ。 ９．１．３　按照９．１．２方法制成１０倍稀释ＩＴＣ肉汤增菌悬液，再加该增菌悬液１０ｍＬ到９０ｍＬＩＴＣ肉汤 中，得到稀释１００倍的增菌培养液。 ９．２　增菌 将ＰＳＢ培养基２２℃～２５℃摇瓶培养４８ｈ～７２ｈ，或静止培养５ｄ。１００倍稀释ＩＴＣ培养基２５℃培 养４８ｈ。 ９．３　分离培养 ９．３．１　取ＰＳＢ增菌液划线接种于ＣＩＮ琼脂平板以获得单菌落，３０℃倒置培养２４ｈ～４８ｈ。 ９．３．２　使用无菌吸管，吸取０．５ｍＬＰＳＢ增菌液加入到４．５ｍＬ的氢氧化钾溶液中混匀。２０ｓ±５ｓ后， 将混合液立即划线接种于ＣＩＮ琼脂平板以获得单菌落，３０℃倒置培养２４ｈ～４８ｈ。 ９．３．３　取ＩＴＣ增菌液划线接种于ＳＳＤＣ琼脂平板以获得单菌落，３０℃倒置培养２４ｈ～４８ｈ。 ９．３．４　培养２４ｈ后，观察平板上有无典型菌落形态。ＣＩＮ琼脂平板上，典型的小肠结肠炎耶尔森菌菌 落光滑，直径≤１ｍｍ，红色中心，半透明边缘。用有斜透射光源的立体显微镜观察菌落无晕圈，呈细小 颗粒状。在ＳＳＤＣ琼脂平板上，典型的小肠结肠炎耶尔森菌菌落，直径≤１ｍｍ，灰白色，边缘模糊无晕 圈，用有斜透射光源的立体显微镜观察菌落可看到呈精细颗粒状。 注：斜角透镜的立体显微镜可将小肠结肠炎耶尔森菌与极相似的假单胞菌区别开。 ９．３．５　如果没有形成典型菌落，可继续培养至４８ｈ，然后再进行鉴定。 ９．４　鉴定 ９．４．１　从每种选择性培养基中各选取一个平板，每个平板选择五个典型或可疑菌落（小于五个全选）， 接种到营养琼脂平板上，３０℃培养２４ｈ。 ９．４．２　质粒决定了耶尔森氏菌的毒力和致病性，温度高于３０℃或者温度低于３０℃，经过长时间的培 养和运输，质粒都可能丢失。因此，应立即将纯菌进行亚培养（２２℃～２５℃培养２４ｈ～４８ｈ），然后添加 １０％的无菌甘油，混匀，在冷冻条件下保存，最好保存于－７０℃。 ９．４．３　筛选试验： ９．４．３．１　尿素酶检测：将９．３．１培养物接种到尿素酶／吲哚的培养基液面下，３０℃培养２４ｈ，最好放入 水浴箱中培养。紫色或粉红色的颜色表示尿素酶反应为阳性。小肠结肠炎耶尔森菌的阳性尿素酶反应 几乎在１ｍｉｎ～５ｍｉｎ。橘黄色表示尿素酶反应为阴性。如果培养基没有接种到足够的菌体，可能出现 假阴性反应。 ９．４．３．２　吲哚检测：向９．４．３．１培养基试管中添加０．１ｍＬ～０．２ｍＬ的吲哚检测试剂，反应时间 １５ｍｉｎ，培养基液面变红表示反应为阳性。 ９．４．３．３　双糖铁琼脂检测：将９．３．１培养物穿刺接种和划线接种至双糖铁琼脂，３０℃培养２４ｈ～４８ｈ。 观察培养结果：穿刺接种葡萄糖阳性为黄色、葡萄糖阴性为红色或不变、产生硫化氢为黑色、有气泡和裂 缝为葡萄糖产气；斜面接种乳糖阳性为黄色、乳糖阴性为红色或不变。 ４ 犛犖／犜０１７４—２０１１ ９．４．３．４　氧化酶检测：用玻璃棒或铂铱接种环，不要使用镍铬合金接种环，将选取的典型菌落划线于浸 有氧化酶试剂的滤纸上，１０ｓ内滤纸的颜色没有变为淡紫色、紫色或深蓝色表示反应为阴性。 ９．４．４　生化确证试验 ９．４．４．