Corilagin对小鼠小胶质细胞株照射后炎性反应因子表达的抑制作用

·682· ±堡夔盟匿堂皇堕塑盘查垫!Q至!!旦笙!垒鲞筮!塑璺!堕!墨生i!!丛鲤!型：里!!!堂坚垫!壁：!!!：垫：盟!：垒 Corilagin对小鼠小胶质细胞株 反应因子表达的抑制作用 罗呜 伍钢 范丽 张瑞光 任精华 董继华 董晓荣 照射后炎。 【摘要】 目的 研究抗炎药物Corilagin抑制放射引起小胶质细胞(BV-2)炎性反应的作用及其 防护的分子机制。方法细胞抑制实验(MTr)检测Corilagin对BV-2细胞的抑制率；Corilagin预处 理小胶质细胞，12h后，以0和32Gy2个放射剂量照射BV-2细胞，Real-timePCR检测小胶质细胞照 射后不同时间点炎性反应因子IL．1B、TNF·d表达水平；硝酸还原酶法检测细胞上清液中一氧化氮 (NO)的含量；Westernblot检测各组细胞核转录因子NF—KBp65蛋白表达；激光共聚焦显微镜观察 各组细胞标志物Iba·1的表达、NF—KBp65核转位及Nemo的表达。结果l—10斗g／ml浓度范围内 Corilagin对BV-2细胞增殖几乎无影响；照射后小胶质细胞表面标志物lha-l表达明显，提示小胶质 细胞激活，且炎性反应因子NO、TNF-a、lL-18表达上调。而Corilagin(5肛g／m1)可以显著抑制上述炎 性反应因子的表达(tIL．IB=6．341，tTNF．。=3．411，tNo=3．134，P<0．05)；Corilagin可抑制NF—KB活化 蛋白Nemo，并显著抑制NF-KBp65的转位。结论Corilagin可能通过NF．KB信号转导途径抑制照 射后小胶质细胞的活化，从而下调炎性反应因子表达，保护神经元。 【关键词l Corilagin；小胶质细胞；NF-xB；放射性脑损伤 InhibitoryeffectofCorilaIginontheInflammatoryresponseofIrradiatedmicrogliaBV-2celkLUO Ming，WUGd，lg，FANLi，ZHANGRui—guang．RENJing—hua，DONGJi·hua，DONGXiao-rong．Cancer Center。UnionHospital。HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430023，China Correspondingauthor：DONGXiao—rong，Email：并Ldo，增@gmaiLcorn 【Abstract]ObleetiveToexploretheinhibitoryeffectsofCorilaginontheproductionofpro- inflammatorycytokinesinmicrogliainducedbyradiation．MethodsTheeytotoxieityofCorilaginWas measuredbyM1Yrassay．MierogliaBV一2cellswereirradiated0or32GyafterpretreatedwithCorilaginfor 12hours．Reahime-PCRwasusedtodetectthemRNAlevelsofinflammatorycytokines，suchasIL-lB， TNF·口onseveraltime·points．Thecontentofnitricoxide(NO)wasdeterminedwithnitratereductase method．ThetranslocationofNF-KBWasmeasuredbyWesternblotandimmunocytochemicalstain． ConfocalmicroscopyWagusedtoobservetheexpressionoflba-landNemo．ResultsNocytotoxicityWas detectedonBV-2ceUswithl-lO斗g／mlCorilagin．1ba-lexpressioninmicrogliaccHsWasactivatedby i玎adiation。theexpressionlevelsofinflammatorycytokines。