水蛭素对特发性膜性肾病足细胞nephrin的影响_朱芸芸

第 31 卷 第 7 期 2 0 1 3 年 7 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 31 No． 7 Jul． 2 0 1 3 中 华 中 医 药 1635 学 刊 水蛭素对特发性膜性肾病足细胞 nephrin的影响 朱芸芸，陈钦，钟瑜，鲁盈，徐再春，胡岗 (浙江省立同德医院肾病科，浙江 杭州 310012) 摘 要:特发性膜性肾病(idiopathic membranous nephropathy，IMN)是一种以肾小球基底膜(GBM)上皮细胞 下弥漫的免疫复合物沉积，伴 GBM弥漫性增厚为病理特点的原发性肾小球疾病。随着足细胞相关致病抗原的陆 续发现，目前普遍认为 IMN是一种自身免疫性足细胞病，因此，探索足细胞保护途径对于 IMN具有十分重要的意 义。nephrin是由足细胞合成，同时又具有维持足细胞的正常形态和功能的一种跨膜蛋白，其对于稳定足细胞功 能意义重大。目前对于足细胞保护的中西医药物临床上各有利弊，故我们需要寻找是否还存在其他中药能够防 止 IMN nephrin表达下降、保护足细胞功能。水蛭素临床上长期运用与特发性膜性肾病治疗，其作用机制是多途 径的。鉴于 IMN蛋白尿、肾脏损害的最根本机制是足细胞损伤，而水蛭素对 IMN 是否具有稳定 nephrin 表达、保 护足细胞功能却没有更深的研究。进一步深入研究水蛭素是否存在调节 nephrin表达，保护足细胞功能，将为水 蛭素治疗 IMN提供重要的理论和实践依据。 关键词:特发性膜性肾病;水蛭素;足细胞;nephrin 中图分类号:R692 文献标志码:A 文章编号:1673 － 7717(2013)07 － 1635 － 03 Influence of Hirudin on Nephrin of Idiopathic Membranous Nephropathy Podocyte ZHU Yunyun，CHEN Qin，ZHONG Yu，LU Ying，XU Zaichun，HU Gang (Nephrology Department，Zhejiang Provincial Tongde Hospital，Hangzhou 310012，Zhejiang，China) Abstract:Idiopathic membranous nephropathy (IMN)is a form of diffuse in the glomerular basement membrane (GBM)in epithelial cells of immune complex deposition along GBM diffuse thickening of the pathological features of prima- ry Glomerular Disease． Podocyte － related pathogenic antigens have been found and it is now widely believed that IMN is an autoimmune podocyte disease． Therefore，podocyte protection is of important significance for IMN． Nephrin is produced by podocyte，and it also can a transmembrane protein which can maintain normal shape and function of sufficient cells，which meant a lot for stablizing podocyte function． At current，podocyte protection of traditional Chinese and Western medicine has advantages and disadvantages，so we need to find out if there are other Chinese medicines which can prevent degradation in IMN nephrin expression and protect the podocyte function． Application of hirudin on clinical long － term treatment of idio- pathic membranous nephropathy has more ways． Since IMN proteinuria as well as renal impairment is the most fundamental mechanisms of podocyte injury，however whether hirudin has function on stabilizing nephrin expression and protecting the podocyte has not been deeply studied． Further in － depth studies of regulation nephrin expression，protection of podocyte function，and hirudin in treatment of IMN will be given important theoretical and practical basis． Key words:Idiopathic membranous nephropathy;hirudin;podocyte;nephrin 收稿日期:2013 － 02 － 20 基金项目:浙江省医药卫生平台骨干人才(2012RCA012) 作者简介:朱芸芸(1984 －) ，女，浙江杭州人，医师，硕士，研究方 向:中西医结合肾病。 