１　菌落的选择：选取尿素酶检测阳性、吲哚检测阳性或阴性、发酵葡萄糖阳性、葡萄糖产气阴性、 发酵乳糖阴性、产生硫化氢阴性及氧化酶检测阴性的菌落。 ９．４．４．２　生化确证试验：用接种环将根据９．４．３．１选择的经９．３．１培养的典型菌落，接种于下列培养 基进行生化反应。 ９．４．４．３　赖氨酸脱羧酶培养基：将菌体接种于培养基液体以下，用凡士林（加热，然后冷却以便形成液 体状态）或无菌矿物油对接种试管进行覆盖。３０℃培养２４ｈ，培养后紫色表示阳性反应，黄色表示阴性 反应。 ９．４．４．４　鸟氨酸脱羧酶培养基：将菌体接种于培养基液体以下，用凡士林（加热，然后冷却以便形成液 体状态）或无菌矿物油对接种试管进行覆盖。３０℃培养２４ｈ，培养后紫色表示阳性反应，黄色表示阴性 反应。 ９．４．４．５　蔗糖、鼠李糖、海藻糖和木糖发酵培养基：将菌体接种于培养基液体以下，３０℃培养２４ｈ，培 养后黄色表示阳性反应，红色表示阴性反应。 ９．４．４．６　西蒙氏柠檬酸盐培养基：斜面划线接种于培养基上，不要盖紧塞子，使其有氧生长。３０℃培 养２４ｈ，蓝色表示阳性反应。 ９．４．４．７　吐温酯酶试验：斜面划线接种培养基，２５℃培养５ｄ，如果出现钙油酸微晶沉淀不透明区域， 表示阳性反应。 ９．４．４．８　小肠结肠炎耶尔森氏菌的生化特性见表１。小肠结肠炎耶尔森氏菌与其他菌的生化区别参 见附录Ｂ。 表１　小肠结肠炎耶尔森氏菌生化特性 生　化　试　验 试　验　结　果 尿素酶 ＋ 吲哚 －／＋ａ 葡萄糖 ＋ 葡萄糖产气 － 乳糖 － 硫化氢 － 氧化酶 － 赖氨酸脱羧酶 － 鸟氨酸脱羧酶 ＋ 蔗糖 ＋ 海藻糖 ＋／－ｂ 鼠李糖 ＋／－ｂ 木糖 ＋／－ｂ 柠檬酸 － 吐温酯酶 ＋／－ｂ 　　ａ 生物１型和生物２型的一部分血清型吲哚阳性。生物３、４、５型和生物２型的一部分血清型吲哚阴性。 ｂ 决定于小肠结肠炎耶尔森菌生物型（参见附录Ｃ）。 ５ 犛犖／犜０１７４—２０１１ １０　致病性小肠结肠炎耶尔森菌的检测 小肠结肠炎耶尔森氏菌如需进一步进行致病性检测可参照附录Ｄ进行。 １１　结果报告 根据生化鉴定结果报告每２５ｇ（或２５ｍＬ）样品中检出或未检出小肠结肠炎耶尔森氏菌。 ６ 犛犖／犜０１７４—２０１１ 附　录　犃 （规范性附录） 培养基和试剂 犃．１　蛋白胨山梨醇胆盐（犘犛犅）肉汤 犃．１．１　成分 酪蛋白（酶消化）　　　　　　　　　　５．０ｇ 山梨醇 １０．０ｇ 氯化钠 ５．０ｇ 磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４） ８．２３ｇ 磷酸二氢钠（ＮａＨ２ＰＯ４·Ｈ２Ｏ） １．２ｇ 胆盐 １．５ｇ 蒸馏水 １０００ｍＬ 犃．１．２　制法 将上述各成分溶于蒸馏水中，加热使之完全溶解，灭菌后２５℃调整ｐＨ值到７．６±０．２，将培养基分 装于试管或锥形瓶中１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ备用。 犃．２　氯苯酚替卡西林氯酸钾（犐犜犆）肉汤 犃．２．１　基础培养基 犃．２．１．１　成分 酪蛋白（酶消化）　　　　　　　　 １０．０ｇ 酵母提取物 １．０ｇ 六水氯化镁（ＭｇＣｌ２·６Ｈ２Ｏ） ６０．