suchasIL-lB，TNF-aandN0werealso elevated．Whereas，theproductionofIL·l8，TNF-仅inactivatedmicrogliaceUsWassignificantlyinhibited with5斗g／mLcorilagin(1¨B=6．341，l”F，=3．411．tHo=3．134，P<0．05)．Corilaginsignificantly inhibitedtheexpressionofNemoandthetranslocationofNF．KBp65．ConclusionCorila#ncouldinhibit theactivationofirradiatedmierogliaceHsanddown-regulatetheexpressionofinflammatoryeytokines，via inhibitionoftheNF·KBsignalingpathway． 【Keywords】Corilagin；MicrogliaBV-2；NF—KB；Radiationence}phlopathy 放射治疗是中枢神经系统及头颈部肿瘤的有 效治疗手段，但同时难以避免射线对瘤周正常组织 的损伤，及发生急性和迟发性的放射性脑损伤⋯。 DOI：10．3760／ema．j．I‘SIIm．0254-5098．2010．06．013 基金项目：国家自然科学基金(30800283) 作者单位：430022武汉，华中科技大学同济医学院附■协和 医院肿瘤中心(罗鸣、伍钢、范丽、张瑞光、任精华、董晓荣)；华中科 技大学同济医学院附属协和医院中心实验室(董继华) 通信作者：董晓荣。F-dllIiItⅡ．doq国gⅫliI．eom 基础研究 近年来干预小胶质细胞的活化，抑制炎性反应因子 的释放，被认为是预防放射性脑病的关键措施¨·。 Corilagin(简称Cori)是从大戟科叶下珠属植物密柑 草中分离出的有效成分。近期研究表明Corilasin 能显著抑制脂多糖(LPS)所诱导的炎性反应p1。但 目前有关该药在放射性脑损伤中炎性反应的作用 关系，国内外尚未见报道。本实验通过观察 Corilagin对小胶质细胞活化后炎性反应因子的抑制 万方数据 作用，探讨Corilagin在放射性脑损伤中的相关药理 机制。 与方法 1．主要材料：小鼠小胶质细胞株BV一2由武汉 协和医院中心实验室惠赠；Corilagin(纯度99％)购 自中国药品生物制品检定所；新生牛血清和RPMI 1640培养液均为美国Gibco公司产品；胰蛋白酶，二 甲基亚砜(DMSO)和MTT购自美国Sigma公司；蛋 白酶抑制剂为瑞士Roche公司。细胞浆细胞核蛋白 抽提试剂盒购自江苏碧云天生物技术研究所；ECL western印染发光试剂盒购自美国Thermo公司；Iba- l一抗购自日本Wako公司；NF—zBp65一抗购自北 京中杉金桥公司；Nemo(IKK)一抗购自美国Sanm Cruz公司；p65羊抗兔二抗、p—actin抗体均购自武汉 博士得公司；AlexaFluor-488羊抗鼠二抗及TRIzol购 自美国Invitrogen公司；OligodT和引物由Invitrogen 美国公司(上海)合成；RT·PCR试剂盒为日本 Toyobo公司产品。 2．细胞培养：将BV-2细胞培养于体积分数为 10％新生牛血清，100U／ml青霉素，100g／ml链霉索 的RPMI1640培养液，在37℃，5％C02条件下培养， 取对数生长期细胞实验。实验细胞分为未照射组、 单纯照射组、照射+Corilagin3组。在细胞接受照 射前12h给予5斗g／mlCorilagin，继续培养12h后接 受32Gy照射。照射条件：6MV直线加速器(德国 西门子)剂量率2Gy／min。加2cm等效组织填充物， 照射0或32Gy。倒置相差显微镜观察各组细胞形 态学差异。 3．MTT法测细胞抑制率：选对数生长期的细胞 用于实验，按每孔2×10‘个细胞接种于96孔板上， 置于37℃、5％CO：培养箱孵育24h，待细胞贴壁后 吸出培养液，分别加入0．5、1、5、10、20、40、60及 130p．s／ml的Corilagin。共8个实验组，对照组除不 加入Corilagin外，其余操作同实验组，每种浓度接 种6孔；继续培养12、24、48、72和96h后，加入20斗l 5．