特发性膜性肾病(idiopathic membranous nephropathy， IMN)是一种以肾小球基底膜(GBM)上皮细胞下弥漫的免疫 复合物沉积，伴 GBM弥漫性增厚为病理特点的原发性肾小 球疾病，临床上多以大量蛋白尿为主要表现，部分患者可出 现镜下血尿。IMN是成人肾病综合征的常见类型，糖皮质激 素和大部分免疫抑制剂治疗效果差，约有 40%的患者在 10 年后进入终末期肾衰竭［1］，因此颇受临床或研究关注。 1 特发性膜性肾病是一种足细胞病 随着足细胞相关致病抗原的陆续发现，目前普遍认为 IMN是一种自身免疫性足细胞病［2］。肾小球细胞以足细 胞损伤为主。Beck 等［3］发现足细胞上磷脂酶 A2 受体 (PLA2R)是人类 IMN免疫损伤的靶抗原，针对足细胞自身 抗原产生的自身抗体(主要是 IgG4) ，与相应抗原相结合， 形成抗原抗体复合物，在 GBM上皮侧沉积，继而激活补体 形成膜攻击复合体 C5b － 9，C5b － 9 插入足细胞膜使足细 胞活化，表达成分改变，随着病程发展，足细胞损伤加重，表 现为足细胞凋亡、脱落、细胞周期改变和增生减低等，最终 导致蛋白尿形成和肾组织损伤。因此保护足细胞功能至关 重要。研究发现［4 － 6］，糖皮质激素受体存在于肾小球足细 胞上，糖皮质激素可通过受体和非受体途径，对足细胞损伤 具有一定干预作用;环孢菌素 A也被发现具有稳定足细胞 功能［7］，但大量临床证据表明无论激素或环孢菌素 A 在 IMN治疗效果均不佳［4，8 － 9］，因此，探索足细胞保护途径对 5361 第 31 卷 第 7 期 2 0 1 3 年 7 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 31 No． 7 Jul． 2 0 1 3 中 华 中 医 药 1636 学 刊 于 IMN具有十分重要的意义。 2 足细胞的保护 2． 1 nephrin 蛋白对于稳定足细胞功能的作用 Nephrin 是由足细胞合成，同时又具有维持足细胞的正常形态和功 能的一种跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族，为肾小球滤过 屏障裂孔隔膜的主要成分之一，特异表达在裂孔隔膜上。 nephrin 具有以下功能: (1)维持 SD 结构的完整性; (2)与 足细胞内细胞骨架及紧密连接相关蛋白相互作用，维持足 细胞正常的形态及功能; (3)参与细胞信号转导。近来的 研究显示 nephrin 缺乏可激活 NF － κB 路径导致足细胞损 伤及蛋白尿［10］。在大鼠膜性肾病模型 PHN 中，nephrin mRNA及蛋白表达均下降;在人类 IMN nephrin mRNA表达 下调，nephrin金颗粒在足突消失的部位无表达，而在足突 完整的部位表达量与分布无明显改变［11］。同时有研究表 明:nephrin基因变异可造成严重对激素抵抗型蛋白尿［12］， 由此可知 nephrin对 IMN蛋白尿的产生及肾脏纤维化的进 程起着重要作用。因此，nephrin蛋白对于稳定足细胞功能 意义重大。 2． 2 目前临床用于保护足细胞功能的药物 转基因鼠模 型研究［13］证实，ACEI /ARB 可通过阻断 RAAS，减少 NF － κβ与 DNA的结合，从而防止实验动物 nephrin表达下降，防 止足细胞丢失而减少尿蛋白［14 －15］。近年来他克莫司被用于 IMN的治疗，研究表明其具有保护足细胞，减少蛋白尿功能， 但目前仍处于临床试验阶段［16 －18］。另有学者提出运用基因 质粒技术，达到调节足细胞功能，或直接给予相应蛋白来替 代足细胞所分泌蛋白不足，或通过结合足细胞特定靶点而有 效调节足细胞功能［15］，但这些均仅停留在理论阶段。中药 对此研究主要集中在雷公藤，发现其除了具有免疫抑制作用 外，还有增加 nephrin 的表达对足细胞的损伤起到保护作 用［19 － 22］，但往往因其不良反应而限制了临床的使用。因 此，我们需要寻找是否还存在其它中药，能够防止 IMN nephrin表达下降、保护足细胞功能。 3 水蛭素对于特发性膜性肾病的治疗 肾病综合征中医属“水肿、腰痠”等范畴，以本虚(脾、 肾)标实(水湿、瘀血)为病机特点，其中瘀血是肾小球疾病 过程中最常见的病理因素。现代医学认为，本病由于高脂 血症、凝血因子含量升高、血小板活化、血浆内皮素含量增 高等因素，一般都存在高凝状态及静脉血栓形成的风险，其 中膜性肾病尤其明显，这些病理状态与中医“瘀”的概念是 相吻合，因此活血化瘀法通常贯穿膜性肾病的治疗。水蛭 具有破血、逐瘀、利水、通经的功能，研究发现不论是在辨证 方中应用还是单独使用，均具有降低肾小球疾病蛋白尿、改 善肾功能的作用［23］，因此在极易出现高凝状态并且西医疗 效不佳的膜性肾病中应用广泛［24 － 25］。已有文献证实，水蛭 其主要活性成分水蛭素对于 IMN 蛋白尿的缓解及肾功能 的保护主要通过以下途径实现: (1)水蛭素作为凝血酶特 异性抑制剂，能与血浆中游离的和与纤维蛋白结合的凝血 酶结合，具有抗凝、抗血小板聚集、抑制血栓形成，改善血液 流变学等作用［24］，缓解了凝血系统参与所致的肾脏局部炎 症反应对肾组织的损伤［26］; (2)研究同时发现它对炎性介 质具有拮抗作用，能够降低白介素受体水平，调节免疫功 能［27］，并减少肾小球内纤维蛋白相关抗原沉积，减轻肾小 球系膜细胞增殖和肾小球硬化; (3)水蛭能减轻脂质代谢 紊乱介导的肾脏损伤。我们课题组成员前期通过研究已发 现，水蛭素可显著抑制氧化低密度脂蛋白诱导活化的巨噬 细胞导致的系膜细胞 TGF － β 和 FN mRNA 表达上调。但 鉴于 IMN蛋白尿、肾脏损害的最根本机制是足细胞损伤， 而水蛭素对 IMN 是否具有稳定 nephrin 表达、保护足细胞 功能却没有更深的研究。 4 结 语 水蛭素对于特发性膜性肾病的临床疗效是肯定的，其 疗效机制是多途径的。进一步深入研究水蛭素是否存在调 节 Nephrin表达，保护足细胞功能，将为水蛭素治疗 IMN提 供重要的理论和实践依据。 