０ｇ 氯化钠 ５．０ｇ 孔雀石绿，０．２％水溶液 ５．０ｍＬ 蒸馏水 １０００ｍＬ 犃．２．１．２　制法 将上述各成分溶于蒸馏水中，加热使之完全溶解，灭菌后２５℃调整ｐＨ值到６．９±０．２，将基础培养 基分装于锥形瓶中，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ备用。 犃．２．２　替卡西林溶液（１犿犵／犿犔） 犃．２．２．１　成分 替卡西林　　 １０．０ｍｇ 蒸馏水 １０ｍＬ ７ 犛犖／犜０１７４—２０１１ 犃．２．２．２　制法 将替卡西林溶解于水中，过滤灭菌。 犃．２．３　氯苯酚犜犕［５氯２（２，４二氯苯氧基）苯酚］，乙醇溶液（１犿犵／犿犔） 犃．２．３．１　成分 氯苯酚ＴＭ １０．０ｍｇ ９５％乙醇 １０．０ｍＬ 犃．２．３．２　制备 将氯苯酚溶于乙醇。在－２０℃左右存放，但不超过４周。 犃．２．４　氯酸钾溶液（１００犿犵／犿犔） 犃．２．４．１　成分 氯酸钾（ＫＣｌＯ３） １０．０ｇ 蒸馏水 １００ｍＬ 犃．２．４．２　制备 将氯酸钾溶解于水中。过滤灭菌。 犃．２．５　完全培养基 犃．２．５．１　成分 基础培养基 ９８８ｍＬ 替卡西林溶液 １ｍＬ 氯苯酚溶液ＴＭ １ｍＬ 氯酸钾溶液 １０ｍＬ 犃．２．５．２　制备 无菌操作将替卡西林氯苯酚氯酸钾溶液添加到基础培养基（冷却到４７℃）中并混匀。将培养基无 菌操作分装于试管中，每管１０ｍＬ，或者分装于锥形瓶中，每瓶１００ｍＬ，以获得最小面积／体积比率（相 对厌氧）。 犃．３　头孢磺啶氯苯酚新生霉素（犆犐犖）琼脂 犃．３．１　基础培养基 犃．３．１．１　成分 蛋白胨Ｇ １７．０ｇ 酪动物蛋白胨（酶消化） ３．０ｇ 酵母浸膏 ２．０ｇ 甘露醇 ２０．０ｇ ８ 犛犖／犜０１７４—２０１１ 丙酮酸钠 ２．０ｇ 氯化钠 １．０ｇ 七水合硫酸镁（ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ） ０．０１ｇ 脱氧胆盐钠 ０．５ｇ 中性红 ０．０３ｇ 结晶紫 ０．００１ｇ 琼脂 ９ｇ～１８ｇ 蒸馏水 １０００ｍＬ 犃．３．１．２　制备 将各组分及脱水基础培养基溶解于水中并煮沸。灭菌后２５℃调整ｐＨ值到７．４±０．２将培养基分 装，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ。 犃．３．２　头孢磺啶溶液（１５犿犵／犿犔） 犃．３．２．１　成分 头孢磺啶 １．５ｇ 蒸馏水 １００ｍＬ 犃．３．２．２　制备 将头孢磺啶溶解于水中。过滤灭菌。 犃．３．３　氯苯酚犜犕［５氯２（２，４二氯苯氧基）苯酚］，乙醇溶液（４犿犵／犿犔） 犃．３．３．１　成分 氯苯酚ＴＭ ０．４ｇ ９５％乙醇 １０．０ｍＬ 犃．３．３．２　制备 将氯苯酚溶于乙醇。在－２０℃左右存放，但不超过４周。 犃．３．４　新生霉素溶液（２．５犿犵／犿犔） 犃．３．４．１　成分 新生霉素 ０．２５ｇ 蒸馏水 １００ｍＬ 犃．３．４．２　制备 将新生霉素溶解于水中，过滤灭菌。 犃．３．５　完全培养基 犃．３．５．