0mg／ml的MTT溶液，再培养4h。吸净培养液后， 每孔加入100汕l二甲基亚砜(DMSO)振荡15min，在 酶标仪(BIO—BAD)上于492nm波长处测每孔的吸 光度(A)值，根据(A)值求出肿瘤细胞抑制率，并计 算各组细胞抑制率：[1-实验组(A)值／对照组(A) 值]×100％。 4．细胞免疫荧光染色检测照射后小胶质细胞 激活标志物Iba-1及NF—KB通路蛋白：细胞以1× 105个／ml接种于24孔板，内置无菌盖玻片，孵育至 细胞贴片后，32Gy剂量照射24孔板，细胞免疫荧光 染色从形态学上观察BV·2细胞表面Iba·1、细胞内 NF．KB标志蛋白p65及活化蛋白Nemo的表达。具 体方法：吸去24孔板中的培养液，预冷的PBS漂洗 1次，取出细胞贴片，以4％多聚甲醛固定30min； PBS漂洗5min，3次；3％过氧化氢孵育30min，清除 内源性过氧化酶的活性；PBS漂洗5rain，3次；滴加 l％山羊血清封闭液30min，3％BSA封闭非特异位 点；分别滴加Iba·l一抗、p65一抗、Nemo一抗(1： 200)，湿盒密闭，于40C冰箱孵育过夜(PBS替代一 抗为阴性对照)；PBS漂洗5min，3次，滴加CY3标 记的羊抗兔及FITC标记的羊抗鼠二抗(I：400)，室 温孵育lh，PBS漂洗5min，3次，DAPI染核，600× 激光共聚焦显微镜下观察，摄片。 5．RNA提取及Real-timePCR：实验用细胞按照 ％zol试剂说明提取总RNA，加入20p．1 DEPC— treated水溶解，用紫外分光光度计在260和280nm进 行样品的浓度测定和质量鉴定，电泳证实总RNA完 整性。取5斗g总RNA。按逆转录试剂盒(日本 Toyobo公司)说明书进行操作，合成cDNA。目的基 因引物序列如下，鼠TNF-q上游5’ TrCTCATTCCTGCTYGTGG3’。 下 游 5’ CTrGGTGGTTTGCTACGAC3’；鼠IL一1B上游5’ AAATCTCGCAGCAGCACAT3’。 下 游 5’ CACACACCAGCAGGTTATCA37；GAPDH上游5’ TCACCACCATGGAGAAGGC3’，下游5’GCTAAGC AGTTGGTGGTGCA3’(各组基因产物均以GAPDH 基因作为对照进行半定量)。20恤l反应体系：分别 加人cDNA2¨l，上游引物0．8pl，下游引物 0．8p．1，SYBRGreenPCRMasterMix10仙l，DEPC水 补至20¨l。反应条件：热启动94℃，5min；94℃． 30s；57℃，30s；72℃，458，如此50个循环后结束 反应。用比较模板的阈值循环数(Ct)的相对定量 法研究小胶质细胞激活后炎性反应因子的表达，以 内源控制物管家基因GAPDH为参照物，按照AACt 解析法进行目的基因与管家基因的相对定量。 6．硝酸还原酶法测定NO：细胞以2×10’个／ml 接种于12孔板，孵育过夜，照射后0．5、3、6、12、24 和48h，取细胞上清液，严格按照试剂盒说明测定， 酶标仪550nm处测定。 7．Westernblot检测细胞内p65表达变化：细胞 万方数据 处理同前，按照细胞浆细胞核蛋白抽提试剂盒说明 书分别提取胞浆蛋白与胞核蛋白。BCA试剂盒进 行蛋白定量，酶标仪检测，调节每份蛋白样品浓度， 一70℃保存。加等量蛋白于上样缓冲液，煮沸，在 SDS聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。电泳后转膜， PVDF膜以丽春红染色观察转膜效果，后用蒸馏水 漂洗脱色，再将PVDF膜置于塑料袋中，加入5％脱 脂牛奶封闭1h后加羊抗兔p65抗体4℃过夜，PBST 洗膜10min，3次；加羊抗兔二抗，37℃下孵育1h， PBST洗膜10rain，3次；ECL试剂显色，x线胶片显 影。实验重复3次。 8．统计学处理：应用SPSS13．0软件进行统计 学，数据用面-I-s表示，各实验组间样本均数比 较采用t检验。P<0．05为差异有统计学意义。 结 果 1．Corilagin对BV-2细胞增殖的影响：MTT结果 显示，Corilagin在1—60斗g／ml的浓度范围内对细胞 的生长均无明显影响(图1)。