参考文献 ［1］ Glassock RJ． Diagnosis and natural course of membranous ne- phropathy［J］． Semin Nephrol，2003，23(4) :324 － 332． ［2］ Glassock RJ． The pathogenesis of idiopathic membranous Ne- phropathy:a 50 year odyssey［J］． Am J Kidney Dis，2010，56 (1) :157 － 167． ［3］ Beck LH Jr，Bonegio RG，Lambeau G，et al． M － type phospho- lipase A2 receptor as target antigen in idiopathic membranous nephropathy［J］． N Engl J Med，2009，361(1) :11 － 21． ［4］ 李春庆，孙伟．足细胞病的分类及中西医治疗进展［J］． 中国 中西医结合肾病杂志，2010，11(7) :647 － 649． ［5］ Ransom RF，Lam NG，Hallett MA，et al． Glucocorticoids protect and enhance recovery of cultured murine podocytes via actin fila- ment stabilization［J］． Kidney Int，2005，68(6):2473 －2483． ［6］ Wada T，Pippin JW，Marshall CB，et al． Dexamethasone pre- vents podocyte apoptosis induced by puromycin aminonucleo- side:role of p53 and Bcl － 2 － related family proteins［J］． Am Soc Nephrol，2005，16(9) :2615 － 2625． ［7］ Faul C，Donnelly M，Merscher － Gomez S，et al． The actin cy- toskeleton of kidney podocytes is a direct target of the antipro- teinuric effect of cyclosporine A［J］． Nat Med，2008，14(9) : 931 － 938． ［8］ Schieppati A，Perna A，Zamora J，et al． Immunosuppressive treat- ment for idiopathic membranous nephropathy in adults with ne- phrotic syndrome［J］． Cochrane Database Syst Rev，2004，18 (4) :CD004293． ［9］ Goumenos DS，Katopodis KP，Passadakis P，et al． Corticosteroids and ciclosporin A in idiopathic membranous nephropathy:higher remission rates of nephrotic syndrome and less adverse reactions than after traditional treatment with cytotoxic drugs［J］． Am J Nephrol，2007，27(3) :226 － 231． ［10］ Sheerin N S． A novel role for nephrin in the maintenance of glo- merular structure［J］． J Am Soc Nephrol，2009，20(8) :1661 － 1663． ［11］ Kim BK，Hong HK，Kim JH，et al． Differential expression of nephrin in acquired human proteinuric diseases［J］． Am J Kid- ney Dis，2002，40(5) :964 － 973． ［12］ Kitamura A ，Tsukaguchi H ，Iijima K，et al． Genetics and clin- ical features of 15 Asian families with steroid － resistant nephrit- ic syndrome［J］． Nephrol Dial Transplant，2006，21(11) :3133 － 3138． 6361 收稿日期:2013 － 02 － 25 基金项目:辽宁省科学事业研究公益基金资助项目(2012006005) ; 沈阳市科学技术计划项目(F11 － 241 － 00，F12 － 264 － 4 － 01) 作者简介:刘豪华(1987 －) ，女，山东人，2010 级硕士研究生，研究 方向:中药活性成分研究及新药开发。 通讯作者:张东方(1975 －) ，男，辽宁人，教授，博士，研究方向:中 药活性成分研究及新药开发。E-mail:dfzhang@ mail． cmu． edu． cn。 ［13］ Hoffmann S，Podlich D，H hnel B，Angiotensin Ⅱ type 1 re- ceptor overexpression in podocytes induces glomerulosclersis in transgenic rats［J］． Am Soc Nephrol，2004，15(6) :1475 － 1487． ［14］ Reiser J，Mundel P． Dual effects of RAS blockade on blood pressure and podocyte function［J］． Curr Hypertens Rep，2007， 9:403 － 408． ［15］ Jochen R，Vineet G，Andreas D． Toward the development of podocyte specific drugs［J］． Kidney Int，2010，77:662 － 668． ［16］ Praga M，Barrio V，Ju rez GF，et al． Tacrolimus monotherapy in membranous nephropathy:a randomized controlled trial［J］． Kidney Int，2007，71(9) :924 － 930． ［17］ Chen M，Li H，Li XY，et al． Tacrolimus combined with cortico- steroids in treatment of nephrotic idiopathic membranous ne- phropathy:a multicenter randomized controlled trial［J］． Kidney Int，2010，339(3) :233 － 238． ［18］ Wetzels JF． Tacrolimus in membranous nephropathy［J］． Kidney Int，2008，73(2) :238． ［19］ 秦卫松，刘志红，曾彩虹，等．雷公藤甲素对 Heymann肾炎模 型足细胞病变的影响［J］．肾脏病与透析肾移植杂志，2007， 16(2) :101 － 109． ［20］ 郑春霞，刘志红，孙吉平，等，雷公藤甲素对嘌呤霉素模型足 细胞病变的影响［J］． 肾脏病与透析肾移植杂志，2007，16 (2) :110 － 118． ［21］ 陈朝红，刘志红，洪亦眉，等． 雷公藤甲素干预 C5b － 9 诱导 足细胞损伤的体外研究［J］． 肾脏病与透析肾移植杂志， 2009，18(4) :310 － 317． ［22］ 徐新鹏，洪郁芝，叶迅．雷公藤内酯醇干预高糖影响小鼠肾 脏足细胞 Nephrin蛋白表达的研究［J］． 中国中西医结合肾 病杂志，2010，10(11) :872 － 874． ［23］ 危成筠．水蛭及水蛭素在肾脏病中的应用及研究进展［J］． 中国中医药科技，2001，8(2) :136 － 137． ［24］ 李开龙，柯娅妮，张建国，等，水蛭素治疗特发性膜性肾病的回 顾性［J］．中国中西医结合肾病杂志，2007，8(7):417 －418． ［25］ 杨宁宁，刘俊，苏兰．水蛭治疗肾病综合征的药理学研究及 临床应用［J］．华西医学，2000，15(3) :388． ［26］ 董柯，陈香美，汤力，等，水蛭对系膜增殖性肾炎蛋白尿、脂质代 谢及凝血机制的影响［J］．中华内科杂志，1995，34(4):250． ［27］ 林建明，程世平，刘加林，等，水蛭对狼疮性肾炎患者血浆内 皮素和可溶性白介素 － 2 受体的影响［J］． 疑难病杂志， 2009，8(9) :535 － 537． 第 31 卷 第 7 期 2 0 1 3 年 7 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 31 No． 7 Jul． 2 0 1 3 中 华 中 医 药 1637 学 刊 鸡眼草的生药学研究 刘豪华1，胡春萍2，许莉3，程韵菲1，靳鑫1，祝峥1，崔泽实1，张东方1 (1．中国医科大学药学院生药学教研室，辽宁 沈阳 110001;2．鞍山生物有限公司，辽宁 鞍山 114000; 3．辽宁省中药研究所，辽宁 沈阳 110041) 摘 要:目的:建立民间用药鸡眼草的质量评价方法。方法:采用性状鉴别和叶、茎横切面及粉末的显微 鉴别方法鉴别鸡眼草，采用高效液相色谱法测定其中的山柰酚，色谱柱:C18(4． 6 mm × 150 mm，5 μm) ;流动相: 甲醇 － 0． 1%磷酸(63 ∶ 37) ;波长:370 nm。结果:在叶、茎横切面显微图可见乳汁管和韧皮纤维束。在粉末 显微图中，可见非腺毛、晶纤维束等。采用 HPLC法测定鸡眼草中山柰酚的含量，稳定性良好，精密度良好，重复 性良好，加样回收率良好，每 1 g鸡眼草中山柰酚含量为 0． 046 ～ 0． 049 mg。结论:鸡眼草的药材性状、显微鉴别 特征明显，对该生药鉴别具有重要意义。HPLC法可用于测定鸡眼草中山柰酚的含量。 关键词:鸡眼草;显微鉴别;山柰酚;含量测定 中图分类号:R284． 1 文献标志码:A 文章编号:1673 － 7717(2013)07 － 1637 － 03 Pharmacognosy Research on Herba Kummerowiae LIU Haohua1，HU Chunping2，Xu Li3，CHENG Yunfei1，JIN Xin1，ZHU Zheng1，CUI Zeshi1，ZHANG Dongfang1 (1． School of Pharmaceutical Science ，China Medical University，Shenyang 110001，Liaoning，China; 2． Anshan Biological Engineering Company Limited，Anshan 114000，Liaoning，China; 3． Liaoning Institute of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110041，Liaoning，China) Abstract:Objective:To set up a method of quality control of Herba Kummerowiae． Methods:Character identification 7361