１　成分 基础培养基 ９９７ｍＬ 头孢磺啶溶液 １ｍＬ ９ 犛犖／犜０１７４—２０１１ 氯苯酚ＴＭ溶液 １ｍＬ 新生霉素溶液 １ｍＬ 犃．３．５．２　制备 无菌操作将抗生素溶液添加到基础培养基（冷却到４７℃）中并混匀，将大约１５ｍＬ的完全培养基 倒入无菌平板中，静置。 犃．４　沙门氏菌志贺氏菌琼脂（含脱氧胆盐氯化钠）（犛犛犇犆琼脂） 犃．４．１　成分 酵母提取物 ５．０ｇ 牛肉浸膏 ５．０ｇ 动物蛋白胨（酶消化） ５．０ｇ 乳糖 １０．０ｇ 胆盐 ８．５ｇ 脱氧胆盐钠 １０．０ｇ 氯化钙 １．０ｇ 柠檬酸钠 １０ｇ 五水合硫代硫酸钠（Ｎａ２Ｓ２Ｏ３·５Ｈ２Ｏ）８．５ｇ 柠檬酸铁铵 １．０ｇ 煌绿 ０．０００３ｇ 中性红 ０．０２５ｇ 琼脂 ９ｇ～１８ｇ 蒸馏水 １０００ｍＬ 犃．４．２　制法 将各组分或脱水完全培养基溶解于水中并煮沸。２５℃调整ｐＨ值到７．４±０．２不用灭菌。将培养 基冷却到４５℃左右，向无菌平板倒入约２０ｍＬ，静置。如果提前制备，琼脂平板应放于塑料袋中，８℃± ２℃黑暗保存１周。不要在３℃±２℃冷藏，否则将会有沉淀形成，影响使用。 犃．５　营养琼脂 犃．５．１　成分 牛肉浸膏 ３．０ｇ 蛋白胨 ５．０ｇ 琼脂 ９ｇ～１８ｇ 蒸馏水 １０００ｍＬ 犃．５．２　制法 将各组分或脱水完全培养基溶解于水中并煮沸。灭菌后２５℃调整ｐＨ值到７．０±０．２，１２１℃高压 灭菌１５ｍｉｎ，将培养基冷却到４５℃左右，向无菌平板倒入约１５ｍＬ，静置。 ０１ 犛犖／犜０１７４—２０１１ 犃．６　尿素吲哚培养基 犃．６．１　成分 Ｌ色氨酸 ３．０ｇ 磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４） １．０ｇ 磷酸氢二钾（Ｋ２ＨＰＯ４） １．０ｇ 氯化钠 ５．０ｇ 尿素 ２０．０ｇ ９５％乙醇 １０ｍＬ 酚红 ０．０２５ｇ 蒸馏水 １０００ｍＬ 犃．６．２　制备 将Ｌ色氨酸溶解于６０℃的蒸馏水中，冷却，然后将其他成分边搅拌边溶于蒸馏水中。或者将干粉 完全培养基溶解于水中并不断搅拌。２５℃调整ｐＨ值到６．９±０．２过滤灭菌。将培养基无菌操作分装 于１２ｍｍ×５０ｍｍ的试管中，每管０．５ｍＬ。在３℃±２℃避光保存。 犃．７　科瓦奇试剂 犃．７．１　成分 ４二甲胺基苯甲醛 ５．０ｇ 盐酸（ρ＝１．１８ｇ／ｍＬ～１．１９ｇ／ｍＬ） ２５ｍＬ ２甲基２丁醇 ７５ｍＬ 犃．７．２　制备 ６０℃水浴中将５．０ｇ的４二甲胺基苯甲醛溶于２甲基２丁醇，冷却至室温，将烧瓶置于冰浴中，小 心添加盐酸，缓慢混匀。３℃±２℃储存于琥珀瓶中。避免使用橡胶瓶盖，以防破坏试剂。 犃．８　双糖铁琼脂 犃．８．１　成分 牛肉浸膏 ３．０ｇ 酵母浸膏 ３．０ｇ 胰酪蛋白胨 ２０．０ｇ 氯化钠 ５．０ｇ 乳糖 １０．０ｇ 葡萄糖 １．０ｇ 硫酸铁 ０．２ｇ 五水合亚硫酸钠（Ｎａ２Ｓ２Ｏ３·５Ｈ２Ｏ） ０．３ｇ 酚红 ０．０２５ｇ 琼脂 ９ｇ～１８ｇ １１ 犛犖／犜０１７４—２０１１ 蒸馏水 １０００ｍＬ 犃．８．２　制备 将各组分或脱水完全培养基溶解于水中并煮沸。２５℃调整ｐＨ值到７．４±０．２分装于试管中，每管 １０ｍＬ。