当药物浓度为 5斗g／ml时，细胞抑制率为3．2％。 幂 ■ 暮 最 重 量 圈1 Corilagin对小胶质细胞系BV-2细胞活性的影响 2．小胶质细胞镜下观察：倒置相差显微镜下发 现，未照射组小胶质细胞分支突触明显可见(图 2a)，32Gy剂量照射12h后，镜下见细胞胞体轻度肥 大，突触回缩呈阿米巴样改变(图2b)，与照射前比 较，细胞差异明显。而照射前BV-2以5pg／ml Corilagin预处理后，细胞胞体肥大、突触回缩等较单 纯照射组明显改善(图2c)。 3．Corilagin抑制小胶质细胞的激活：激光共聚 焦显微镜下可见，BV-2细胞未照射组BV-2细胞无 法检测lha．1的表达(图3a)。以32Gy剂量照射细 胞后。Iba．1表达明显，提示照射激活小胶质细胞(图 3b)。而细胞照射前以5斗g／mlCorilagin预处理后， lba．1表达较单纯照射组明显减少(图3c)，提示 Corilagin可在一定程度上抑制小胶质细胞的激活。 4．Corilagin抑制小胶质细胞内NF—KB通路活 化：荧光染色显示，NF—KB标志蛋白p65染色阳性反 应产物呈棕红色，NF-KB活化蛋白Nemo染色阳性 反应产物呈绿色。BV-2细胞未接受照射前，p65和 Nemo散在分布于胞浆中，胞核极少(图4a)。以 32Gy剂量照射细胞后，p65从胞浆转入胞核变化明 显，且NF—KB激活蛋白Nemo表达亦较前明显增加 (图4b)，提示BV-2细胞照射后NF-KB通路激活。 细胞照射前以5斗g／mlCorilagin预处理后，胞浆中 p65染色颗粒明显多于单纯照射组，胞核中p65染 色颗粒较前减少，Nemo表达亦明显低于单纯照射 组(图4c)。间接提示Corilagin预处理可抑制照射 后BV-2细胞通路的激活。 5．Corilagin抑制小胶质细胞炎性反应因子表 达：RT．PCR结果显示小胶质细胞在接受照射后 0．5h，即开始表达炎性反应因子，6hK性反应因子 达高峰(tIL．1B=16．02，P<0．04；tTNF。=21．53，P< 0．01)。照射前给予5．0斗g／mlCorilagin预处理，在 照射后6、12及24h时间点，炎性反应因子表达与单 纯照射组差异有统计学意义(表1)，其中以照射后 6h抑制炎性反应作用最明显。 6．Corilagin对照射后小胶质细胞生成NO的抑 制作用：小胶质细胞接受照射后，细胞培养液中NO 含量明显增加；而照射前Corilagin预处理后能显著 减低NO释放量，与单纯照射组相比，差异有统计学 意义(t=3．134，P<0．015)。其中以照射后6h抑制 NO释放作用最为明显(表2)。 7．Corilagin对NF—KB信号通路的抑制作用：小 胶质细胞照射后，胞浆内P65蛋白含量明显减少，而 胞核内P65蛋白含量明显增加(图6)，提示NF—KB P65由胞浆转入胞核。Corilagin5斗g／ml预处理12h 后照射，胞浆P65蛋白含量明显高于照射组，而胞核 内P65含量减少(图6)，提示Corilagin可抑制NF· KBP65转位。 讨 论 静息的小胶质细胞分泌释放神经生长因子、转 化生长因子等支持营养神经元，促进其生长分化， 为神经元提供一个相对稳定的微环境。然而，小胶 质细胞接受化疗、照射或脂多糖等刺激后，能够分 泌多种炎性反应介质参与早期放射性脑损伤Ⅲ。 万方数据 注．且-未照射组；b．单纯照射组；c．照射+Coil组 圈2光学硅微镜下BV-2细胞形态学观察x60 注：a．未照射组．b．单纯照射组；c．照射+Cori组 圈3激光共聚焦显徽镜下观察小胶质细胞激活标志物lba—I的表达x600 注：l未照射组；b．单纯照射组；c．照射前以5．0斗∥mlCorilagin预处理组(DAPI为细胞棱 染料定位细胞．Merge为胞浆胞核合成图) 圈4激光共聚焦显徽镜下观察小胶质细胞内NF-xBp65、活化蛋白Nemo的表达x600 衷1 照射后各组小胶质细胞IL-IB、TNF-amBNA相对表达量(i±5) l值 3．37 16．02 8．48 6．1I 12．96 2I．53 4．19 9．89 ￡篁 ：竺：竺 ：!：竺 !!：竺 三!：竺 ：!：!! ：!：!! ：!：!! ：竺：竺 Monje等㈩以脂多糖激活小胶质细胞，与正常海马 区神经干细胞共培养后发现，激活的小胶质细胞可 显著抑制神经千细胞分化。