１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ将试管倾斜放置，以便获得大约３ｃｍ深，坡度５ｃｍ长的琼脂斜面。 犃．９　氧化酶检测试剂 犃．９．１　成分 盐酸二甲基对苯二胺 １．０ｇ 蒸馏水 １００ｍＬ 犃．９．２　制备 使用前溶解试剂，３℃±２℃暗处保存不超过１周。 犃．１０　赖氨酸脱羧酶培养基 犃．１０．１　成分 Ｌ赖氨酸盐酸盐 ５．０ｇ 酵母浸膏 ３．０ｇ 葡萄糖 １．０ｇ 溴甲酚紫 ０．０１５ｇ 蒸馏水 １０００ｍＬ 犃．１０．２　制备 将组分加热溶解于水中，２５℃调整ｐＨ值到６．８±０．２，将培养基分装于规格为９ｍｍ×１８０ｍｍ的 试管中，每管５ｍＬ。１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ备用。 犃．１１　鸟氨酸脱羧酶培养基 犃．１１．１　成分 Ｌ鸟氨酸盐酸盐 ５．０ｇ 酵母浸膏 ３．０ｇ 葡萄糖 １．０ｇ 溴甲酚紫 ０．０１５ｇ 蒸馏水 １０００ｍＬ 犃．１１．２　制备 将组分加热溶解于水中，２５℃调整ｐＨ值到６．８±０．２，将培养基分装于规格为９ｍｍ×１８０ｍｍ的 试管中，每管５ｍＬ。１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ备用。 ２１ 犛犖／犜０１７４—２０１１ 犃．１２　糖类的发酵培养基（含有酚红的蛋白胨水，鼠李糖、蔗糖、海藻糖和木糖） 犃．１２．１　基础培养基 犃．１２．１．１　组成 蛋白胨 １０．０ｇ 氯化钠 ５．０ｇ 酚红 ０．０２ｇ 蒸馏水 １０００ｍＬ 犃．１２．１．２　制备 将组分加热溶解于水中，２５℃调整ｐＨ 值到６．８±０．２，培养基分装于烧瓶中１２１℃高压灭菌 １０ｍｉｎ。 犃．１２．２　糖类溶液（鼠李糖、蔗糖、海藻糖和木糖，１００犿犵／犿犔） 犃．１２．２．１　组成 糖类（鼠李糖、蔗糖、海藻糖或木糖） １０．０ｇ 蒸馏水 １０００ｍＬ 犃．１２．２．２　制备 每种糖单独加入到蒸馏水中过滤灭菌。 犃．１２．３　完全培养基 犃．１２．３．１　组成 基础培养基（Ａ．１２．１） ９００ｍＬ 糖溶液（Ａ．１２．２） １００ｍＬ 犃．１２．３．２　制备 将基础培养基冷却到４５℃，再将各种糖溶液无菌操作添加其中。将完全培养基无菌操作分装于试 管中，每管１０ｍＬ。 犃．１３　西蒙氏柠檬酸盐 犃．１３．１　成分 柠檬酸钠 ２．０ｇ 氯化钠 ５．０ｇ 磷酸氢二钾（Ｋ２ＨＰＯ４） １．０ｇ 溴麝香草酚蓝 ０．０８ｇ 磷酸二氢铵（ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４） １．０ｇ 硫酸镁 ０．２ｇ 琼脂 ９ｇ～１８ｇ ３１ 犛犖／犜０１７４—２０１１ 蒸馏水 １０００ｍＬ 犃．１３．２　制备 将培养基各组分溶解于水中。２５℃调整ｐＨ值到６．８±０．２，将培养基分装于试管中，每管１０ｍＬ。 试管在使用前需要先进行清洗，应保证其对试验无干扰。１２１℃高压灭菌１０ｍｉｎ，将试管倾斜放置，以 便获得２．５ｃｍ深的琼脂斜面。 犃．１４　吐温酯酶试验 犃．１４．１　基础培养基 犃．１４．１．１　成分 蛋白胨 １０．０ｇ 氯化钠（ＮａＣｌ） ５．０ｇ 氯化钙（ＣａＣｌ２） ０．１ｇ 琼脂 ９ｇ～１８ｇ 蒸馏水 １０００ｍＬ 犃．１４．１．２　制备 将组分加热溶解于水中。２５℃调整ｐＨ值到７．４±０．２，１２１℃高压灭菌３０ｍｉｎ。 犃．１４．２　完全培养基 犃．１４．２．１　成分 基本培养基 ９９０ｍＬ 吐温８０（山梨醇单油酸酯） １０ｍＬ 犃．１４．２．２　制备 添加吐温８０于液体基础培养基中，均质。１１０℃灭菌３０ｍｉｎ。将培养基分装于试管中，每管 ２．５ｍＬ。将试管倾斜放置制成斜面。 犃．１５　胆汁七叶苷琼脂 犃．１５．１　成分 牛肉浸膏 ３．０ｇ 牛肉胨 ５．０ｇ 七叶苷 １．０ｇ 胆盐 ４０．０ｇ 柠檬酸铁 ０．５ｇ 琼脂 ９ｇ～１８ｇ 蒸馏水 １０００ｍＬ 犃．１５．２　制备 将组分溶解于水中，微微煮沸。２５℃调整ｐＨ值到６．６±０．２将培养基分装于试管中，每管１０ｍＬ。 ４１ 犛犖／犜０１７４—２０１１ １２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ，将试管倾斜放置，以便获得２．５ｃｍ深的琼脂斜面。 犃．１６　酪蛋白大豆琼脂 犃．１６．１　成分 酪蛋白胨 １５．０ｇ 大豆蛋白胨 ５．０ｇ 氯化钠 ５．０ｇ 琼脂 ９ｇ～１８ｇ 蒸馏水 １０００ｍＬ 犃．１６．２　制备 将组分溶解于水中并加热煮沸。２５℃调整ｐＨ 值到７．３±０．２将培养基分装于锥形瓶中，每瓶 ８３０ｍＬ，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ备用。该培养基用于Ａ．１６中。 犃．１７　吡嗪酰胺酶检测酪蛋白大豆琼脂 犃．１７．１　成分 酪蛋白胨 １５．０ｇ 大豆蛋白胨 ５．０ｇ 吡嗪酰胺（Ｃ５Ｈ５Ｎ３Ｏ） １．０ｇ 氯化钠 ５．０ｇ 琼脂 ９ｇ～１８ｇ Ｔｒｉｓ马来酸缓冲液（０．２ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ６） １０００ｍＬ 犃．１７．２　制备 将组分溶解于水中并加热煮沸。２５℃调整ｐＨ 值到７．３±０．２将培养基分装于试管中，每管 １０ｍＬ。１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ灭菌后，将试管倾斜放置，以便获得琼脂斜面。 犃．１８　硫酸铁铵溶液 犃．１８．１　成分 硫酸铁铵 １．０ｇ 蒸馏水 １００ｍＬ 犃．１８．２　制备 使用前，将硫酸铁铵溶解于水中。 犃．１９　酪蛋白大豆琼脂（含有镁和草酸） 犃．１９．１　基础培养基 见Ａ．１３。 ５１ 犛犖／犜０１７４—２０１１ 犃．１９．２　氯化镁溶液 犃．１９．２．１　成分 六水合氯化镁（ＭｇＣｌ２·６Ｈ２Ｏ）（０．２５ｍｏｌ／Ｌ）　　　　　　５．０９ｇ 蒸馏水 １００ｍＬ 犃．１９．２．２　制备 将氯化镁溶解于水中。过滤灭菌。 犃．１９．３　草酸钠溶液 犃．１９．３．１　成分 草酸钠 ３．３５ｇ 蒸馏水 １００ｍＬ 犃．１９．３．２　制备 将草酸钠溶解于水中。