检测表明IL-lB、TNF—a 在这一过程中发挥关键作用。激活的小胶质细胞 万方数据 史堡丝盟匿堂皇堕塑盘查!Q!Q堡!!旦整!!鲞筮!塑垦!也!垦型!!!丛鲤!竺!：旦!!!里!!!!!!!：!!!：!Q：堕!：! 组别0．5h 3 h 6 h 24h 48h 田6 Corilagin预处理后照射BV．2后胞庾及胞核内NF-xBP65蛋自表达 可抑制神经形成"刁1。本研究也表明，小胶质细胞 参考文献 接受照射后形态学改变明显，呈阿米巴样活化状 态，RT．PCR检测照射后小胶质细胞炎性反应因子[1]NewP-Radm油injuryto thenervous8Y吼。“CurtoPP讯 TNF．a、IL—I、NO等表达明显增加，在照射后6h炎 ，，N。“”1，2001，14(6)：725刁3乱 性反应出现高峰。 adulthippocampaJneumgenesi8．Science,2003．302(5651)： NF—KB作为炎性反应的核心调节因子，由2种 1760．1765． Rel家族蛋白(P50／P65)构成。其中p65能直接作[3]ZhaoL，ZhangSL，TaoJY．jta1．Preliminaryexplorationon 用于核内炎性反应因子如IL一1B、TNF．d等转录单 明d-‘“‘hma佃ryo。”。。““‘8““co^1agi“(6。协1。galloyl。3，6‘ 位而激活其转录。在静息状态下，NF—KBp65与抑 二三二=宅。he，n。oy(1，-D)-：8：：。乙．讥础“ 1n‘ 制蛋白IKB结合以无活性的形式存在于胞浆中。 [4]MonjeMLMi：。。。协。s， 。t。1．I。di。ti。。, FikeJR, induces 在接受细胞外刺激如照射时，射线能使细胞内DNA neumlp。。。一-ceudysfunction．NatMed，2002，8(9)： 双键断裂，引发细胞内DNA损伤反应，激活复合蛋 955-962． 白Nemo,进而降解NF．KBp65抑制蛋白IKB，p65即[5]Y洫L·oh协“H，N“8“8。“1T，。‘a1．D。18yed。xp”8”4 可由胞质转入胞核激活炎性反应因子表达【8引。本 ====．1=：嚣：=micel)．bra。in嚣afte 实验结果显示，静息小胶质细胞中p65散在分布于 [6】BedanI，B。。hh。ldB，Ham。A，。ta1．Aeeel。ratedgIial 胞质中，照射后细胞质内P65蛋白含量下降，细胞核 reactivitytostrokeinagedratscorrelateswithreducedfunctional P65蛋白含量增加。激光共聚焦更进一步显示，照 recovery·CerebBloodFlowMetab，2003，23(7)：845-854· 射后小胶质细胞内Nemo蛋白表达上调。本组实验 [7]F⋯。““^·Pann”6。’B8ne”8·wd协‘L'科aL V25Izg／mlCorilagin照射前预处理小胶质细胞后， pot。nd二∞mic。glial。eu。。曲ty．Ne。㈣i。2003，23(21)： 照射后细胞内Nemo表达明显降低，激光共聚焦显 7767-7775． 微镜及Western·blot均观察到NF—KBp65核转位被 [8】L6brichM。RiefN，KuhneM，eta1．／nt锄formationandrepair 抑制。 ofDNAdouble5trandbreake吐。。。。。puted佃“ograp“y Corilagin作为天然产物，不良反应小，近年来体，，。”i“鲥”·PN^s’2005·102(25．卜8984-．89■89． 内体外实验发现其在多种实体瘤中发挥显著的抗 。。。ioini。g：。co二pl。。。一altissues．Rad洫o。。。lBiolPhy。， 肿瘤效应，临床应用日趋广泛‘m川。本研究结果表 2008，72(4)：1180．1187． 明，Corilagin可能通过抑制照射后小胶质细胞内[10】uuKC·‰MT，LeeSS·etal，Antiviraltanninsfromtwo Nemo蛋白，进而抑制NF—KB通路的活化。减少炎性phyllaa出”叩”‘“P1In诅Med,1999·65(1)：43-46。 反应因子TNF‰IL-lp及NO的释放，保护神经¨¨=IX二葛hIIAOiIk,。el=== 元，为临床预防减轻放射性脑损伤更为有效、安全Phya谴h。Res,2000。14(2)：371．37·． 的治疗方法提供理论依据。 (收稿日期：∞lo艟棚) 万方数据 Corilagin对小鼠小胶质细胞株照射后炎性反应因子表达的抑 制作用 作者： 罗鸣， 伍钢， 范丽， 张瑞光， 任精华， 董继华， 董晓荣， LUO Ming， WU Gang， FAN Li， ZHANG Rui-guang， REN Jing-hua， DONG Ji-hua， DONG Xiao-rong 作者单位： 罗鸣,伍钢,范丽,张瑞光,任精华,董晓荣,LUO Ming,WU Gang,FAN Li,ZHANG Rui-guang,REN Jing-hua,DONG Xiao-rong(华中科技大学同济医学院附属协和医院肿瘤中心,武汉,430022) ， 董继华,DONG Ji-hua(华中科技大学同济医学院附属协和医院中心实验室) 刊名： 中华放射医学与防护杂志 英文刊名： CHINESE JOURNAL OF RADIOLOGICAL MEDICINE AND PROTECTION 年，卷(期)： 2010,30(6) 参考文献(11条) 1.New P Radiation injury to the nervous system[外文期刊] 2001(06) 2.Monje ME;Toda H;Palmer TD Inflammatory blockades restores adult hippocampal neurogenesis[外文期刊] 2003(5651) 3.Zhao L;Zhang SL;Tao JY Preliminary exploration on anti-inflammatory or mechanism of Corilagin (beta-1 -galloyl-3,6-(R)-hexahydroxydiphenoyl-D-glucose) in vitro 2008(07) 4.Monje ML;Mizumatsu S;Fike JR Irradiation induces neural precursor-cell dysfunction[外文期刊] 2002(09) 5.Yin L;Ohtaki H;Nakamachi T Delayed expressed TNFR1 co-localize with ICAM-1 in astrocyte in mice brain after transient focal ischemia[外文期刊] 2004(01) 6.Badan I;Buchhold B;Hamm A Accelerated glial reactivity to stroke in aged rats correlates with reduced functional recovery 2003(07) 7.Franklin A;Parmentier-Batteur S;Walter L Palmitoylethanolamide increases after focal cerebral ischemia and potentiates microglial cell motility[外文期刊] 2003(21) 8.L(o)brich M;Rief N;Kühne M In vivo formation and repair of DNA double strand breaks after computed tomography examinations 2005(25) 9.Rübe CE;Dong XR;Kthne M DNA double-strand break rejoining in complex normal tissues 2008(04) 10.Liu KC;Lin MT;Lee SS Antiviral tannins from two phyllanthus species[外文期刊] 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