过滤灭菌。 犃．１９．４　葡萄糖溶液 犃．１９．４．１　成分 葡萄糖 １８．０ｇ 蒸馏水 １００ｍＬ 犃．１９．４．２　制备 将葡萄糖溶解于水中。过滤灭菌。 犃．１９．５　完全培养基 犃．１９．５．１　成分 基础培养基 ８３０ｍＬ 氯化镁溶液 ８０ｍＬ 草酸钠溶液 ８０ｍＬ 葡萄糖溶液 １０ｍＬ 犃．１９．５．２　制备 基础培养基冷却至４７℃左右，无菌条件下，将氯化镁、草酸钠和葡萄糖添加其中并混匀。向无菌平 皿中倒入大约１５ｍＬ完全培养基，备用。 犃．２０　盐水 犃．２０．１　组成 氯化钠 ５ｇ ６１ 犛犖／犜０１７４—２０１１ 蒸馏水 １０００ｍＬ 犃．２０．２　制备 将氯化钠溶解于水中，分装，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ。 犃．２１　氢氧化钾溶液 犃．２１．１　成分 氢氧化钾（ＫＯＨ） ０．５ｇ 盐溶液（０．５％） １００ｍＬ 犃．２１．２　制备 将氢氧化钾溶解于盐溶液中，分装。１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ，备用。储存液为４０％氢氧化钾，配制 好后保存于３℃±２℃。用０．５％氯化钠溶液做１∶８０稀释形成０．５％氢氧化钾使用液。 犃．２２　牛肉浸膏 犃．２２．１　组成 小牛肉浸出液（脱水） ５００ｇ 酶消化酪蛋白 １０ｇ 氯化钠 ５ｇ 蒸馏水 １０００ｍＬ 犃．２２．２　制备 将各组分溶解于水中，加热溶解，调节ｐＨ值，使灭菌后２５℃时ｐＨ值至７．４±０．２。将培养基分装 于试管中，每管１０ｍＬ，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ。 犃．２３　无菌甘油 将甘油分装于瓶中，每瓶１００ｍＬ，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ。 ７１ 犛犖／犜０１７４—２０１１ 附　录　犅 （资料性附录） 假结核耶尔森氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌及其他相似菌３０℃培养生化特性 表犅．１　３０℃时耶尔森氏菌生化特性犪 试　　验 假结核耶尔森氏菌 小肠结肠炎耶尔森氏菌 相近型 葡萄糖 ＋ ＋ ＋ 葡萄糖产气 － －（或少数气泡） －（或少数气泡） 乳糖 － － － 邻硝基酚半乳糖甙 ＋ ＋／－ ＋／－ 阿东醇 － － － 纤维二糖 － ＋ 半乳糖醇 － － － 甘露醇 ＋ ＋ ＋ 蜜二糖 ＋／－ － Ｄ 鼠李糖 ＋ － Ｄ 蔗糖 － ＋ Ｄ 山梨醇 － ＋／－ Ｄ 海藻糖 ＋ ＋／－ ＋ 木糖 ＋ Ｄ ＋ 七叶苷 ＋ Ｄ Ｄ 水杨甙 ＋ Ｄ Ｄ 尿素 ＋ ＋ ＋ 吲哚 － Ｄ Ｄ ＶＰ － ＋／－ Ｄ 硫化氢 － － － 脱氨酶（ＡＰＰ） － － － 赖氨酸 － － － 鸟氨酸 － ＋／－ ＋ 柠檬酸（西蒙氏） － － Ｄ 脂肪酶（吐温８０） － Ｄ Ｄ 粘酸盐 － － Ｄ 　　ａ ＋阳性；－阴性；＋／－主要为阳性；Ｄ有分歧的生化型；３７℃时几乎全部为阴性。 ８１ 犛犖／犜０１７４—２０１１ 附　录　犆 （资料性附录） 小肠结肠炎耶尔森氏菌生物型 表犆．１　小肠结肠炎耶尔森氏菌的生物型生化试验 生物型 吐温酯酶 七叶苷 吡嗪酰胺酶 吲哚 木糖 海藻糖 １Ａａ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ １Ａ ＋ － － ＋ ＋ ＋ ２ － － － （＋）ｂ ＋ ＋ ３ － － － － ＋ ＋ ４ － － － － － ＋ ５ － － － － Ｄｂ － 　　ａ 非致病性。 ｂ 通常现象很弱或延时。 ９１ 犛犖／犜０１７４—２０１１ 附　录　犇 （资料性附录） 致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌检测方法 犇．１　菌落的选择 犇．１．１　在９．４．４．２生化确证试验基础上，选择赖氨酸脱羧酶阴性；鸟氨酸脱羧酶阳性；鼠李糖发酵阴 性：蔗糖发酵阳性及柠檬酸水解阴性的菌落进行致病性检测。 犇．１．２　用接种环将根据Ｄ．１．１选择的经９．４．１培养的典型菌落，按照Ｄ．２～Ｄ．４的培养基进行生化 反应。 犇．２　七叶苷发酵试验 犇．２．１　斜面划线接种培养基３０℃培养２４ｈ。 犇．２．２　菌落边缘带有黑环的表示阳性反应。 注：此七叶苷发酵试验相当于水杨苷的发酵试验。 犇．３　吡嗪酰胺酶检测 犇．３．１　大面积斜面划线接种于吡嗪酰胺酶检测酪蛋白大豆琼脂３０℃培养４８ｈ。 犇．３．２　加１％的硫酸铵铁溶液１ｍＬ，１５ｍｉｎ后出现粉红棕色表示阳性反应。 犇．４　３７℃钙需求试验 犇．４．１　醋酸钠利用实验可代替３７℃钙需求试验。在３７℃培养可能导致该特性的丢失，因为该特性基 因编码是在质粒上进行的。 犇．４．２　用氯化钠溶液将营养琼脂上分离的纯培养物，制成浓度大约为１０００ＣＦＵ／ｍＬ的菌悬液。接 种０．１ｍＬ菌悬液到两个酪蛋白大豆琼脂平板及两个添加镁和草酸的酪蛋白大豆琼脂平板。每种培养 基中，一个平板２５℃培养４８ｈ，另一个平板３７℃培养４８ｈ。 犇．４．３　如果２５℃培养的菌落大小均一，而３７℃添加镁和草酸的培养基菌生长受到抑制，２０％以上的 菌落较小，直径０．１ｍｍ。其余培养基上菌落直径在０．５ｍｍ～１ｍｍ之间，认为是阳性反应。这些被抑 制菌落的生长需要添加钙，并可能具有致病性。 犇．５　确定小肠结肠炎耶尔森菌致病性 犇．５．１　七叶苷和（或）吡嗪酰胺酶试验阳性，３７℃钙需求试验阴性的菌株是非致病的。七叶苷和吡嗪 酰胺酶阴性、３７℃钙需求试验阳性的菌株为致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌。 ０２ 犛犖／犜０１７４—２０１１ 犇．５．２　为了确定小肠结肠炎耶尔森菌的致病性，对小肠结肠炎耶尔森菌的生物型进行测定，生化反应 参见附录Ｃ。小肠结肠炎耶尔森菌生物型１Ａ、２、３、４和５均已知具有致病性。 犇．５．３　小肠结肠炎耶尔森菌Ｏ抗原对于流行病学有很重要的意义。通过抗血清对致病性小肠耶尔森 氏菌进行血清分型，通常为Ｏ∶３，Ｏ∶８，Ｏ∶９和Ｏ∶５，２７。 １２ 犛犖／犜０１７４—２０１１